1、    局灶腦缺血再灌流后ICAM-1表達與白細胞浸潤        摘要：目的探討大鼠局灶性腦缺血再灌流后細胞間粘附分子-1(ICAM-1)表達規律與白細胞浸潤。方法采用大鼠MCA線栓閉塞/再通法建立局灶性缺血/再灌流模型，動態觀察ICAM-1、髓過氧化物酶(MPO)變化情況。結果(1)鼠腦缺血/再灌流后MCA供血區皮質及梗死周邊區的微血管ICAM-1表達于再灌流6h已增強，3648h達高峰，以后逐漸減弱，但第7天表達仍強于假手術組。(2)壞死周邊區神經元也表達ICAM-1

2、。(3)再灌流6h出現白細胞浸潤，浸潤高峰在2436h,6d后恢復正常。結論(1)缺血再灌流使微血管表達ICAM-1上調，同時也伴隨壞死周邊區的神經元表達ICAM-1。(2)白細胞浸潤與ICAM-1表達規律同步。關鍵詞：腦缺血;再灌流;白細胞;細胞間粘附分子-1分類號：R743文獻標識碼：A文章編號：1003-2754(2000)01-0005-03The temporal profiles of ICAM-1 expression and leukocytes infiltration after focal cerebral ischemia/reperfusionWU ShanDONG

3、Wei-weiDONG You-zhong. (Department of Neurology,The Affiliated Hospital,Guiyang Medical College,Guiyang 550001,China)Abstract：ObjectiveTo study the temproal course of expression of ICAM-1 protein and the feature of neutrophils infiltration in rat brain after MCA occlusion/reperfusion. MethodsThe ani

4、mal models of the MCA ischemia/reperfusion was established in Wistar rats. The expression of ICAM-1 was measured by immunohistochemistry and the neurtrophil infiltration was determined by the evaluation of MPO. Results(1)ICAM-1 immunoractivity was enhanced in microvessels in the ischemic lesion at 6

5、h after reperfusion,reached the peak at 3648h,and then decreased gradually,but at the 7th day,upregulation of ICAM-1 expression still existed. (2)Neurons also expressed ICAM-1 at the border of infarct. (3)MPO activity rose at 6h,reached the peak at 2436h and then returned to near normal level at 6d.

6、 Conclusion(1)Up-regulation of ICAM-1 in microvessel occured after ischemia/reperfusion,it also existed in neurons at the border of infarct. (2)The feature of neutrophils infiltration in ischemic region had the similar regularity to expression of ICAM-1.Key words：Cerebral ischemia;Reperfusion;Leukoc

7、ytes;ICAM-1在對缺血性腦梗死的治療中，盡早疏通阻塞血管，恢復缺血組織的血液供應是主要措施之一。然而血管再通也會帶來一些負性效應，局灶性或全腦缺血模型發現再灌流后一段時間內梗死周邊區血流量下降，這種發生于再灌流后的低灌注與微循環障礙有關1，白細胞聚集浸潤導致缺血后的炎癥反應是主要因素之一2。實驗證實大腦中動脈(MCA)閉塞再灌流后約8%的腦微血管完全或部分為多型核白細胞(PMNLs)所阻塞，這些血管恰好位于MCA分布的低灌注區3。白細胞從血管進入組織必須通過血與腦之間的屏障，即血管內皮細胞。內皮細胞在腦缺血再灌流后激活，表達多種粘附分子，促使白細胞的粘附及經內皮向組織的移行，其中細胞間

8、粘附分子-1(ICAM-1)是較關鍵的粘附分子。ICAM-1與白細胞整合素CD11/CD18相互作用，使白細胞牢固結合于血管內皮，從而促進了炎癥反應，導致再灌流損害。本文為研究腦缺血再灌流后ICAM-1表達規律與白細胞浸潤進行了以下工作。1材料與方法1.1實驗動物及分組健康Wistar大鼠，雌雄各半，體重250300g,分為假手術組及缺血90min再灌注6h、12h、18h、24h、36h、2d、3d、4d、5d、6d、7d組，每組5只。1.2大鼠MCA閉塞/再灌流模型的建立參照Longa4報道的頸外動脈插入線栓法。動物清醒后具備同側Horner氏征，提尾時對側前肢屈曲內收者方列為研究對象。本

9、實驗均做左側MCA阻塞。1.3腦組織含水量測定取新鮮腦組織稱重后，于105烤干至恒重，再次稱重，含水量(H2O%)=(1-干重/濕重)×100%。1.4缺血腦組織髓過氧化物酶(MPO)活性測定采用Matsu2的方法MPO活力(U/g)=A/11.3×所加腦組織量/反應液量(ml) 1.5ICAM-1的免疫組化染色S-P法按Kit說明操作。對免疫組化染色結果進行像分析處理，結果以半定量指標面密度表示。1.6統計學處理采用Oxstat-程序進行統計處理，兩組間比較采用t檢驗，所有結果以±s表示。2結果2.1腦缺血/再灌流后MCA供血區的ICAM-1表達規律ICAM-1

10、在正常組鼠及假手術組鼠大腦皮質微血管呈低表達，缺血90min再灌流6h可見缺血側MCA供血區域的皮質及壞死周邊區微血管ICAM-1表達增強，再灌流后2448h達高峰(見1)，以后逐漸下降，至第7天表達仍強于假手術組(見表1)。健側半球微血管ICAM-1表達增強不明顯。同時還觀察到，梗死周邊區的神經元ICMA-1表達也呈陽性(見2)。1缺血90min再灌流36h大鼠腦組織免疫組化染色(×200),可見大量微血管內皮細胞ICAM-1表達陽性，而且ICAM-1位于內皮細胞膜上2梗死周邊神經元ICMA-1表達陽性(×200),ICAM-1表達也位于細胞膜上2.2大鼠腦缺血/再灌流后

11、缺血區域MPO活性的變化為了觀察腦缺血后PMNLs在缺血區域的浸潤，我們對該區域的MPO活性進行了測定，作為PMNLs浸潤指標。研究發現，缺血90min再灌流6h后，MPO活性就增強到0.027±0.011，與假手術組(0.010±0.014)相比是其兩倍的量。白細胞浸潤在2436h達高峰，以后逐漸回落，至第7天基本達到正常(見表1)。3討論腦缺血再灌流后微血管內皮ICAM-1表達增強已被許多實驗證實。在缺血60min再灌流模型中，Matsuo3(1994)發現，ICAM-1表達上調于再灌流后3h出現，24h表達仍上調。Zhang5(1995)則證明缺血2h ICMA-1表

12、達增加出現于再灌流后2h，46h達到峰值，整個上調過程可持續1周。 在本實驗，MCA缺血90min再灌流6h后，患側MCA供血區的皮質及梗死周邊區的微血管表達ICAM-1增加，2448h達到高峰，上調過程也持續1周以上。臨床研究發現，卒中后的612h內已有白細胞浸潤，其數量在病變區域的減少出現于發病后的69天。白細胞浸潤程度與預后密切相關。輕度白細胞浸潤者腦梗死體積小，神經功能恢復好；而重度白細胞浸潤者梗死體積大，預后差2。我們在實驗中也觀察到，白細胞浸潤于再灌流6h已發生，MPO活性比假手術組增加了1倍多，浸潤的高峰在2436h，與ICAM-1表達高峰同步。組織的缺血導致白細胞被激活，表達整

13、合素CD11/CD18與內皮細胞上的配體ICAM-1作用， 牢固地附著其上，對微血管產生機械阻塞和細胞毒作用，成為再灌流后微血管循環障礙的主要因素。動物實驗表明，抑制白細胞附著可改善缺血再灌流后缺血區域的血液供應。Mori3(1992)通過計算機電視成像系統發現，MCA缺血3h后再灌流1h，基底節區直徑小于30m的微血管中毛細血管再通率只有51%，毛細血管前動脈和毛細血管后靜脈僅39%開放，缺血前應用CD18抗體阻斷白細胞粘附，則血管再通達到70%以上，以毛細血管后靜脈的改善尤為明顯。最近Ligo6(1997)通過共聚焦顯微鏡活體觀察到ICAM-1在大鼠腸系膜血管及微血管的分布，發現ICAM-

14、1在毛細血管后靜脈的量最大，而在毛細血管及毛細血管前動脈的量分別僅占前者的1/10，注射ICAM-1抗體1A29，白細胞粘附明顯受抑。可以看出，白細胞CD11/CD18整合素與內皮細胞ICAM-1之間的相互作用是再灌流后白細胞浸潤的主要促進因素，白細胞導致的微血管阻塞以毛細血管后靜脈最為嚴重。表1大鼠缺血/再灌流病變半球ICAM-1表達及MPO活性變化組別只數ICAM-1(面密度)MPO(U/g)假手術組50.39±0.200.010±0.014缺血90min再灌流6h組50.68±0.470.027±0.011*缺血90min再灌流12h組51.45&

15、#177;0.22*0.124±0.044*缺血90min再灌流18h組51.49±0.24*0.215±0.063*缺血90min再灌流24h組51.79±0.27*0.266±0.056*缺血90min再灌流36h組52.52±0.40*0.280±0.022*缺血90min再灌流48h組52.27±0.87*0.221±0.039*缺血90min再灌流3d組51.52±0.39*0.190±0.021*缺血90min再灌流4d組51.49±0.49*0.137±

16、;0.031*缺血90min再灌流5d組51.07±0.81*0.091±0.025*缺血90min再灌流6d組51.05±0.46*0.038±0.020*缺血90min再灌流7d組50.96±0.23*0.015±0.016與假手術組比較*P<0.05,*P<0.01ICAM-1雖然主要表達于微血管內皮，但壞死周邊區的神經元上也發現ICAM-1的存在，而在其它區域神經元極少表達ICMA-1。Birdsall7(1991)通過體外培養皮層神經元證實，在細胞因子TNF-、-干擾素、IL-1作用下，神經元表達ICAM-1，使

17、白細胞能粘附其上，而無細胞因子作用的神經元則不與白細胞粘附。我們認為，在腦缺血再灌流后，缺血區域組織及浸潤白細胞均可能大量生成炎性細胞因子，刺激半暗帶神經元表達ICAM-1，促進白細胞的粘附，進而加強了白細胞的破壞作用，使梗死擴大。總之，從本實驗研究結果可以看出，腦缺血再灌流后微血管內皮的ICAM-1蛋白表達具有一定的規律性,再灌流6h表達上調,2448h達高峰,整個過程持續1周。而白細胞浸潤的發展規律與之類似。ICAM-1的蛋白表達還出現于壞死周邊區的神經元，這可能對腦梗死的發展起促進作用。 (本文編校程門雪)作者單位：吳珊(貴陽醫學院附屬醫院神經科，貴州,貴陽,550001)董為偉(重慶醫

18、科大學神經病學研究所，重慶,400016)董佑忠(貴陽醫學院附屬醫院神經科，貴州,貴陽,550001)參考文獻：1Hallenbeck JM,Dutka AJ. Background review and current concepts of reperfusion injuryJ. Arch Neurol,1990,47：1245-1254.2Akopov SE,Simonian NA,Grigorian GS. Dynamics of polymorphonuclear leukocyte accumulation in acute cerebral in farction and their correlation with brain tissue damageJ. Stroke,1996,27：1739-1743.3Matsuo Y,Onodera H,Shiga Y,et al. Role of cell adhesion molecules in brain injury after transient middle cerebral artery occlusion in the ratJ. Brain Res,1994,656：344-352.4Longa