1、人硫酸褪黑色素(MS)ELISA快速檢測試劑盒使用說明書本試劑盒僅供研究使用產品編號：CSB-E09110h檢測范圍： ng/ml-200 ng/ml最低檢測限： ng/ml特異性：本試劑盒可檢測人MS，且與其他相關物質無交叉反應。有效期：6個月預期應用：ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關生物液體中MS含量。說明 1試劑盒保存：-20（較長時間不用時）；2-8（頻繁使用時）。2濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。 3中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。4剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實驗結果造成任何影響。實驗原理本試劑

2、盒采用酶聯免疫直接競爭法檢測MS。微孔板上包被有抗MS抗體。加入MS標準品或樣品，然后加入生物素標記的MS。樣品中的MS、生物素標記MS與固相板上的抗MS抗體發生競爭結合。再向微孔中加辣根過氧化物酶標記的親和素，形成固相抗體-生物素化MS-親和素-HRP復合物。經加底物顯色后，隨著樣品中MS濃度的升高，顯色OD值呈逐漸下降的線性關系。試劑盒組成及試劑配制 1. 酶聯板(Assay plate )：一塊（96孔）。 2. 標準品（Standard）：2ml/瓶。3. 生物素標記MS：1×120l/瓶（1：100）。4. 辣根過氧化物酶標記親和素（HRP-Avidin ）：1&

3、#215;120l/瓶（1：100）。5. 生物素標記MS稀釋液（Biotin-MS Diluent）：1×10ml/瓶。6. 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。7. 底物溶液（TMB Substrate ）：1×10ml/瓶。8. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20 ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 9. 終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。需要而未提供的試劑和器材1. 標準規格酶標儀2. 高速離心機3. 電熱恒溫培養

4、箱4. 超聲清洗器5. 干凈的試管和Eppendof管6. 系列可調節移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，最好用多通道移液器7. 蒸餾水，容量瓶等標本的稀釋原則：首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當的稀釋倍數。只有稀釋至標準曲線的范圍內，檢測的結果才是準確的。稀釋的過程中，應做好詳細的記錄。最后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應再乘以“N”。標準品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 ng/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋200 ng/ml，100 ng/ml，50 ng/ml，25 ng

5、/ml，12.5 ng/ml，6.25 ng/ml，3.12 ng/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/ml，臨用前15分鐘內配制。如配制100 ng/ml標準品：取0.5ml（不要少于0.5ml）200 ng/ml的上述標準品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。生物素標記MS的稀釋原則：臨用前以生物素標記MS稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100l），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10l生物素標記MS加990l生物素標記MS稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋

6、原則：臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100l），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10l辣根過氧化物酶標記親和素加990l辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。濃洗滌液稀釋原則：臨用前用蒸餾水進行25倍稀釋。如有鹽析出，稀釋后水浴加溫助溶。操作步驟實驗開始前，請提前配置好所有試劑，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，先進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔不加任何溶液，

7、余孔分別加標準品或待測樣品50ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，然后在所有孔中加入50 ul 生物素標記MS(空白孔中不加）。盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。酶標板加上蓋或覆膜，37反應60分鐘（為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液）。2. 溫育后，棄去孔內液體，甩干，洗板3-5次，每次浸泡10秒，約200ul/每孔，甩干。3. 所有孔中加入50 ul辣根過氧化物酶標記親和素。盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。酶標板加上蓋或覆膜，37反應30分鐘。4. 按步驟2進行洗滌。5. 依序每孔加底物溶液90ul，37避光顯色（30分鐘內，一般10-15分鐘內，此時肉眼可見標準品

8、的后3-4孔有明顯的梯度藍色，前3-4孔顏色不明顯，即可終止）。6. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。7. 用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內進行檢測。注：1. 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數分鐘，以便試劑集中到管底。2. 每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。 3. 為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板

9、加上蓋或覆膜。4. 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8保存。5. 建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。洗板方法ml注入孔內，浸泡1-2分鐘。根據需要，重復此過程數次。自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。計算以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。 注意事項1. 當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。2. 洗滌過程非常重要，不充分