1、江浙蝮蛇毒誘導類風濕性關節炎患者滑膜細胞凋亡的實驗研究         09-09-20 16:21:00     編輯：studa20                        作者：胡玨 楊旭燕 呂慶華 許東航【關鍵詞】  江浙 蝮蛇毒 類風

2、濕性關節炎 滑膜細胞凋亡 類風濕性關節炎（RA）是一種以滑膜增生、淋巴巨噬細胞浸潤滑膜層并伴有少量的凋亡為特征的自身免疫性疾病。既往研究表明抗凋亡蛋白Bcl-2在RA患者中較普通骨關節炎患者顯著上調，從而抑制滑液成纖維細胞的凋亡，并導致RA患者滑膜的超常增生，。 江浙蝮蛇毒（Agkistrodom halys Pallas venom，ASV）的主要活性成分蛇毒蛋白有誘導凋亡和抗腫瘤作用，臨床上已被用于治療類風濕性關節炎等慢性疾病所致的炎癥和疼痛，。然而，ASV對RA患者的治療作用機制尚未明確。作者自2007年2至7月檢測ASV對RA患者滑液成纖維細胞的抑制增殖和誘導凋亡作用。

3、60;   1  臨床資料    1.1  一般資料  選擇浙江大學附屬第二醫院骨科行膝關節置換術的RA患者6例，其中男3例，女3例；年齡3462歲，平均（50±10）歲；病程630年，平均（14±10）年。所有患者皆符合1987年美國風濕病學會（ACR）修訂的RA診斷標準。    1.2  主要試劑  DMEM培養基、型膠原酶、FBS，美國Gibco公司；ASV由浙江龍圖蛇業集團有限公司提供，-20 保存；Annexin V-FITC Apop

4、tosis Detection Kit，美國BD公司；鼠抗人bcl-2-FITC-mAb、羊-抗鼠-FITC-IgG-mAb，美國Caltag公司；碘化吡啶，美國Sigma公司。    1.3  滑膜細胞的分離和培養  無菌條件下，從關節置換術獲得的滑膜組織切成35 mm的碎片，用膠原酶和等體積的DMEM培養基，在37 、5%CO2孵箱中消化4 h。常規離心，棄上清液后加0.25 %胰酶1 ml，混勻后消化30 min。1000 r/min離心后棄上清液，加入含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 g/ml鏈霉素的DMEM培養基，放至

5、37 、5 %CO2孵箱中孵育，常規傳代培養。    1.4  MTT法檢測ASV對RA滑膜細胞活力影響  調整細胞懸液濃度為7×104/ml左右，接種于96 孔培養板中，每孔體積100 l，培養24 h。加入不同質量濃度的ASV（1.25、2.5、5、10 g/ml），以溶劑為陰性對照，再入培養箱于相同條件下培養。分別培養24、48、72 h后，每孔加入10 l MTT（5 mg/ml），在培養箱內放置3 h，試驗結束時吸去上清液，加入150l DMSO，震蕩10 min，用酶聯免疫檢測儀于490 nm處測定各孔吸光度（A）值，記錄

6、結果，計算抑制率。    1.5  細胞凋亡檢測  采用流式細胞儀結合碘化丙啶（PI）和Annexin V-FITC雙標記染色測定細胞凋亡率。取對數生長期細胞，細胞濃度為2×105/ml。分組后加入不同質量濃度的ASV（2.5、5、10g/ml），作用24、48 h后，胰酶消化收集細胞。PBS洗滌細胞2次，用1×Binding Buffer重懸細胞，加入5l Annexin V-FITC，混勻，室溫避光孵育15 min，再加入5 l的20 g/ml的PI，混勻后室溫避光孵育5 min，在1 h內流式細胞儀檢測細胞凋亡百分率。

7、    1.6  細胞周期分析  取對數生長期的細胞，調整細胞濃度至5×105/ml，分組后加入不同質量濃度的ASV（2.5、5、10 g/ml），作用24 h后，胰酶消化收集細胞，PBS洗滌2次，70 %冰乙醇固定，4 保存。上機測定前，離心去乙醇，用PBS洗滌2次。加入500 l PI （50 g/ml），4 避光染色30 min，用200 目尼龍網過濾，上機檢測。    1.7  Bcl-2蛋白表達分析  取對數生長期的細胞，調整細胞濃度至5×105/ml，分組后加入不

8、同質量濃度的ASV（2.5、5、10 g/ml），作用24 h后，用含70%乙醇的PBS 1ml滲透細胞30 min，沖洗2 次，棄上清液。加FITC標記的bcl-2單抗（150）100l，4 下孵育30 min，PBS洗2次。加FITC標記的羊抗鼠IgG（1200）100 l，4 下孵育30 min ，PBS洗2次。用PBS代替單抗作陰性對照，立即進行流式細胞儀檢測，bcl-2蛋白表達水平以陽性細胞百分率表示。    1.8  統計學分析  全部實驗結果均來自至少3組平行實驗，數據用(x±s)表示。組間差異性比較采用SPSS10.0

9、軟件進行單因素方差分析，P<0.05有顯著性差異。    2  結果    2.1  ASV對細胞增殖的影響  MTT比色結果顯示，不同濃度的ASV對體外生長的成纖維樣滑膜細胞有增殖抑制作用。經1.25 g/ml ASV處理的細胞生長受到輕微抑制，在ASV2.510 g/ml范圍內，抑制作用呈時間和劑量依賴性，與對照組比較，細胞抑制率差異有統計學意義（P<0.05）。據此，選擇2.5、5、10 g/ml作為以下實驗ASV的作用濃度。見圖1。    圖1 

10、 ASV對細胞增殖的影響    2.2  流式細胞儀檢測滑膜細胞凋亡率  流式細胞儀檢測滑膜細胞凋亡結果表明滑膜細胞加藥處理后凋亡細胞百分率明顯高于未加藥組（P<0.05）。當ASV濃度為5 g/ml和10 g/ml時，24 h后與對照組相比凋亡百分率出現顯著增加。并隨時間的延長及藥物濃度的增高，凋亡細胞數增加。見表1。 表1  不同濃度ASV對RA滑膜細胞凋亡率的影響（%）注：與正常對照組比較P<0.05，*P<0.01    2.3  流式細胞儀檢測細胞周期的變化 

11、; 不同濃度的ASV對RA滑膜細胞作用48 h，其細胞周期的分析結果見表2。實驗結果表明G0/G1期的細胞百分比逐漸增加，S期細胞百分比無明顯變化，G2/M期比例明顯減少（P<0.05或0.01）。說明ASV的作用在G1S期，并能阻滯G1期細胞向S期移行，造成G1期細胞堆積，阻滯DNA合成和復制，抑制滑膜細胞周期進程。表2  不同濃度ASV作用HFLS-RA 24 h對細胞周期的影響（%） 注：各實驗組與正常對照組比較*P<0.05，*P<0.01    2.4  流式細胞儀檢測bcl-2蛋白的表達  離心收集經不同

12、濃度ASV處理的RA滑膜細胞，以FITC標記的bcl-2單抗與細胞共同孵育后經流式細胞儀分析，結果顯示，與對照組比較，2.5 g/ml ASV組的bcl-2蛋白表達差異不明顯，5     g/ml，10 g/ml ASV組隨藥物濃度的增加而bcl-2蛋白表達下降（P<0.05或0.01）。見表3。表3  不同濃度ASV作用HFLS-RA對Bcl-2蛋白的表達 注：各實驗組與正常對照組比較*P<0.05，*P<0.01     09-09-20 16:21:00   &

13、#160; 編輯：studa20    3  討論     類風濕性關節炎(rheumatiod arthritis，RA)成纖維樣滑膜細胞(HFLS)是關節滑膜細胞中主要的一種,可釋放多種細胞因子，并可因環境變化發生演變，存在異常凋亡與增殖。RA-HFLS凋亡不足與RA的發病有關。因此，促進引起自身免疫反應的細胞凋亡，就有可能成為治療此類疾病的一個新途徑。    文獻資料表明，蛇毒含神經毒、細胞毒、眼鏡蛇毒因子、抗凝血因子、膽堿酯酶等多種活性成分，并富含鋅、鎂等微量元素，藥理作用非常

14、廣泛，有明顯的免疫調節功能，對RA患者有很好的治療效果，治療后患者類風濕因子等有關實驗室指標轉陰率較高，復發率低，預后良好，特別是能明顯改變部分晚期RA患者的關節活動功能，而且無明顯毒副作用。蛇毒誘導腫瘤細胞凋亡已從形態學及分子生物學方面得到明確證實。動物實驗結果表明，眼鏡蛇毒素對大鼠佐劑性關節炎模型的踝關節腫脹程度影響不大，但可顯著抑制大鼠棉球樣肉芽腫形成，提示眼鏡蛇毒素抗RA作用可能主要是對關節滑膜增生過程有一定保護或逆轉作用。Dong等研究表明江浙蝮蛇毒(ASV)作用于人白血病Jurkat細胞后，可見ASV具有強烈的細胞毒作用48hIC50值為（9.78±0.38）g/ml，并

15、能誘導細胞凋亡。然而對于ASV引起HFLS凋亡的機制，目前國內外均未見文獻報道。    本研究采用MTT法觀察ASV對RA患者體外培養的成纖維樣滑膜細胞增殖的影響，發現ASV能抑制其增殖，且呈劑量和時間依賴性。在此基礎上，作者應用流式細胞儀檢測細胞周期變化結果顯示，ASV能阻滯G1期細胞向S期移行，導致G1期細胞堆積，阻滯DNA合成和復制，提示可能與抑制細胞周期蛋白磷酸化的G1/S關卡有關。以上研究表明，ASV呈時間和劑量依賴性地抑制滑膜細胞增殖的作用。這與許多研究表明的蛇毒可抑制腫瘤細胞等增殖的結果大致相同，。    在RA滑膜細胞

16、凋亡相關的分子中，Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中一對凋亡相關基因，在細胞凋亡調控中起重要作用，Bax可促進細胞凋亡，而Bcl-2作為原癌基因阻止細胞凋亡。研究證實，RA患者滑膜淋巴細胞T細胞大量bcl-2表達且無凋亡現象，提示bcl-2表達提供給炎癥細胞生存信號。Bcl-2過量表達可能抑制RA滑膜細胞凋亡，是RA滑膜增生的原因之一。RA患者滑膜細胞上bcl-2表達上調，可活化凋亡抑制信號，從而促進滑膜細胞的增生和增殖。對滑膜細胞凋亡機制的研究，為RA多靶點治療提供了可能。本研究中，ASV誘導滑膜細胞凋亡時伴有bcl-2蛋白表達下降。在5、10 g/ml濃度范圍內，bcl-2蛋白的表達隨著

17、ASV濃度的增加而降低。這說明bcl-2在ASV體外誘導RA患者滑膜成纖維細胞凋亡實驗中有重要作用，但其如何調控基因表達，還需進一步實驗驗證。【參考文獻】  1 Ceponis A，Hietanen J，Tamulaitiene M，et al. A comparative quantitative morphometric study of cell apoptosis in synovial membranes in psoriatic， reactive and rheumatoid arthritis. Rheumatology，1999，38：431440.2 Perlma

18、n H，Georganas C，Pagliari L J，et al. Bcl-2 expression in synovial fibroblasts is essential for maintaining mitochondrial homeostasis and cell viability . Immunol，2000，164 (10)：52275235.3 董慶華，鄭 樹，呂慶華，等. 浙江蝮蛇毒誘導人白血病Jurkat細胞凋亡的體外實驗研究 .中國中西醫結合雜志，2002，22 (11)：936938.4 Cheng X，Qian Y W，Liu Q D，et al. Purification characterization of a new venom protein from Agkistrodon acutus venom. Biochem Biophys Res commun，2001，265(2)：530535.5 Firestein G S. Invasive f