1、遺傳性中頻聽力障礙及其致病基因EYA4            【關鍵詞】  聽力障礙    聽力障礙是一種很常見的言語交流障礙疾病。1991年Morton的調查顯示：以言語頻率平均聽閾大于25 dB HL為標準，15% 20% 的成年人患有聽力障礙，而在大于80歲的人群中，該比例接近50%1。我國第二次殘疾人抽樣調查公布患聽力殘疾者占殘疾人總數的2%。引起聽力障礙的環境因素包括噪聲、藥物、感染和外傷等；遺傳因素則可以通過單基因

2、突變，多基因協同作用，或基因突變引起對環境損傷（如噪聲、藥物）的異常敏感而致聾。大于50%的語前聾是由遺傳因素引起的，隨著年齡增加，人群中的耳聾患病率也增加，反映了遺傳因素和環境因素共同起重要作用2。隨著環境因素得到有效控制，由環境因素致聾的比例有逐漸下降的趨勢。相應的，遺傳因素在聽力障礙中的作用顯得越來越明顯。所以，臨床耳鼻喉科醫生有必要關注遺傳性耳聾。而某些遺傳性耳聾具有較典型的臨床表現，這是重要的診斷和研究線索。比如常染色體顯性遺傳性耳聾DFNA10的患者發病早期聽力損失集中于中頻。為更好認識這種遺傳性耳聾，現將DFNA10的臨床表現及其致病基因EYA4做如下綜述。1DFNA10的臨床表

3、現特點遺傳性耳聾可以分為綜合征性和非綜合征性兩類。非綜合征性耳聾（non-syndromic hearing impairment，NSHI）是指耳聾為單一遺傳癥狀，在遺傳性耳聾中占70%以上3。大約30%為綜合征性耳聾(syndromic hearing impairment, SHI）2。SHI 除表現聽力障礙外，還合并全身其他器官、系統的異常。引起非綜合征性耳聾的基因座位被命名為 “DFN”（DeaFNess）。常染色體顯性、隱性，X-連鎖遺傳的基因座位分別被稱為DFNA、DFNB、DFN，名稱之后的數字代表該基因座位被定位或提前預留的順序。非綜合征性耳聾的發病比例如下：DFNA約占22

4、%，DFNB約占77%，DFN約占1%, 線粒體遺傳約占1%1。目前命名的DFNA1到DFNA5中有43個基因座位被定位，22個基因被克隆（Van Camp , Smith R. Hereditary Hearing Loss Homepage2008-05-28）。大多數DFNA表現為遲發性耳聾（late-onset hearing loss），發病初期以高頻聽力損失最常見，逐漸累及其他頻率。但也有一部分DFNA發病初期以低頻或中頻聽力損失為主。當中頻（.5 2 kHz）的聽力損失比低、高頻更嚴重，則呈現谷型聽力曲線，國外文獻中也稱之為“咬餅樣聽力圖（cookie-bite audiogra

5、m）”。表現為中頻聽力障礙的常染色體顯性遺傳性耳聾有DFNA10，DFNA134；而報道的DFNA8/125, 6、DFNA287家系中有些聽力障礙首先發生在高頻，也有些家系首先發生在中頻。到目前為止，文獻報道的DFNA10家系共有5個（見表1）。1996年，O'Neill等8對一個常染色體顯性耳聾的美國家系進行連鎖分析，在6號染色體上發現了一個新的耳聾基因座位，定位于6q22 23上15 cM遺傳距離的范圍之內，命名為DFNA10。之后通過增加該家系成員，將范圍縮小至6.0 cM，EYA4位于其中。胚胎發育過程中，包括聽囊在內的許多組織中均表達EYA4，所以EYA4成為DFNA10位

6、置和功能候選基因中的首選。年Wayne9通過研究上述的美國家系和另一個比利時家系，將EYA4確定為DFNA10的致病基因。這些DFNA10家系在臨床表現上具有共同點：均是遲發性耳聾，發病年齡6 歲。發病初期中頻聽力損失最明顯，故聽力曲線為谷型，之后高頻、低頻聽力也逐漸下降而顯示出下降型或平坦型聽力曲線。   除耳聾之外沒有伴發癥狀。關于耳聾的進展速度，          Verstreken10對比利時家系進行了詳細記錄和報道，0.5   4 kHz平均聽閾每年下降1.08

7、dB HL。而在美國家系，當聽力損失不超過50 dB HL時， 0.25，4，8 kHz三個頻率平均聽閾每年損失0.6 dB HL，其中一名患病成員6歲到32歲縱向聽力資料顯示0.25 kHz 到8 kHz平均聽閾每年損失2     3 dB HL11。EYA4和Eya基因家族EYA4是脊椎動物Eya基因家族成員。脊椎動物Eya基因家族由四種轉錄激活因子（Eya1Eya4）組成，是果蠅eya（eye absent）基因的同源基因。果蠅eya基因參與眼睛的形成15，攜帶eya基因突變的果蠅，眼睛發育障礙。2.1Eya基因家族蛋白Eya基因家族的蛋白結構均有兩部分組成

8、：高度保守的羧基末端，由271個氨基酸組成，被稱為eya同源區域（eya-homologous region，eyaHR）；多變的氨基末端（eya variable region，eyaVR）16（見圖2）。對果蠅的研究顯示17, 18，eyaHR和so（sine oculis）及dac（dachshund）基因的翻譯產物共同參與調節蛋白-蛋白之間相互作用，ey (eyeless)能引起eya和so的表達。脊椎動物so基因的同源基因是Six基因家族成員，so和Eya蛋白結合，引起蛋白復合體的核轉運19。果蠅eya和鼠類Eya13基因翻譯產物的氨基末端具有轉錄激活作用，并且Eya基因的協同作用及

9、其途徑在物種之間具有保守性18。eyaHR在EYA蛋白家族中有重要作用，能調節和PAX、SIX、DACH的作用20。Eya1HR和Eya4HR蛋白都能和Six1結合，并伴隨核轉運。同時，Six1能結合特異性DNA啟動子，結合親和力被EyaVR調節。EyaHR突變蛋白不能和Six1相互作用，并在哺乳動物體內快速降解。2.2Eya基因家族表達的組織特異性胚胎發育早期，Eya基因在組織中廣泛表達。Eya基因家族的每個基因具有獨特的表達方式，同時存在廣泛重疊。比如，對鼠科動物的研究顯示Eya1、Eya2和Eya4在胚胎期的中胚層和頭部間充質都有表達，而在聽囊表達的只有Eya1和Eya4。Eya3的表達

10、局限于顱面和腮弓間充質，而在顱基板之下或周圍有Eya1、 Eya2或Eya4的表達21。2.3人類EYA4基因的不同剪接形式人類EYA4基因共有21個外顯子，第一外顯子不參與翻譯。由于EYA4 不同的剪接形式而產生了不同亞型22（如圖1）。為了確定在耳蝸表達的是哪種亞型，Wayne9對人胚胎耳蝸EYA4mRNA利用相應外顯子5、16、19/20的引物進行了RT-PCR及測序，并且篩查了成人和人胚胎EYA4 的cDNA文庫。 結果顯示：人胚胎耳蝸中外顯子5和較短形式的外顯子16得不到擴增，但能擴增出外顯子19和20。胚胎期大腦中只有外顯子19表達。成人大腦中外顯子19少量表達，但外顯子20表達豐

11、富。3 EYA4和EYA1突變引起不同的臨床表現目前發現EYA基因家族突變可導致3種與耳聾有關的人類遺傳病。EYA1突變可引起腮-耳-腎（branchio-oto-renal，BRO）綜合征23，BRO綜合征最常見的特征表現是耳聾（98.5%），耳前瘺管（83.6%），腮器官的畸形（68.5%），腎臟畸形（38.2%），外耳畸形（31.5%）24。EYA4突變引起非綜合征性耳聾DFNA10和一種綜合征性耳聾：耳聾和擴張性心肌病25。Eya基因家族的蛋白結構彼此相似，為什么EYA1和EYA4突變引起的臨床表現卻不相同？嚙齒動物胚胎早期Eya1和Eya4在聽囊都有表達，但Eya4的空間分布比Eya

12、1變化更大。當聽囊分化成為聽覺和前庭器官，Eya4在將發育成血管紋和Reissners膜的蝸管上層細胞中聚集，并在胚胎期18.5天由蝸管上層表達轉換為由蝸管底部神經上皮表達。而Eya1的表達集中于Corti器的蝸管底部。從出生后1天到14天的成骨時期，Eya4在耳蝸囊也有強烈表達。發育期的前庭系統上皮中存在Eya4表達9。目前尚不能確定表達Eya4的上皮種類，但是可以肯定在胚胎發生過程中Eya4和Eya1的表達存在明顯重疊。胚胎期Eya4和Eya在結合SIX1方面顯示出功能上的重疊、互補，這點和DFNA10耳聾患者缺乏先天性異常表型是一致的11。EYA4的胚胎期表達和DFNA10的臨床表現為遲

13、發性耳聾兩種現象之間的分離也許反映了EYA4和EYA1在功能上的重疊主要是在胚胎發育階段而非成熟期26。4EYA4突變的致病機制假說導致顯性遺傳疾病表型的機制分為兩大類：功能缺失和功能獲得。典型的功能缺失提示單倍體劑量不足，包括基因量、基因表達或蛋白活性的降低。而功能獲得提示增加的基因量、改變了的mRNA表達、增加或異常的蛋白活性，或稱為顯性負效應27。發生單倍體劑量不足的往往是調控基因，它們通常在接近閾值的情況下工作。構建等位基因同為野生型及雜合突變的EyaHR，并對不同的等位基因進行標記，發現野生型等位基因正常表達，突變      的Eya

14、HR表達量明顯減少。所以，單倍體劑量不足是       DFNA10表型的基礎26。無義突變Eya4HR R564X和Eya1HR R539X及錯義突變Eya1HR L504R與Six1的親和力均顯著降低，推測構象變化是Eya突變致病的原因26。Clark28等認為Eya基因家族除了在發育過程中發揮功能，也能作為凋亡前信號，過度表達的Eya能直接激活凋亡程序。細胞凋亡蛋白酶-3敲除小鼠表現為進展性耳聾，以及毛細胞退化和支持細胞增生29, 30。由于進展性耳聾是   DFNA10家系的重要表現，EYA4的凋亡機制異常

15、也許和耳聾有關。5EYA突變類型及其臨床表現目前報道的5個DFNA10家系EYA4突變為：1個無義突變、3個移碼突變，1個剪切位點突變。將突變種類簡要的分為兩種，截短突變（truncating mutation）：剪切位點突變、插入突變、無義突變、倍增突變和超過3bp的缺失突變；非截短突變（nontruncating mutation）：錯義突變和3bp的缺失突變。前者造成了截短的蛋白，而后者的蛋白沒有被截短。如圖2所示：已報道的5個EYA4突變均為截短突變，造成了EYA4蛋白同源區域（eyaHR）不同程度的缺失或同時伴有可變區域（eyaVR）的部分缺失。那么是否只有截短的EYA4蛋白才會引起

16、DFNA10的臨床表現？顯然，無法在已報道的DFNA10家系中進行分析。Zhang26對引起BRO綜合征的EYA1突變種類和臨床表現之間的聯系進行了統計分析。通過比較35例BRO綜合征基因型和臨床表現發現：截短突變并非導致了更嚴重的臨床表現。根據Eya突變致病是基于蛋白構象改變而引起的疏水性下降、電荷增加或某一位置的氨基酸側鏈大小的改變，我們可以預測EYA4非截短突變同樣會引起DFNA10的臨床表現。EYA4突變還和一種綜合征性耳聾：耳聾和擴張性心肌病有關，此病發生了EYA4基因4846 bp的缺失突變，同時累及了EYA4蛋白同源區域和大部分可變區域。Schonberger推測：EYA4蛋白缺

17、失限于同源區域則只有耳聾表現，若同時累及可變區域則可伴發擴張性心肌病25。如圖2所示：兩個DFNA10美國家系中的EYA4突變同樣也影響了小部分eyaVR，卻沒有心肌病的臨床表現。所以，EYA4突變的致病機理及其和臨床表現的聯系有待于對新發現的DFNA10家系的進一步研究。結束語DFNA10的研究結果可以用于指導聾病分子診斷，對具有DFNA10臨床表現，攜帶EYA4突變的患者進行遺傳咨詢，比如：使患者了解疾病中的遺傳作用，了解再發風險，進行產前咨詢，選擇合理治療，積極對待疾病。今后遇到常染色體顯性遺傳性耳聾家系，尤其表現為谷型聽力曲線者，提示我們考慮EYA4突變。對EYA4引起綜合征性耳聾的研

18、究顯示：心肌病的發生和年齡相關，比耳聾癥狀出現的更晚。那么，需要詳細的臨床評估以發現早期病變和提前干預治療。由于目前發現的DFNA10家系攜帶的EYA4突變均是截短突變，限制了突變形式和臨床表現的關聯性分析。為何EYA4基因突變所致的聽力損失首先發生在中頻？目前機制尚不明確。隨著今后發現更多的DFNA10家系，建立EYA4定向突變小鼠， DFNA10的發病機制和EYA4蛋白在聽覺系統的功能將會得到更好的闡明。    【參考文獻】  1Morton NE. Genetic epidemiology of hearing impairment. A

19、nn N Y Acad Sci, 1991, 630: 16-31.Kochhar A, Hildebrand MS, Smith RJ. Clinical aspects of hereditary hearing loss. Genet Med, 2007, 9(7): 393-408.Van Camp G, Willems PJ, Smith RJ. Nonsyndromic hearing impairment: unparalleled heterogeneity. Am J Hum Genet, 1997, 60(4): 758-764.McGuirt WT, Prasad SD,

20、 Griffith AJ, et al. Mutations in COL11A2 cause non-syndromic hearing loss(DFNA13). Nat Genet, 1999, 23(4): 413-419.Plantinga RF, Cremers CW, Huygen PL, et al. Audiological evaluation of affected members from a Dutch DFNA8/12(TECTA) family. J Assoc Res Otolaryngol, 2007, 8(1): 1-7.Alloisio N, Morle

21、L, Bozon M, et al. Mutation in the zonadhesin-like domain of alpha-tectorin associated with autosomal dominant non-syndromic hearing loss. Eur J Hum Genet, 1999, 7(2): 255-258.Peters LM, Anderson DW, Griffith AJ, et al. Mutation of a transcription factor, TFCP2L3, causes progressive autosomal domina

22、nt hearing loss, DFNA28. Hum Mol Genet, 2002, 11(23): 2877-2885.O'Neill ME, Marietta J, Nishimura D, et al. A gene for autosomal dominant late-onset progressive non-syndromic hearing loss,    DFNA10, maps to chromosome 6. Hum Mol Genet, 1996, 5(6): 853-856.Wayne S, Robertson

23、NG, DeClau F, et al. Mutations in the transcriptional activator EYA4 cause late-onset deafness at the    DFNA10 locus. Hum Mol Genet, 2001, 10(3): 195-200.Verstreken M, Declau F, Schatteman I, et al. Audiometric analysis of a Belgian family linked to the DFNA10 locus. Am J Otol,

24、2000, 21(5): 675-681.De Leenheer EM, Huygen PL, Wayne S, et al. The DFNA10 phenotype. Ann Otol Rhinol Laryngol, 2001, 110(9): 861-866.Pfister M, Toth T, Thiele H, et al. A 4-bp insertion in the eya-homologous region (eyaHR) of EYA4 causes hearing impairment in a Hungarian family linked to DFNA10. Mo

25、l Med, 2002, 8(10): 607-611.Makishima T, Madeo AC, Brewer CC, et al. Nonsyndromic hearing loss DFNA10 and a novel mutation of EYA4: evidence for correlation of normal cardiac phenotype with truncating mutations of the Eya domain. Am J Med Genet A, 2007, 143(14): 1592-1598.Hildebrand MS, Coman D, Yang T, et al. A novel splice site mutation in EYA4 causes DFNA10 hearing loss. Am J Med Genet A,2007, 143(14): 1599-1604.15Hentze MW, Kul