1、轉基因抗蟲棉的遺傳轉化與功能驗證一、農桿菌介導的棉花胚胎再生遺傳轉化體系（一）實驗方法以W0為受體，將pC2-dsGFP、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH3、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP載體的農桿菌菌株，運用農桿菌介導法分別將目的基因轉入棉花下胚軸，通過組織培養技術獲得轉基因再生株系。嫁接試驗采用根系發達抗病性強的海島棉（海7124）的實生苗做砧木，接穗是轉化基因再生植株。（二）實驗步驟農桿菌介導的棉花遺傳轉化分3步，轉化、胚胎發生和植株再生。1） 種子脫絨：軋花后的棉花種子，烘干（40左右），用適當硫酸（H2SO4）脫去短絨，自來水洗掉種子表面濃硫酸，充分晾干；

2、2） 種子的消毒處理：選取飽滿棉花種子于無菌三角瓶中，無菌水沖洗一次，70%乙醇表面消毒種子30 Sec，棄去乙醇，加入30%過氧化氫（H2O2）于搖床振蕩2-3 h，棄掉H2O2，無菌水沖洗種子3-5 次，保留少量無菌水浸過種子，存放28，18-24 h，待到種子破殼露白；3） 外植體制備：在無菌條件下，濾掉消毒過種子的無菌水，剝去種子種殼，接種于苗培養基（1/2MS）上， 28 黑暗培養（N）3 d，然后在28、3000-5000 Lx光照下培養 (D/N16 h/8 h) 3 d。4） 農桿菌活化與浸染液制備：將-70保存的農桿菌載體菌株，取出凍融。在固體LB平板培養基上（含Kan 50

3、g/mlRif/Str 50g/ml）劃線，28靜止培養1-2天。平板挑取單菌落，接種于含相應抗生素的LB液體（Kan 50g/mlRif/Str 50g/ml）培養基（10ml）中，28振蕩過夜，再按1%接種量轉接入50mL新鮮培養基中（含Kan 50g/mlRif/Str 50g/ml）培養8小時左右，測定OD600為0.5左右。4，5000rpm離心5min ，收集菌體。然后用5mLMSB0（含100 uM/ml AS）液體培養基重新懸浮沉淀，再轉入15-45mL的 MSB0（含100uM AS）液體培養基，28搖床上培養至OD600為0.5左右，稀釋培養液OD600 值0.3-0.7

4、時備用。5） 浸染與共培養：在超凈臺上使用手術刀切割莖段7cm左右，將下胚軸莖段浸泡于農桿菌侵染液中5-8 min，用滅菌濾紙吸干胚軸段菌液，放在鋪有一層滅菌濾紙的共培養培養基上，用封口膜封口，2225共培養2d。6） 下胚軸切段兩端切口長出的愈傷組織直徑大約0.5-1.0 cm時切下來單獨繼代，愈傷組織塊的直徑大約2 cm時轉移到胚性愈傷組織誘導培養基上。7） 轉化組織從1個或幾個細胞開始分裂，3-4個月即有蠶豆大小（直徑2 cm左右）。8） 愈傷在MSB上長到直徑2cm左右，接種到MSB2誘導胚性愈傷，在MSB2上繼代1-3次即會有胚性愈傷的出現。9） 待愈傷組織長到直徑約2-3cm 時，

5、將其從胚軸段切除，愈傷組織塊轉入相同的培養基增殖，可以有效的去除農桿菌和防止愈傷組織褐化現象。10） 當愈傷組織塊直徑達到7-8 mm 放入胚性愈傷誘導培養基中，在培養間常規條件下培養，每隔一個月左右轉一次相同的培養基，2-6 次，到出現黃綠色或灰綠色，米粒狀的胚性愈傷為止。11） 只要疑似分化就挑出來少許，分散繼代到分化培養基上，在分化培養基上能生存的一般是胚性愈傷組織，而非胚性愈傷在分化培養基大多不能存活。12） 由胚性愈傷再生植株經歷體細胞胚的形成、成熟、萌發和小植株的生長。經過10天左右的抗性胚篩選，將成活的胚性愈傷挑到瓶口包棉塞、使用透氣瓶塞培養瓶里培養，促進胚狀體的形成和萌發。13

6、） 將萌發的小植株平鋪接種到鋪濾紙的培養基上，誘導成苗。小植株再轉入大的三角瓶中（培養基同愈傷組織增值配方），無菌條件下取小植株23 片葉，小量法提取DNA，進行標記基因和目的基因的PCR 擴增，將陽性小植株嫁接溫室。14） 在裝有營養土的土盆中種上根系發達、抗逆性強的海島棉或育成品種（抗病、植株旺盛），待棉苗3-5 片真葉時待用（稱砧木苗）。用劈接法和插皮接法將轉基因再生棉株嫁接到砧木苗上（吳慎杰等，2007）。15） 嫁接后的管理：嫁接后3-4d通氣，即旋開瓶蓋罩住瓶口2/3，以防接穗發霉，7 d去掉瓶蓋，10-12 d揭瓶，15 d左右解繩成活。為了讓其快速生長，成活后用霍格蘭營養液澆一

7、次。（三）農桿菌介導棉花下胚軸轉化利用優化了的陸地棉體細胞再生轉化體系，以轉化模式品種W0為受體，利用帶有目的基因的農桿菌載體菌株EHA105與棉花下胚軸進行共培養后，經過一系列的組織培養再生過程，獲得大量的轉基因株系。（四）實驗結果目前，轉pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1、 pC2-dsGFP載體轉基因抗蟲棉獲得再生植株的情況如下，后續實驗還在進行中。pC2-dsPTTH3 ：已獲得20個克隆，10個克隆已嫁接成苗，有2個克隆已經拿到T1代種子。pC2-dsPTTH5 ：已獲得30個克隆，有25個克隆已出大量小苗，20個左右克隆已

8、嫁接，其中幾個克隆已結鈴。pC2-dsJHAMT ：已獲得61個克隆，35個克隆已出大量小苗，嫁接20個克隆，還有小苗待嫁接。pC2-dsJHBP1：已獲得15個克隆，12個克隆嫁接，有2個克隆已經拿到T1代種子，已南繁。pC2-dsGFP ：已獲得5個克隆，其中3個克隆均嫁接成活，收到T0代種子。1. pC2-dsPTTH32. pC2-dsJHAMT3. pC2-dsPTTH54. pC2-dsJHBP15. pC2-dsGFP二pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1轉基因株系的分子檢測結果用CTAB法提取轉基因株系葉片的基因組DNA

9、，以目的基因的特異性引物進行PCR擴增。結果如下：（注：各載體獲得的轉基因后代株系，具體實驗還在進行中，后續將獲得更多克隆數，并進一步進行分子檢測。所以，現獲得檢測結果沒有具體統計。）（一）pC2-dsPTTH3 T0代驗證： 1為marker；2為陽性對照；5為加水陰性對照； 3、4、6、7、8、9、10、11分別為轉基因不同株系（二）pC2-dsPTTH5 T0代驗證：1為marker；2為陽性對照；3為水陰性對照； 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16分別為轉基因不同株系（三）pC2-dsJHAMTT0代驗證：1為marker；2為陽性對照；3為加水陰性對照；

10、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18分別為轉基因不同株系（四）pC2-dsJHBP1T0代驗證：1為marker；2為陽性對照；13為加水陰性對照； 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、分別為轉基因不同株系 T1代驗證:1為marker；2為陽性對照；12為加水陰性對照；3、 4、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、16、17、18分別為轉基因不同株系 （五）pC2-dsGFPT0代驗證：1為marker；2為陽性對照；8為加水陰性對照； 3、4、5、6、7分別為轉基因不同株系三、轉pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT

11、、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1載體轉基因棉花抗蟲遺傳性分析（一）轉不同世代pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1基因抗蟲棉材料的抗性分離情況：本實驗將依據抗蟲轉化植株篩選和生物鑒定的結果，并根據田間生長情況和種子成熟狀況，選擇部分轉化材料進行南繁，對其T2代(T1代自交獲得T2代)、T3代(對T2代中的部分抗蟲單株自交獲得T3代)材料的抗蟲性分離情況進行遺傳分析。（二）轉pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1基因抗蟲棉不同發育時期抗蟲性分析本實驗將以轉基因抗蟲棉為實

12、驗材料，以非轉基因抗蟲棉為陰性對照，轉 Bt殺蟲晶體蛋白基因抗蟲棉為陽性對照進行試驗。將分別于棉花苗期、蕾期和鈴期取各種試驗材料倒3位或倒4位展開葉，接棉鈴蟲初孵幼蟲進行室內抗蟲性生物檢測。每材料接15管，每管接棉鈴蟲幼蟲5頭，重復3次。調查72h幼蟲死亡率及葉片受害面積。（三）轉pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1基因抗蟲棉相同時期不同器官的抗蟲性分析本實驗將以轉基因抗蟲棉為實驗材料，以非轉基因抗蟲棉為陰性對照，轉 Bt殺蟲晶體蛋白基因抗蟲棉為陽性對照進行試驗。于棉花生長花鈴期分別取其棉葉、棉蕾、花瓣、(未成熟)棉桃等組織器官材料進行

13、棉鈴蟲飼喂試驗。不同組織器官(材料)均接蟲30管，每管接入棉鈴蟲幼蟲1頭，重復取樣3次。調查72小時幼蟲死亡情況。（四）不同齡期棉鈴蟲幼蟲對轉基因抗蟲棉的敏感性分析 本實驗將以轉基因抗蟲棉為實驗材料，以非轉基因抗蟲棉為陰性對照，轉 Bt殺蟲晶體蛋白基因抗蟲棉為陽性對照進行試驗。于棉花生長蕾期分別取其倒3葉或倒4葉，并分別接入1齡、3齡、5齡棉鈴蟲幼蟲進行抗蟲棉抗性鑒定研究。每組試驗安排30管，每管接入幼蟲1頭，設3次重復。調查72小時幼蟲死亡情況及葉片受害面積（五）轉基因抗蟲棉對不同世代棉鈴蟲的敏感性分析本實驗將以轉基因抗蟲棉為實驗材料，以非轉基因抗蟲棉為陰性對照，轉 Bt殺蟲晶體蛋白基因抗蟲

14、棉為陽性對照進行試驗。在第2代、第3代、第4代棉鈴蟲發生期間，分別以棉花葉片和棉蕾為試驗材料進行抗蟲性分析研究。每處理為15個樣管，每樣管接入棉鈴蟲3齡幼蟲l頭，設3次重復。調查72小時幼蟲死亡情況。（六）環境條件對轉pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1基因抗蟲棉抗性的影響本實驗將以我國三大棉區以及沿海植棉區的某些特定或易變氣候、環境條件，設計溫度變化(突然升高、突然降低)、干早和水浸、鹽堿等不同試驗處理，以了解轉基因抗蟲棉對環境條件的敏感性。以轉基因抗蟲棉為實驗材料，轉 Bt殺蟲晶體蛋白基因抗蟲棉為陽性對照進行試驗。（1）溫度處理試驗

15、在溫室內用花盆種植，溫度的突然上升和突然下降處理在人工氣候箱內進行。試驗以正常溫室條件下生長的棉花幼苗為環境對照處理，設20、30、35、45恒溫處理以及由20突然上升到30、35、40，穩定24小時;30突然上升到35、45，穩定24小時:45突然下降到35、30、20，穩定24小時;35突然下降到30、20，穩定24小時等不同處理。各處理光照強度、光照時間均保持一致。每材料接15管，每管接棉鈴蟲初孵幼蟲5頭，重復3次。調查72小時幼蟲死亡情況。（2）干早處理試驗在溫室內用花盆種植。試驗以正常條件下生長的棉花幼苗為環境對照處理，設水浸48小時、干旱(不澆水)72小時(3天)、120小時(5天)、168小時(7天)、216小時(9天)以及至葉片半萎蔫等幾個不同處理。每材料接15管，每管接棉鈴蟲幼蟲5頭，重復3次。調查72小時幼蟲死亡情況。（3）鹽堿處理試驗在溫室內用花