1、哺乳動物血液基因組DNA提取試劑盒一、產品簡介首先用優化的紅細胞裂解液快速分離白細胞，再采用獨特的細胞裂解液，配合蛋白酶K 裂解白細胞釋放基因組DNA；通過異丙醇沉淀的方法回收基因組DNA；無需苯酚、氯仿等有害有機溶劑。適合從0.1 -20 ml 哺乳動物抗凝全血中提取基因組DNA；每毫升新鮮的抗凝全血中可提取多至45 g 基因組DNA，DNA 長度可達150 kb ( DNA 得率和完整性因血液保存方法和時間而異)。純化的基因組DNA 適合用于酶切、Southern 雜交、PCR、RAPD、RFLD 等分子生物學實驗。二、試劑盒組成和儲存組成內容DBI-2005(可從50ml 血液中提取基因

2、組DNA)DBI-2006(可從200ml 血液中提取基因組DNA)Proteinase K 0.3 ml 1.2 ml紅細胞裂解液125 ml 2×250 mlBuffer CS 15 ml 60 mlBuffer CL 30 ml 120 mlTE 30 ml 2×60 ml說明書1 份1 份Proteinase K: 20 mg/ml, -20長期保存；第一次使用前將Proteinase K全部加入Buffer CS中，4保存。TE：10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0(25°C)。除Proteinase K和Buffer

3、CS(加入蛋白酶K)外，其他組成成分于室溫儲存。三、注意事項1. Buffer CL 含刺激性化合物，避免沾染皮膚、眼睛和衣服、謹防吸入口鼻。若沾染皮膚、眼睛，立即使用大量水或生理鹽水沖洗沾染處，必要時尋求醫療咨詢。2. 使用后應及時蓋緊試劑瓶蓋子，以免影響下次使用效果。3. 血液樣品短期保存：加入抗凝劑后充分混合均勻，2-8可保存10 天，基因組DNA 完整性和產量隨放置時間延長而下降；如需獲得全長基因組DNA 盡可能使用新鮮的抗凝血，或者2-8保存不超過3 天。4. 血液樣品長期保存：加入抗凝劑后充分混合均勻，-70保存。使用時應減少反復凍融，可在凍存前按所需使用體積分裝。四、操作步驟(一

4、)簡要操作方法第一次使用前將試劑盒攜帶的Proteinase K 全部加入Buffer CS，4保存。所有離心操作均可在室溫下完成。1. 設血液體積為1 V，按表1 計算需使用的各試劑體積。2. 加入2.5 V 紅細胞裂解液，翻轉混合均勻，離心沉淀白細胞，去除上清。3. 加入1/4 V Buffer CS，充分懸浮細胞沉淀。4. 加入1/2 V Buffer CL，劇烈混合均勻。65水浴10-30 min (水浴時間因血液體積而異)。5. 加入3/4 V 異丙醇，翻轉混合均勻。6. 離心沉淀DNA，去除上清。7. 加入3/4 V 70%乙醇懸浮沉淀，離心去上清。8. 重復步驟7。9. 室溫或者

5、37放置干燥DNA。10. 至少加入1/10 V TE 溶解DNA，而且TE 體積不可小于200 l。表1. 從各種體積的血液中提取基因組DNA，需使用試劑的體積和離心管的規格血液體積/l 1 V 100 200 300 400 600 800 1000紅細胞裂解液/l 2.5 V 250 500 750 1000 1000 2000 2500Buffer CS/l 1/4 V 25 50 75 100 150 200 250Buffer CL/l 1/2 V 50 100 150 200 300 400 500異丙醇/l 3/4 V 75 150 225 300 450 600 75070%

6、乙醇/l 3/4 V 75 150 225 300 450 600 750TE/l 200 200 200 200 200 200 200所需離心管規格1.5 ml 1.5 ml 或者2 ml血液體積/ml 1 V 2 4 6 8 10 15 20紅細胞裂解液/ml 2.5 V 5 10 15 20 25 37.5 50Buffer CS/ml 1/4 V 0.5 1 1.5 2 2.5 3.75 5Buffer CL/ml 1/2 V 1 2 3 4 5 7.5 10異丙醇/ml 3/4 V 1.5 3 4.5 6 7.5 11.25 1570%乙醇/ml 3/4 V 1.5 3 4.5 6

7、 7.5 11.25 15TE/ml 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.5 2所需離心管規格15 ml 15 ml 或者50 ml(二)從100 l-1 ml抗凝全血中提取基因組DNA（以400 l血液處理量為例）實驗準備：第一次使用前將試劑盒攜帶的Proteinase K 全部加入Buffer CS，4保存。準備1 個合適大小的離心管：100-750 l 血液可使用1.5ml 離心管，750-1000 l 可使用2ml 離心管。1. 設血液體積為1V，根據血液體積選擇方法A、B 或C 分離白細胞：在極少的情況下沉淀可能會很松弛，應緩慢倒棄上清，以免丟棄沉淀。未充分抗凝的血液加入紅細胞裂

8、解液后，有可見的血凝塊，在操作步驟4 結束后繼續操作步驟4+。A. 100-400 l 血液在1.5 ml 離心管中加1V 血液和2.5V 紅細胞裂解液，翻轉混合5 次；10,000×g 離心20 秒，緩慢倒棄上清；繼續操作步驟2。B. 400-750 l 血液B1. 在1.5 ml 離心管加1V 血液和1 V 紅細胞裂解液，翻轉混合5 次；10,000×g 離心20 秒，緩慢倒棄上清；B2. 加入1.5 V 紅細胞裂解液，Vortex 震蕩5 秒混合均勻，10,000×g 離心20 秒，緩慢倒棄上清。繼續操作步驟2。C. 750-1000 l 血液C1. 在2

9、ml 離心管加1V 血液和1 V 紅細胞裂解液，翻轉混合5 次；10,000×g 離心20 秒，緩慢倒棄上清；C2. 加入1.5 V 紅細胞裂解液，Vortex 震蕩5 秒混合均勻，10,000×g 離心20 秒，緩慢倒棄上清。繼續操作步驟2。2. 將離心管倒置在干凈的吸水紙上2 min(確保沉淀在管中)；或者簡短離心，吸除殘留的離心上清(勿吸除沉淀)。以下操作步驟以400 l血液處理量為例3. 加入100 l Buffer CS(已加入Proteinase K)，Vortex 震蕩或者用Tips 充分懸浮沉淀。充分懸浮沉淀至無可見塊狀細胞團，不然會影響裂解效果。4. 加入

10、200 l Buffer CL，Vortex 10 秒或者劇烈搖晃20 次混合均勻，置于65水浴10 min。隨著蛋白降解，溶液由淺紅色變為淺黃綠色。4+. 離心去除血凝塊(可選)：10,000×g 離心1 min，將離心上清轉移到干凈的離心管，繼續操作步驟5。5. 加入300 l 100%異丙醇，緩慢翻轉20 次混合均勻(充分混合后應出現絲狀或簇狀凝集塊)。充分混合前，DNA 為溶解狀態，應避免劇烈操作而打斷DNA。6. 10,000×g 離心3 min，緩慢倒棄上清。在極少的情況下沉淀可能會很松弛，應緩慢倒棄上清，以免丟棄沉淀。7. 加入300 l 70%乙醇，渦旋振蕩

11、5 秒，10,000×g 離心3 min，緩慢倒棄上清。8. 重復操作步驟7。9. 簡短離心，仔細吸除殘留的乙醇(勿吸除沉淀)。室溫放置10 min 或者37放置5 min 揮發乙醇。乙醇會影響后續的酶反應，需要盡可能揮發完全；但需要避免長時間放置，完全干燥DNA 沉淀，因為完全干燥的DNA很難溶解。干燥至DNA 沉淀為半濕潤狀態，無酒精味，效果最佳。10. 加入200 l TE，低速Vortex 震蕩5 秒，65水浴10-60 min 溶解DNA，間斷輕彈離心管底部；或者65水浴過夜。至少需要200 l TE 才能完全溶解DNA。此時DNA 為溶解狀態，應避免劇烈操作而打斷DNA。

12、(三)從110 ml抗凝全血中提取基因組DNA（以10 ml血液處理量為例）實驗準備：第一次使用前將試劑盒攜帶的Proteinase K 全部加入Buffer CS，4保存。1 個干凈的15 ml 離心管，65水浴，100%異丙醇，70%乙醇。1. 設血液體積為1V，根據血液體積選擇方法A、B 或C 分離白細胞：在極少的情況下沉淀可能會很松弛，應緩慢倒棄上清，以免丟棄沉淀。未充分抗凝的血液加入紅細胞裂解液后，有可見的血凝塊，在操作步驟4 結束后繼續操作步驟4+。A. 1-4ml 血液在15 ml 離心管中加入1V 血液和2.5 V 紅細胞裂解液翻轉混合5 次；2000×g 離心5 m

13、in，緩慢倒棄上清；繼續操作步驟2。B. 4-7.5 ml 血液B1. 在15 ml 離心管加入1V 血液和1 V 紅細胞裂解液，翻轉混合5 次；2000×g 離心5 min，緩慢倒棄上清；B2. 加入1.5 V 紅細胞裂解液，Vortex 震蕩10 秒混合均勻，2000×g 離心5 min，緩慢倒棄上清。繼續操作步驟2。C. 7.5-10 ml 血液C1. 在15 ml 離心管中加入4 ml 血液，再加入2.5 倍離心管中血液體積的紅細胞裂解液，翻轉混合5 次；2000×g 離心5 min，緩慢倒棄上清；C2. 再次加入4 ml 血液，再加入2.5 倍離心管中血

14、液體積的紅細胞裂解液，Vortex 震蕩10 秒混合均勻，2000×g 離心5 min，緩慢倒棄上清。C3. 重復步驟C3，直至處理完所有血液。繼續操作步驟2。2. 將離心管倒置在干凈的吸水紙上2 min(確保沉淀在管中)；或者簡短離心，吸除殘留的離心上清(勿吸除沉淀)。以下操作步驟以10 ml血液處理量為例3. 加入2.5 ml Buffer CS(已加入Proteinase K)，Vortex 震蕩或者用Tips 充分懸浮沉淀。充分懸浮沉淀至無可見塊狀細胞團，不然會影響裂解效果。4. 加入5 mlBuffer CL，Vortex 10 秒或者劇烈搖晃20 次混合均勻，置于65水浴

15、30 min。隨著蛋白降解，溶液由淺紅色變為淺黃綠色。4+. 離心去除血凝塊(可選)：2,000×g 離心3 min，將離心上清轉移到干凈的離心管，繼續操作步驟5。5. 加入7.5 ml 100%異丙醇，緩慢翻轉20 次混合均勻(充分混合后應出現絲狀或簇狀凝集塊)。充分混合前，DNA 為溶解狀態，應避免劇烈操作而打斷DNA。6. 2,000×g 離心3 min，緩慢倒棄上清。在極少的情況下沉淀可能會很松弛，應緩慢倒棄上清，以免丟棄沉淀。7. 加入7.5 ml 70%乙醇，渦旋振蕩5 秒，2,000×g 離心3 min，緩慢倒棄上清。8. 重復操作步驟7。9. 將離

16、心管倒置在干凈的吸水紙上2 min(確保沉淀在管中)；或者簡短離心，仔細吸除殘留的離心上清(勿吸除沉淀)。室溫放置10 min 或者37放置5 min 揮發乙醇。乙醇會影響后續的酶反應，需要盡可能揮發完全；但需要避免長時間放置，完全干燥DNA 沉淀，因為完全干燥的DNA很難溶解。干燥至DNA 沉淀為半濕潤狀態，無酒精味，效果最佳。10. 加入1 ml TE，低速Vortex 震蕩5 秒，65水浴10-60 min 溶解DNA，間斷輕彈離心管底部；或者65水浴過夜。至少加入1/10 血液體積的TE 溶解DNA，而且TE 體積不可小于200 l。此時DNA 為溶解狀態，應避免劇烈操作而打斷DNA。

17、(四)從10-20 ml抗凝全血中提取基因組DNA（以20 ml血液處理量為例）實驗準備：第一次使用前將試劑盒攜帶的Proteinase K 全部加入Buffer CS，4保存。65水浴，100%異丙醇，70%乙醇。根據離心條件，選取合適體積的離心管：1 個50ml 離心管或者2 個15 ml 離心管。1. 設血液體積為1V，根據離心條件，選擇方法A、B、C 或者D 分離白細胞：在極少的情況下沉淀可能會很松弛，應緩慢倒棄上清，以免丟棄沉淀。未充分抗凝的血液加入紅細胞裂解液后，有可見的血凝塊，在操作步驟4 結束后繼續操作步驟4+。A. 使用1 個50 ml 離心管，濃縮有核細胞后分離白細胞：A1

18、. 將血液3000×g 離心15-20 min，吸除血漿，吸取中間白膜層細胞加入到50 ml 離心管中；A2. 在50 ml 離心管中加入1 V 紅細胞裂解液；Vortex 震蕩10 秒混合均勻，2000×g 離心5 min，緩慢倒棄上清；A3. 在50 ml 離心管中加入1.5 V 紅細胞裂解液，Vortex 震蕩10 秒混合均勻，2000×g 離心5 min，緩慢倒棄上清。繼續操作步驟2。B. 使用2 個15 ml 離心管，濃縮有核細胞后分離白細胞：B1. 將血液3000×g 離心15-20 min，吸除血漿，吸取中間白膜層細胞平均分裝2 個15ml

19、 離心管中；B2. 在2 個15 ml 離心管中各加入0.5 V 紅細胞裂解液。Vortex 震蕩10 秒混合均勻，2000×g 離心5 min，緩慢倒棄上清；B3. 在2 個15 ml 離心管中各加入0.75 V 紅細胞裂解液。Vortex 震蕩10 秒混合均勻，2000×g 離心5 min，緩慢倒棄上清。繼續操作步驟2。C. 使用1 個50 ml 離心管，分多次分離白細胞：C1. 在50 ml 離心管加入14 ml 血液，加入2.5 倍離心管中血液體積的紅細胞裂解液，翻轉混合5 次；2000×g 離心5 min，緩慢倒棄上清；如果起始血液體積14 ml，繼續操

20、作步驟2；C2. 再次加入14 ml 血液，再加入2.5 倍離心管中血液體積的紅細胞裂解液，Vortex 震蕩10 秒混合均勻；2000×g 離心5 min，緩慢倒棄上清；C3. 重復步驟C2，直至處理完所有血液。繼續操作步驟2。D. 使用2 個15 ml 離心管，分多次分離白細胞：D1. 在2 個15 ml 離心管分別加入4 ml 血液，再分別加入2.5 倍離心管中血液體積的紅細胞裂解液，翻轉混合5 次；2000×g 離心5 min，緩慢倒棄上清；D2. 再次分別加入4 ml 血液，再分別加入2.5 倍離心管中血液體積的紅細胞裂解液，Vortex 震蕩10 秒混合均勻；2

21、000×g 離心5 min，緩慢倒棄上清；D3. 重復步驟D2，直至處理完所有血液。繼續操作步驟2。2. 將離心管倒置在干凈的吸水紙上2 min(確保沉淀在管中)；或者簡短離心，吸除殘留的離心上清(勿吸除沉淀)。以下操作步驟以20 ml血液處理量為例3. 在50 ml 離心管中加入5 ml Buffer CS(已加入Proteinase K)，Vortex 震蕩或者用Tips 充分懸浮沉淀。或者在2 個15 ml 離心管中分別加入2.5 ml Buffer CS(已加入Proteinase K)，Vortex 震蕩或者用Tips 充分懸浮沉淀。充分懸浮沉淀至無可見塊狀細胞團，不然會影響裂解效果。4. 在50 ml 離心管中加入10 ml Buffer CL，Vortex 10 秒或者劇烈搖晃20 次混合均勻，置于65水浴30 min。或者在2 個15 ml 離心管中分別加入5 ml Buffer CL，Vortex 10 秒或者劇烈搖晃20 次混合均勻，置于65水浴30 min。隨著蛋白降解，溶液由淺紅色變為淺黃綠色。4+. 離心去除血凝塊(可選)：2,000×g 離心3 min，將離心上清轉移到干凈的離心管，繼續操作步驟5。5. 在50 ml 離心管中加入15 ml 100%異丙醇，緩