1、棄我去者昨日之日不可留亂我心者今日之日多煩憂附件1標本采集和保存技術要求一覽表種 類采集時刻 和頻次米集方法保存條 件備注病人類型種 類刻時集采舷和保存條 件注 備所有病例全 血5 JP- 一 后-a采 院隔、A前 人集、采1。 K>-厶天3>C育 管存 叮 2財 采裝測P 分單 空橐清塊 真祚血血菌低溫保 存，-70 C最佳，-20 C亦可細于用Q 塊H 血菌抗凝血M集無素 管 生 血抗 采 用 凝使 抗集在血 空采好采 真菌最前同上要能0C,凍 所訥室-1否冷 病驗C如溫 染如達0俁低存 傳求進可保可保咽拭子M集>后詠射B 拭咽分病螺 擦及頭1的 子體子m液 拭桃拭3梓中

2、 桿扁將含采管 料咽，入菌料 塑側壁浸細塑同上O ac漱 口 液M集菌 攵 含敕斗 不沁對 mm硯In O 一#鱷4司 素無集O ac尿標本即 采豐 院 床耐 入集"標 K采Z集“mm 一、才O同上o ac便標本即 采豐 院 床耐 入集"標 K采Z集訕本 無標 便o ac下呼吸道標采時管«管氣集同上o ac病人類型種 類采集時刻 和頻次米集方法保存條 件備注本痰 液有痰液時采集同上詳見表下 注。心臟穿刺組織死亡后未做尸 檢時采集同 上詳見表下 注肺穿刺組織心 包 液胸腔積液尸檢標本2份同 上,1 份福爾 馬林充 分固定 后，4 °C 保存應盡量多米 集各

3、器官組 織標本，例如 肺組織、胸腔 積液、心臟組 織、心包液、 肝、腎、脾組 織，假如有神 經系統表現， 還需采集腦 組織以及其 它可能受累 的器官標本病人類型種 類刻時集采舷和保存條 件注 備有明確腦膜腦炎或腦炎癥狀病例腦脊液期 性 急集 采 菌 無同上有出疹癥狀病例皰 疹 液集 采 菌 無同上注:1、以上標本分不用于開展病毒和細菌等病原體檢測2、采集咽拭子標本、下呼吸道標本、痰液、心臟穿刺組織、肺穿刺組織、心包液、胸腔積液 使用的樣品保存液應不含抗生素或不用樣品保存液，現 場無菌接種，并將接種后剩余的標本立即冷凍（-20C以下）保存。漱口液、尿標本和糞便標本現場無菌接種，并將接種后剩余的標

4、本立即冷凍（-20C以下）保存。附件2手足口病例標本送檢登記表患者姓名性不出生日期年月日（陰/陽歷）家長姓名家庭住址市鄉（鎮、街辦）村（居）號家庭電話發病日期年月日初診日期年月日；初診單位（省級/市級/縣級/鄉級/村級）初步診斷：住院治療（是/否），如住院，則：入院日期年月日，入院診斷出院日期年 月日，出院診斷病程天預后：痊愈/好轉/未愈/死亡/其他;后遺癥（有，;無）標本統一編號:標本類型采樣日期送檢 日期是否 冷藏標本量收樣 日期檢測日期報告日期實驗結果RDHEp-2中和抗體滴度咽拭子血 清急性期恢復期糞便標本腦脊液皰疹液注：送檢標本編號為“標本統一編號 +標本類型”，其中“為咽拭子 代碼

5、，“ S1”為急性期血清代碼，“S2”為恢復期血清代碼，“ F”為糞 便標本代碼，“ CSF為腦脊液代碼，“ H為皰疹液代碼。附件 3手足口病實驗室檢測方案（試行）為規范手足口病的標本采集、 運送及實驗室檢測操作程序， 提高檢測準 確性，從而為手足口病的明確診斷和相關實驗研究提供可靠的依據，特制 定本方案。手足口病的實驗室檢測原則和程序手足口病的診斷一般是通過采集適當的臨床標本后進行病毒分離和病 毒鑒定，假如沒有采到合適的臨床標本，或無法進行病毒分離，也能夠通 過血清學檢測（如中和實驗）來檢測血清中的中和抗體，或直接從臨床標 本中檢測病毒的核酸來診斷（見下圖：手足口病的實驗室診斷流程圖） 。一

6、般是由省級病毒實驗室進行病毒的分離，爆發疫情范圍較大時，國 家參比實驗室也能夠提供技術支持。病毒分離成功后，送至國家參比實驗 室進行鑒定或復核，同時對全國手足口病的病原進行病毒學監測。國家參 比實驗室接到標本后，在 30 日內將結果反饋給省級實驗室。專門多血清型的腸道病毒能引起手足口病，不同細胞系對不同病毒的敏感性是有所不同的，而不同時期腸道病毒的流行株也不同。通常用于腸 道病毒分離的細胞系為 RD細胞（對CA16和EV71敏感）、HEp-2細胞（對某 些柯薩奇B組病毒敏感）等，聯合使用上述兩種或更多細胞（如Vero細胞） 有助于分離到更多的腸道病毒。使用血清型特異性的中和抗血清進行的中和實驗

7、是腸道病毒鑒定的差 不多方法，假如使用了適當的抗血清，實驗結果是比較可靠的。因為腸道 病毒包括若干個血清型，通常使用組合抗血清進行鑒定，有些組合抗血清 差不多商品化。當無法進行病毒分離或得不到適用于病毒分離用的標本時，血清學檢 測能夠為腸道病毒的感染提供一個間接的證據。一般用急性期血清與恢復 期血清的檢測結果進行比較，抗體滴度呈四倍或以上增高證明有急性感染。 然而，無癥狀的腸道病毒感染也是常見的，因此對檢測結果的解釋要慎重 一些。 O為了提高檢測速度，也為了輔助中和實驗法進行毒株鑒定，最近專門 多實驗室都使用分子生物學方法。目前，用分子生物學方法對腸道病毒進 行定型還沒有統一的標準，而且要依照

8、檢測目的選擇使用適用的方法。檢測結果的評價假如從臨床標本中分離到腸道病毒，尤其是分離自腦脊液、皰疹液， 那么專門可能該病毒確實是病因病原。當無法進行病毒分離或未分離到病 毒時，血清學診斷方法能夠作為病毒感染的間接證據。關于難以分離到的腸道病毒，分子生物學方法如 RT-PCF是專門有用的。腸道病毒有時引起無 癥狀感染，因此實驗結果的實際意義應結合臨床過程和流行病學資料進行 解釋。實驗室診斷標準依照手、足、口等部位典型皮疹即可作出HFMDfi床診斷，流行病學接觸史有助于診斷，臨床診斷病例中符合下列之一，即為實驗室診斷病例： 1，患者的糞便標本、咽拭子標本中病毒分離陽性率遠高于對比人群；2，腸道病毒

9、型特異性中和抗體滴度1 : 256;或恢復期血清中腸道病 毒型特異性中和抗體較急性期有 4 倍或 4 倍以上增高；3，在病變組織中如皰疹液或腦脊液中分離到病毒; 4，自患者血清、皰疹液或腦脊液等標本中檢測到病原體核酸。一、標本采集對象標本采集對象是暴發疫情出現時手足口病的臨床診斷病例和病例發病所在社區（村）的臨近無病例的社區（村）或托幼機構的 5 歲以下的兒童 （作為健康對比人群） 。用于病毒分離的標本包括糞便、咽拭子和皰疹液，假如患者出現神經 系統癥狀，能夠采集腦脊液標本。關于血清學診斷，需要在急性期和恢復 期采集雙份血清標本。臨床標本在運輸和貯存過程中要幸免反復凍融，假 如不能確保-20C

10、的條件，應該在 08C運輸和保存。標本應冷凍運輸，運 輸時要附有必要的信息， 如標本編號、發病日期和標本采集日期。二、標本種類及采集、運送（一）糞便標本采集病人發病 7 日內的糞便標本，用于病原檢測。糞便標本采集量58g/份，采集后立即放入無菌采便管內，4C暫存立即（12h內）送達實驗室，20C以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于 70C冰箱。（二）咽拭子標本采集病人發病 3日內的咽拭子標本， 用于病原檢測。 用專用采樣棉簽， 適度用力拭抹咽后壁和兩側扁桃體部位，應幸免觸及舌部；迅速將棉簽放 入裝有 35ml 保存液（維持液或生理鹽水，推舉使用維持液）的采樣管中， 在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋

11、緊管蓋并密封，以防干燥。4C暫存立即（12h內）送達實驗室，20 C以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于70 C 冰箱。（三）血清標本采集急性期（發病 03d）和恢復期（發病 1430d）雙份配對血清用于抗體檢測。靜脈采集 35ml 全血，置于真空無菌采血管中，自凝后，分 離血清，將血清置于20C以下冰箱中冷凍保存。（四）皰疹液在手足口病的實驗室診斷中， 從皰疹液中分離到病毒具有專門高的診 斷價值，可同時采集多個皰疹作為一份標本。先用75%的酒精對皰疹周圍的皮膚進行消毒，然后用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉 簽放入內裝有 35ml 保存液（維持液或生理鹽水，推舉使用維持液）的采

12、樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封。所采集標本4C暫存立即（12h內）送達實驗室，20C以下低溫冷凍保藏，需長期保存的 標本存于70 C冰箱。（五）腦脊液標本 出現神經系統癥狀的病例，要采集腦脊液標本，進行病原和抗體檢測，從腦脊液中分離病毒也具有專門高的診斷價值。 采集時刻為出現神經系統 癥狀后 3天內，采集量為 1.02.0ml 。采集后立即裝入無菌帶墊圈的凍存 管中，4C暫存立即（12h內）送達實驗室，20C以下低溫冷凍保藏， 需長 期保存的標本存于70 C冰箱。（六）病例緊密接觸者的標本采集選擇典型病例所在的托幼機構、 或所在村， 以新發病例緊密接觸者為采樣對象，采集單份糞便

13、和血清標本。七）健康對比的標本采集選擇患兒發病所在社區（村）的臨近無病例的社區（村）或托幼機構。采集5歲以下的兒童單份糞便和血清標本。三、標本米集注意事項在手足口病的實驗室診斷中， 從皰疹液或腦脊液中分離病毒具有專門高的診斷價值，但關于不同血清型的腸道病毒，腦脊液中的病毒分離率是大不相同的。用于采集咽拭子的無菌拭子要放在適當的保存液中，如維持液或生理鹽水，以防干燥。用于分子生物學診斷的標本采集與病毒分離標 本的采集方法一樣。為了保證檢測結果的準確性和有效性，標本應在病例發病后盡早采集，盡快檢測。不能立即檢測的標本應冷凍保存。關于血清 學診斷，急性期血清應該在發病后盡早采集，恢復期血清在發病兩周

14、后采集。四、實驗室檢測操作流程（一）病毒分離1. 試劑配置（1）細胞的生長液、維持液的配制見下表生長液（GM）維持液（MM ）Eagle's 液(MEM)86.5ml92.5mlL-谷氨酰胺200mM1.0ml1.0ml胎牛血清10.0ml2.0ml7.5%NaHCO3 溶液2.5ml3.5mlP.S溶液*（青霉素及鏈霉素）1.0ml1.0ml（2）糞便標本的處理液完全PBS液中加入P. S溶液，終濃度為青霉素 500單位/ml，鏈霉素為 500 卩 g/ ml。2. 病毒分離細胞系許多細胞系可支持人腸道病毒（如EV71、CA16生長。關于檢測手足口病的病原來講，建議所有懷疑含EV7

15、1、CA 1 6的標本均需接種到以下兩種細胞系：? RD細胞，來源于人橫紋肌肉瘤細胞。 ? HEp-2細胞，來源于人喉癌上皮細胞。3. 標本的處理（ 1 ）糞便標本的處理操作步驟：1.1 在離心管上標記標本號；1.2 每管中加入 10ml PBS、 1g 玻璃珠、 1ml 氯仿；1.3在生物安全柜中將每一份糞便標本取大約2g加入標記好的離心管中（確保離心管上的標號與原始標本的標號一致） ；1.4剩余的原始標本最好留在原容器中，凍存于20C;1.5 確保擰緊離心管，用機械震蕩器劇烈震蕩20min；1.6 在確保離心機的蓋子蓋好和離心桶密封的情況下，用冷凍離心機在 1500g 條件下離心 20mi

16、n;1.7 在生物安全柜中將每一份標本的上清液分不吸入 2 個有外螺旋 蓋的凍存管中（假如上清液不清亮，應再用氯仿處理一次） ；1.8 一管糞便懸液凍存于20C作為備份，另一管存于 48C以備 接種。（2）皰疹液標本的處理皰疹液標本通常直接用于病毒分離。（3）腦脊液標本的處理 腦脊液標本通常直接用于病毒分離。（4）咽拭子標本的處理 咽拭子要在標本運輸（保存）液中充分攪動（至少 40 下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細胞等，然后在4C條件下，10000 rpm離心20mi n，用上清接種到細胞上，假如發覺有細菌污染，須用濾器過濾除菌。4接種和觀看（病毒分離）（1）顯微鏡下觀看單層細胞，以

17、確保細胞是健康的。一個健康的單層 細胞會在傳代后 3d 左右形成；（2）倒掉生長液（GM，換上11.2ml的維持液（MM；（3）每一份標本需要同時接種 2支RD細胞和2支HEp-2細胞，正確標記每支細胞培養管（包括標本的編號、日期、傳代數） ；（ 4）每一種細胞至少標記一管作為陰性對比；(5) 每支試管接種0.2ml的標本懸液，培養溫度要求 36C (關于AHC標本的病毒分離，尤其是 EV7 0的分離培養，強烈建議降低培養溫度，一般可為3435C);(6) 使用倒置顯微鏡每天觀看細胞培養管，以觀看有特征性的腸道病毒致細胞病變效應(CPE的出現(如細胞變圓，折光增強并脫離管壁等)；( 7)記錄接種管和對比管細胞所發生的變化至少一周，記錄CPE( 1+4+)、提示細胞受毒性反應、老化或污染的阻礙而發生的變化(1+，<25%; 2+, 25%50%; 3+, 50%75%; 4+, 75%100% )；(8) 假如有特征性的腸道病毒 CPE出現，要如實記