1、    哮喘豚鼠氣道重構(gòu)中基質(zhì)金屬蛋白酶(1)    】 目的： 探討哮喘豚鼠模型中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及其組織抑制因子(TIMP)在哮喘氣道重構(gòu)發(fā)病中的作用. 方法： 重復霧化吸人卵蛋白建立豚鼠哮喘氣道重構(gòu)模型. 實驗分為對照組、哮喘激發(fā)4, 6 和8 wk組. 免疫組化方法結(jié)合顯微圖像分析檢測MMP9, TIMP1的表達. 半定量PCR檢測MMP9及TIMP1mRNA水平. 結(jié)果： 哮喘各組動物均出現(xiàn)管壁增厚、平滑肌增生等氣道重構(gòu)的特征性改變. 哮喘豚鼠MMP9的mRNA表達：哮喘4 wk組為（0.52&

2、#177;0.05），哮喘6 wk組為（0.74±0.05）；哮喘8 wk組為（0.48±0.04）；對照組為（0.21±0.04）；哮喘各組與對照組組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05). 哮喘豚鼠TIMP1的mRNA水平： 哮喘4 wk組為（0.36±0.04）；哮喘6 wk組為（0.83±0.05）；哮喘8 wk組為（0.97±0.05）；對照組為（0.20±0.02）；哮喘各組與對照組組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）. 免疫組化的結(jié)果和RTPCR的結(jié)果一致. 在哮喘各時段組中，MMP9的表達增高

3、自第4 wk時明顯變緩，而TIMP1仍持續(xù)增高，導致MMP9/ TIMP1比例下降. 結(jié)論： 哮喘的氣道重構(gòu)與MMP9 和TIMP1的表達密切相關，而二者的比例可能反映氣道重構(gòu)的嚴重程度.【關鍵詞】 哮喘；氣道重構(gòu)；明膠酶B；金屬蛋白酶1組織抑制劑    氣道重構(gòu)是氣道反復炎癥損傷與修復的結(jié)果，是造成哮喘患者不可逆氣道阻塞的病理生理基礎，主表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）的沉積、基底膜增厚、氣道平滑肌增生和肥厚等改變. 其中ECM在氣道壁沉積過多是引起氣道壁纖維化和氣流阻塞的主原因之一1. 正常ECM的合成與降解處于

4、一個動態(tài)平衡之中，基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases, MMP9)與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子1（tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP1）平衡是維持ECM內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的決定因素2. 本實驗通過復制豚鼠哮喘模型,利用免疫組化和RTPCR方法測量不同階段哮喘豚鼠模型肺中MMP9及TIMP1含量變化,并了解MMPs/TIMP在哮喘發(fā)病中的作用.1材料和方法    1.1材料卵蛋白、結(jié)合生物素的羊抗兔IgG血清、ABC復合物均購自美國Sigma公司；兔抗TIMP1抗體、兔抗MMP9抗體

5、購自武漢博士德公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；Taq酶購自日本Promega公司；MMP9和TIMP1上下游引物由北京奧科公司合成；402型超聲霧化吸入器購自上海合力醫(yī)療器械廠；PTC100型PCR儀為美國BioRab公司產(chǎn)品；雄性豚鼠32只，體質(zhì)量200250 g，由第四軍醫(yī)大學試驗動物中心提供.    1.2方法     1.2.1動物分組及模型制備實驗動物隨機分為對照組和哮喘4， 6和8 wk組，每組8只. 各哮喘組于第1日腹腔注射卵蛋白(含等量氫氧化鋁凝膠)0.1 mg，1 wk后霧

6、化吸人10 g/L濃度的卵蛋白溶液激發(fā)哮喘，隔日1次，每次20 min，根據(jù)分組分別激發(fā)4，6和8 wk. 第1次激發(fā)后豚鼠即開始喘息，表現(xiàn)為呼吸加深加快，肋間隙凹陷，哮喘發(fā)作嚴重者可出現(xiàn)窒息；喘息后即將動物移出瓶外，喘息可持續(xù)30 min，甚至更長；對照組同樣于第1日腹腔注射生理鹽水0.9 mg，1 wk后將動物置于半封閉玻璃罩內(nèi)霧化吸人生理鹽水約20 min，隔日1次，霧化吸入生理鹽水8 wk.    122動物模型肺組織取材、固定、切片各組模型于末次激發(fā)48 h后以戊巴比妥鈉腹腔注射（40 mg/kg）麻醉豚鼠，開胸留取豚鼠左肺置于液氮中速凍，-7

7、0保存?zhèn)溆?，?jīng)肺動脈灌注100 mL生理鹽水,繼以新配制的40 g/L多聚甲醛PBs（0.1 mol/L，pH 7.4）600 mL持續(xù)灌注90 min,并將右肺取下后固定24 h,入200 g/L蔗糖 含氟PB溶液中，4過夜至標本下沉，OCT包埋，恒冷箱切片機連續(xù)切片（厚15 m），-20保存?zhèn)溆?    123免疫組化染色肺組織切片貼于載玻片上,室溫干燥30 min后,以0.01 mol/L KPBS(pH 7.4)浸洗,經(jīng)800 mL/L甲醇 30 mL/L H2O2封閉15 min，KPBS浸洗3次×10 min,切片入兔抗MMP9血清

8、(1100)室溫孵育24 h. KPBS浸洗3次×10 min，入結(jié)合生物素的羊抗兔IgG血清(1500),室溫孵育2 h，KPBS浸洗3次×10 min,入ABC復合物(1500)室溫孵育2 h，葡萄糖氧化酶DAB硫酸鎳胺法顯色. 顯色反應終止后，常規(guī)脫水,中性樹膠封片. 同樣方法利用兔抗TIMP1染色切片. 每張切片在顯微鏡下隨機選取5個支氣管，以棕黃色顆粒在胞質(zhì)的沉積為陽性. 圖像分析各支氣管細胞染色的平均密度以代表MMP9, TIMP1的表達強度.          

9、  作者：王光輝，金發(fā)光，楚東嶺，段麗【關鍵詞】哮喘；氣道重構(gòu)；明膠酶B；金屬蛋白酶1組織抑制劑【Abstract】 AIM:To i         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡上收集整理餅投稿至本站的，論文版權屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權益，請聯(lián)系我們。        124MP9及TIMP1半定量PCR用Trizol試劑提取備用肺組

10、織總RNA；合成cDNA；半定量PCR反應體系：Taq酶33.34 nkat， Buffer 2 L，dNTP (10 mol/L)1 L，MMP9上游引物(5AAGGATGGTCTACTGGCACA3)10 mol/L， 05 L，MMP9下游引物(5GAAGATGAATGGAAATACGC3, 10 mol/L，）0.5 L，模板1 L，總反應體積20 L. 反應條件：94 1 min；56 45 s；72 1 min，35個循環(huán). TIMP1引物：上游5ACAGCTTTCTGCAACTCG3，下游5CTATAGGTCTTTACGAAGGCC3，PCR產(chǎn)物長度為364 bp；條件：98，變

11、性10 min，然后再94變性1 min，61 退火50 s，72 延伸1 min，共35個循環(huán)，最后，72延伸10 min. PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后采用凝膠成像分析系統(tǒng)讀取其灰度值.     統(tǒng)計學處理： 各組間數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，采用ONEWAY ANOVA分析，組間兩兩比較采用SNKq檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義.     2結(jié)果    2.1哮喘動物模型的制作本實驗中對照組豚鼠每次霧化吸人生理鹽水均

12、未見動物發(fā)生哮喘；各哮喘組第1次霧化吸人卵蛋白溶液可見哮喘發(fā)作，約激發(fā)3次可見明顯哮喘發(fā)作，哮喘發(fā)作重者甚至可窒息致死.    2.2組織病理學改變各組豚鼠肺組織冰凍切片光鏡下見：哮喘各組細支氣管上皮變性，細胞脫落，支氣管黏膜皺襞增多，肺泡隔增厚明顯，并隨著激發(fā)時間的增長逐漸增厚，在哮喘8 wk組表現(xiàn)最為明顯. 對照組豚鼠肺組織支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)正常(圖1).    2.3MMP9及TIMP1在豚鼠模型肺組織的表達結(jié)果顯示，哮喘各組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中MMP9的表達6 wk組高于4

13、 wk組和8 wk組(P<0.05)，4 wk組和8 wk組相比差異無統(tǒng)計學意義 (P>0.05). 在TIMP1的表達中，8 wk組均高于6 wk組和4 wk組(P<0.01)，6 wk組則高于4 wk組(P<0.01)，而MMP9/TIMP1則隨著哮喘激發(fā)時間的加長也明顯下降（表1）.     2.4豚鼠模型肺組織中MMP9和TIMP1 mRNA的表達水平由表2可見，MMP9的表達哮喘各組均高于正常對照組(P<0.01)，6 wk組高于4 wk組和8 wk組(P<0.01)，4 wk組和8 wk組相比差異無統(tǒng)計學意

14、義 (P>0.05). 在TIMP1的表達中，哮喘各組高于對照組(P<0.01)，8 wk組高于6 wk 組和 4 wk組(P<0.05)，6 wk組則高于4 wk組(P<0.01).    A：對照組；B：激發(fā)4 wk組；C：激發(fā)6 wk組； D：激發(fā)8 wk組. 圖1各組豚鼠氣道的HE染色結(jié)果×200表1各組豚鼠支氣管MMP9, TIMP1免疫組化結(jié)果及MMP9/TIMP1比值變化(n=8, x±s)表2各組豚鼠支氣管MMP9, TIMP1 mRNA表達及MMP9/TIMP1比值變化(n=8, x±

15、;s)    3討論    長期以來，人們認為氣道重建的發(fā)生是在慢性炎癥基礎上逐漸進展的3. MMPs是調(diào)節(jié)ECM 代謝的主限速酶,并在組織細胞的分化、維持正常組織結(jié)構(gòu)、細胞信號轉(zhuǎn)導、血管形成、創(chuàng)傷的愈合、炎癥反應等多種生理病理過程中發(fā)揮重作用. 所有的MMPs中，MMP9和哮喘關系最密切4. MMP9能降解多種ECM成分，TIMP1是 MMP9的特異性抑制劑. 在健康個體，MMP9和TIMP1以11的比例共同釋放. 而在哮喘發(fā)作時痰液中測得MMP9/ TIMP1比值增高5，表明在哮喘氣道重構(gòu)過程中，MMPs/TI

16、MP表達失衡可能起到更為重作用. 本實驗觀察發(fā)現(xiàn)，各哮喘組均存在氣道重建，并且隨著激發(fā)時間加長，豚鼠支氣管平滑肌厚度增厚，氣道重建的表現(xiàn)更加明顯. 哮喘發(fā)作時，MMP9升高，降解ECM，有利于炎癥細胞遷移至炎癥部分，同時MMP9降解的基質(zhì)片斷具有對炎癥細胞的趨化作用，促進炎癥的進一步發(fā)展；當MMP9過度表達的同時，TIMP1也隨之升高以具有抑制MMP9的作用，并抑制ECM 的降解，而TIMP1的相對于MMP9的過度升高，最終導致MMPs/ TIMPs 比例平衡失調(diào),細胞外基質(zhì)代謝紊亂,促進氣道重建的發(fā)生和發(fā)展. 而在這個過程中，MMP9和TIMP1之間變化決定氣道重建的具體過程. MMP9/T

17、IMP1比例可以作為一種顯示哮喘氣道組織破壞和修復之間平衡的標志6. 目前的研究結(jié)合本試驗的結(jié)果，都證實該聯(lián)系的存在. 由此可見，MMP9及TIMP1在不同時期的過度表達以及二者表達的比例失衡，是支氣管哮喘氣道炎癥與重構(gòu)的重機制之一，過度的MMPs表達與ECM 的降解有關，而TIMPs的過度上調(diào)，可能導致組織的異常修復. 本實驗結(jié)果提示采取措施抑制MMP9的過度表達，調(diào)節(jié)MMP9/TIMP1的平衡是防治哮喘氣道重構(gòu)的新策略.    【參考文獻】    1 Corbel M, Belleguic C, Boichot

18、 E, et al. Involvement of gelatinases (MMP2 and MMP9) in the development of airway inflammation and pulmonary fibrosisJ.Cell Biol Toxicol, 2002,18（1）: 51-61.    2鄧立力，邵玉霞，楊敏. 地塞米松對哮喘大鼠氣道重塑及基質(zhì)金屬蛋白酶9表達的影響J.哈爾濱醫(yī)科大學學報，2004，38（2）：61-64.    3 Holgate ST, PetersGolden M, Jpanettieri RA, et al. Roles of cysteinyl leukotrienes in airway inflammation, smooth muscle function, and remodelingJ. J Allergy Clin Immunol, 2003, 111（1 Suppl）:S18-S34.