1、基因工程復(fù)習(xí)題及參考答案基因工程復(fù)習(xí)題及參考答案好好學(xué)習(xí)、天天向上1、什么是移動(dòng)基因？移動(dòng)基因又叫轉(zhuǎn)位因子（transposable elements），它可以從染色體基因組上的一個(gè)位置轉(zhuǎn)移到另一個(gè)位置，甚至在不同的染色體之間躍遷，也有稱跳躍基因。（或控制因子、結(jié)合解離因子）2、什么是斷裂基因？在編碼序列中間插入無編碼作用的堿基序列，從而使一個(gè)基因被分隔成不連續(xù)的若干區(qū)段的基因，這類基因被稱為間隔或斷裂基因。3、什么是假基因？是一種核苷酸序列同其相應(yīng)的正常功能基因基本相同，但卻不能合成出功能蛋白質(zhì)的失活基因。在真核生物中是很普遍存在，它形成的主要原因是小的堿基對(duì)缺失或插入以致不能正常編碼。4、

2、什么是重復(fù)基因？即在基因組中有多個(gè)拷貝的基因。在真核生物基因組中發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象，真核生物中的重復(fù)基因可以達(dá)到30%。重復(fù)基因主要是為了滿足生物體快速發(fā)育的需要。5、什么是重疊基因？即多個(gè)基因共用堿基對(duì)的基因。重疊方式有完全重合疊，也有部分重疊。6、什么是基因工程？對(duì)DNA的遺傳基因進(jìn)行體外操作，把不同來源的基因按照單元設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，重新構(gòu)成新的基因組合，再把它引入細(xì)胞中，構(gòu)成具有新的遺傳特性的生物。7、基因工程的主要研究?jī)?nèi)容？（1）從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中分離出帶有目的基因的DNA片段。（2）體外連接重組DNA分子。（3）重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞并增殖。（4）從大量的細(xì)胞群體中篩選獲得

3、了重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆。（5）從受體細(xì)胞克隆提取目的基因。（6）將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。8、核酸的凝膠電泳基本原理在直流電場(chǎng)中，帶電粒子向帶符號(hào)相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳。在電場(chǎng)中，推動(dòng)帶電質(zhì)點(diǎn)運(yùn)動(dòng)的力（F）等于質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷量（Q）與電場(chǎng)強(qiáng)度（E）的乘積。FQE。（1）核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)，是呈離子化狀態(tài)的，DNA和RNA的多核苷酸鏈可叫多聚陰離子。（2）當(dāng)核酸分子放置在電場(chǎng)中時(shí)，它就會(huì)向正電極的方向遷移。（3）由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，以同樣的速度向正電極方向遷移。（4）在一

4、定電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度（電泳的遷移率）取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。（5）分子量較小的DNA，比分子量較大的DNA，具有較緊密的結(jié)構(gòu)，其電泳遷移率較快，同時(shí)比同等分子量的松散型的開環(huán)DNA或線性DNA要快。9、脈沖電場(chǎng)凝膠電泳基本原理原由：隨著凝膠的濃度降低，凝膠的孔徑相應(yīng)變大，故原則上，可用低濃度的瓊脂糖凝膠分離高分子的DNA片段，但實(shí)驗(yàn)表明，即使?jié)舛葹?.1%0.2%的瓊脂糖凝膠，亦不能分離分子量大于750kb的DNA大分子，此時(shí)，凝膠十分脆弱。（1）脈沖電場(chǎng)凝膠電泳，可分離分子量高達(dá)107bp的DNA大分子。（2）在電場(chǎng)中，DNA分子可隨時(shí)調(diào)整其游動(dòng)的方向，以適應(yīng)凝膠孔隙的

5、無規(guī)則變化。（3）分子量較大的DNA需要更多次數(shù)更換其構(gòu)型和方位，以使其可以按新的方向游動(dòng)。故遷移速度要慢一些，從而達(dá)到分離超大分子量DNA的目的。10、核酸的分子雜交基本原理帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當(dāng)它們混合在一起時(shí)，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會(huì)退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)。如果彼此退火的核酸來自不同的生物有機(jī)體，如此形成的雙鏈分子叫雜種核酸分子。11、DNA印跡雜交技術(shù)有2個(gè)主要過程：（1）將待測(cè)定核酸分子通過一定的方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，即印跡（blotting）；（2）固定于膜上的核酸同位素標(biāo)記的探針在一定的溫度和離子強(qiáng)度下退火，即分子雜交過程。

6、該技術(shù)是1975年英國愛丁堡大學(xué)的E.M.Southern首創(chuàng)的，Southern印跡雜交故因此而得名。雜交流程：（1）待測(cè)核酸樣品的制備：制備待測(cè)DNA；DNA限制酶消化。（2）瓊脂糖凝膠電泳分離待測(cè)DNA樣品。（3）電泳凝膠預(yù)處理。（4）轉(zhuǎn)膜：細(xì)管虹吸印跡法；電轉(zhuǎn)移法；真空轉(zhuǎn)移法。（5）探針標(biāo)記。（6）預(yù)雜交（prehybridizafion）。（7）Southern雜交。（8）洗膜。（9）放射性自顯影檢測(cè)。12、RNA印跡雜交技術(shù)（1）RNA印跡雜交是一種檢測(cè)已固定在濾膜上的總RNA或mRNA特定靶序列的技術(shù)。（2）由于RNA分子不能同硝酸纖維素濾膜結(jié)合，故不能直接用于RNA的吸附轉(zhuǎn)移。

7、RNA轉(zhuǎn)移到疊氮化的或其他化學(xué)修飾的活性濾膜上，通過共價(jià)交聯(lián)作用而使它們永久地結(jié)合在一起。（3）DNA印跡技術(shù)由Southern于1975年創(chuàng)建，稱為Southern印跡技術(shù)。RNA印跡技術(shù)正好與DNA相對(duì)應(yīng)，故被趣稱為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)則被稱為western blot。13、Western 印跡雜交技術(shù)將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移并結(jié)合到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射性同位素125I標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)之抗體進(jìn)行反應(yīng)，這種技術(shù)叫Western blotting 。14、斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交技術(shù)是將被檢標(biāo)本點(diǎn)到膜上，烘烤固定，樣品加到孔中，在負(fù)壓下就會(huì)流到膜上呈

8、斑點(diǎn)狀或狹縫狀，再進(jìn)行雜交。15、菌落原位雜交是將細(xì)菌從一主平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋放出DNA，將DNA烘干固定于膜上與32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測(cè)菌落雜交信號(hào)、并與主平板上的菌落對(duì)位。16、組織原位雜交組織原位雜交簡(jiǎn)稱原位雜交，指組織或細(xì)胞的原位雜交，它與菌落原位雜交不同，菌落原位雜交需裂解細(xì)菌釋出DNA，然后進(jìn)行雜交，而原位雜交是經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交，因此原位雜交可以確定探針互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點(diǎn)具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。17、生物芯片的含義基因芯片是指采用原位合成或直接點(diǎn)樣的方法將大量的D

9、AN片段或寡核苷酸 片段以預(yù)先設(shè)計(jì)的方式排列在硅片、玻璃等介質(zhì)上形成微矩陣，待檢樣品用熒光分子標(biāo)記后，與微距陣雜交，通過熒光掃描機(jī)計(jì)算機(jī)分析即可獲得樣品中大量的基因序列及表達(dá)信息，以達(dá)到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的。18、生物芯片的種類一般可分為兩種類型：點(diǎn)印陣列、直接合成陣列。按載體材料分類：玻璃芯片、硅芯片、陶瓷芯片。按點(diǎn)樣方式分類：原位合成芯片、微距陣芯片（分噴點(diǎn)和針點(diǎn)）和電定位芯片。按DNA種類分類：寡核苷酸芯片和cDNA芯片。按用途分類：表達(dá)譜芯片、診斷芯片、指紋圖譜芯片、測(cè)序芯片和毒理芯片。三維芯片PNA芯片19、基因?qū)爰?xì)胞的常用方法（1）轉(zhuǎn)化：是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲

10、了來自另一細(xì)菌菌株的DNA ，而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳性改變的生命過程。提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫給體菌株，而接受轉(zhuǎn)化DNA的寄主菌株叫受體菌株。（2）感染：噬菌體進(jìn)入宿主細(xì)菌，病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞中繁殖就是感染（infection）。（3）轉(zhuǎn)染：重組的噬菌體DNA也可象質(zhì)粒DNA的方式進(jìn)入宿主菌，即宿主菌先經(jīng)過CaCl2，電穿孔等處理成感受態(tài)細(xì)菌再接受DNA，進(jìn)入感受態(tài)細(xì)菌的噬菌體DNA可以同樣復(fù)制和繁殖，這種方式稱為轉(zhuǎn)染（transfection）。20、什么是轉(zhuǎn)化21、什么是感染22、什么是轉(zhuǎn)染23、什么是基因組細(xì)胞內(nèi)遺傳信息的攜帶者染色體所包含的DNA總體稱為基因組。同一物種的基因組DNA含量總

11、是恒定的，不同物種間基因組大小和復(fù)雜程度則差異極大，一般講，進(jìn)化程度越高的生物體其基因組構(gòu)成越大、越復(fù)雜。24、Sanger 雙脫氧鏈終止法的原理（1）DNA的合成總是從5端向3'端進(jìn)行的。（2）DNA的合成需要模板以及相應(yīng)的引導(dǎo)核酸鏈。（3）DNA的合成過程中，在合成的DNA鏈的3' 末端，依據(jù)堿基配對(duì)的原則，通過生成新的3',5'磷酸二酯鍵，使DNA鏈合成，產(chǎn)生短的DNA鏈。（4）測(cè)序工作中，平行進(jìn)行四組反應(yīng)，每組反應(yīng)均使用相同的模板，相同的引物以及四種脫氧核苷酸；（5）在四組反應(yīng)中各加入適量的四種之一的雙脫氧核苷酸，使其隨機(jī)地接入DNA鏈中，使鏈合成終止，

12、產(chǎn)生相應(yīng)的四組具有特定長度的、不同長短的DNA鏈。（6）這四組DNA鏈再經(jīng)過聚丙烯酸胺凝膠電泳按鏈的長短分離開，經(jīng)過放射自顯影顯示區(qū)帶，就可以直接讀出被測(cè)DNA的核苷酸序列 。25、Maxam-Gilbert 化學(xué)修飾法原理（1）硫酸二甲酯(dimethylsulphate)是堿性化學(xué)試劑，能使DNA鏈中鳥嘌呤的N7和腺嘌呤的N6位發(fā)生甲基化，在中性PH環(huán)境中就能使糖苷鍵發(fā)生水解，并引起DNA鏈的斷裂。（2）肼(hydrazine)在堿性條件下，能特異性切割C和T。（3）1 mol/L的NaCl，只有C被特異性切割。如右圖所示：26、基因化學(xué)合成的方法（1）磷酸二酯法合成寡核苷酸（方法1）原理

13、：將2個(gè)在5 或3 各帶有適當(dāng)保護(hù)性基團(tuán)的脫氧單核苷酸連接起來，形成一個(gè)帶有磷酸二酯鍵的脫氧二核苷酸分子。化學(xué)合成的寡聚核苷酸鏈，可以通過逐步的縮合反應(yīng)得以延長。為保證向3 - 5方向，其他堿基必須保護(hù)和消除保護(hù)。（2）磷酸三酯法合成寡核苷酸（方法2）與磷酸二酯法一樣都使用了在單核苷酸的3或5端加保護(hù)基團(tuán)的做法以防在這兩個(gè)末端之間形成磷酸二酯鍵，但在磷酸三酯法中，參加縮臺(tái)反應(yīng)的單核苷酸是一種核苷3-單磷酸的衍生物。在它的磷酸分子上有一個(gè)羥基（POH）己經(jīng)帶上了適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基團(tuán)（通常是鄰氯苯基和對(duì)氯苯基），因此事實(shí)上已經(jīng)是一種磷酸二酯，而余下的另一個(gè)POH，仍具有反應(yīng)活性，可以同另一個(gè)帶有3-末端

14、保護(hù)基團(tuán)之單核苷酸的5-OH縮合形成具磷酸三酯鍵的二核苷酸分子。（3）固相亞磷酸三酯法合成寡核苷酸（方法3）第一步，脫三苯甲基作用。用酸處理法除去與核苷酸1的5OH基團(tuán)偶聯(lián)的保護(hù)基團(tuán)DMT。第二步，偶聯(lián)反應(yīng)。通過一種弱喊四唑的催化反應(yīng)，使加進(jìn)來的第二個(gè)核苷酸2同已附著在固相載體上的核苷酸1之暴露的5OH基縮合。第三步，封端反應(yīng)，由加入的乙酸酐激發(fā)的乙酰化作用沒反應(yīng)的OH封閉起來。第四步，氧化作用。在核苷酸1和2之間新形成的亞磷酸三酯鍵十分活躍：利用碘液催化作用，使之被氧化成為相當(dāng)穩(wěn)定的磷酸三酯鍵。這四個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán)周期。在下一個(gè)合成周期之前，要把附著在最后一個(gè)偶聯(lián)核苷酸上的二甲氧基三苯甲基（

15、DMT）移去，以保證它的5端OH基團(tuán)能夠暴露出來，同下一個(gè)活化的脫氧單核苷酸進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。DMT是一種顯色指示劑，所以它的釋放可以用來檢測(cè)偶聯(lián)反應(yīng)的效率。合成終止時(shí)，固相載體上攜帶著被完全保護(hù)的寡聚脫氧核苷酸，因此需要使它們有系統(tǒng)地去掉保護(hù)基團(tuán)，并從固相載體上釋放出來成為游離的寡核苷酸。用乙醇沉淀法純化這些寡核苷酸，再用凝膠電泳法使之進(jìn)一步純化，并同未完成的較短的片段分開，最后得到真正需要的產(chǎn)物。27、用寡核苷酸片段組裝基因的方式利用長的寡聚體能夠直接組裝成長度為15002000bp的基因；遺憾的是用這種辦法構(gòu)建的基因，其突變頻率相當(dāng)高。平均每隔500一800bp就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)突變。一種替代方法

16、是，把一個(gè)完整基因的全序列分解成少數(shù)幾個(gè)片段。然后分別組裝這些亞片段，經(jīng)克隆驗(yàn)正其序列結(jié)構(gòu)正確無誤之后，再應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的克隆技術(shù)。將這些亞片段基因的正確順療連接在一起，最后得到所需的基因序列。如右圖：28、寡核苷酸化學(xué)合成的實(shí)際用途（1）作為合成基因的元件。（2）作為核苷酸序列分析的引物。（3）作為核酸分子雜交的探針。（4）用于基因的定點(diǎn)誘變研究。（5）作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)的引物。（6）作為重組DNA連接構(gòu)件。29、基因的定點(diǎn)誘變與經(jīng)典誘變的區(qū)別體外特異性改變某個(gè)堿基的技術(shù)叫做定點(diǎn)誘變。經(jīng)典（古典）的方法是，用能夠修飾DNA分子的化學(xué)誘變劑或物理誘變劑處理生物體。經(jīng)典誘變特點(diǎn)：（1）經(jīng)受誘變劑處理的

17、生物體它的任何基因都有可能發(fā)生突變，而目的基目的突變頻率又可能相當(dāng)?shù)停虼送蛔凅w的篩選工作大。（2）即便分離到了具有期望表型的突變體，也無法證實(shí)突變確實(shí)就是發(fā)生在目的基因上。（3）無法知道究竟是在基因的什么部位發(fā)生了突變，是點(diǎn)突變還是片段插入等。30、盒式誘變、核苷酸引物誘變、PCR誘變的方法目前發(fā)展的定點(diǎn)誘變方法主要有：盒式誘變、核苷酸引物誘變、PCR誘變。（1）盒式誘變：是利用一段人工合成的具有突變序列的寡核苷酸片段，即所謂的寡核苷酸盒取代野生型基因中的相應(yīng)序列；這種誘變的寡核苷酸盒是由兩條合成的寡核苷酸組成。（2）核苷酸引物誘變：使用化學(xué)合成的含有突變堿基的寡核苷酸短片段作引物，啟動(dòng)單鏈

18、DNA分子進(jìn)行復(fù)制，隨后這段寡核苷酸引物便成為了新合成的DNA子鏈的一個(gè)組成部分，因此所產(chǎn)生出的新鏈便具有已發(fā)生突變的堿基序列。為了使目的基因的特定位置發(fā)生突變，所設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物的序列除了所需的突變堿基之外，其余的則與目的基因編碼鏈的特定區(qū)段完全互補(bǔ)。（3）PCR誘變：上述兩種方法，其誘受能力僅限于靶DNA區(qū)段的5末端。而有時(shí)也希望對(duì)靶DNA的中心部位進(jìn)行誘變，這就需要應(yīng)用PCR定點(diǎn)誘變法。有重組PCR定點(diǎn)誘變法和大引物誘變法。三種方法如下圖所示：盒式誘變核苷酸引物誘變重組PCR大引物誘變法31、 基因擴(kuò)增的含義答：（為一特異蛋白質(zhì)編碼的基因的拷貝數(shù)選擇性地增加而其他基因并未按比例增加的過

19、程。-網(wǎng)絡(luò)釋義）1、在體外應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechain reaction，PCR）技術(shù)合成的寡核苷酸引物，導(dǎo)致特定基因的拷貝數(shù)發(fā)生快速大量的擴(kuò)增。2、 通過體外DNA重組，將目的基因插入到高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體分子上并轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)募闹骷?xì)胞中，于是在體內(nèi)隨著載體分子的大量復(fù)制，目的基因的拷貝數(shù)也得到了有效的擴(kuò)增。3、在有些外界因子的脅迫下，真核生物的有關(guān)細(xì)胞被誘發(fā)產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)，從而導(dǎo)致相應(yīng)的保衛(wèi)基因產(chǎn)生明顯的擴(kuò)增。4、在生物的進(jìn)化過程中發(fā)生的基因加倍與擴(kuò)增，結(jié)果使相關(guān)的基因在基因組上聚集成簇。32、 PCR技術(shù)的基本原理答：PCR技術(shù)的基本原理：雙鏈DNA分子在臨近沸點(diǎn)的溫度

20、下加熱時(shí)便會(huì)分離成2條單鏈的DNA分子，然后DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTPs）合成新的DNA互補(bǔ)鏈。（特點(diǎn)：新合成DNA鏈的起點(diǎn)由引物決定。拷貝數(shù)為2n。）33、 PCR反應(yīng)的基本條件及其對(duì)PCR的影響答：1、PCR反應(yīng)的基本條件：引物、酶、dNTP、模板、Mg2+濃度； 2、PCR反應(yīng)的基本條件對(duì)PCR的影響：（1） 引物：引物特異性，PCR結(jié)果的特異性取決于引物的特異性，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小也是由特異引物限定的，引物的設(shè)計(jì)與合成對(duì)PCR的成功與否起著決定性的作用。引物濃度，當(dāng)PCR引物量太低，則產(chǎn)物量降低，會(huì)出現(xiàn)假陰性；引物濃度過高會(huì)促進(jìn)引物的錯(cuò)誤

21、引導(dǎo)非特異產(chǎn)物合成，還會(huì)增加引物二聚體的形成。非特異產(chǎn)物和引物二聚體也是PCR反應(yīng)的底物，與靶序列競(jìng)爭(zhēng)DNA聚合酶、dNTP底物，從而使靶序列的擴(kuò)增量降低，每條引物的濃0.11umol或10100pmol。 （2）耐熱DNA聚合酶：在PCR反應(yīng)中，每100ul反應(yīng)液中含1-2.5u TaqDNA聚合酶為佳；酶的濃度太低會(huì)使擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量降低；酶的濃度太高則會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。（3）三磷酸脫氧核苷酸（dNTP）：dNTP是DNA合成的基本原料，PCR反應(yīng)中dNTP含量太低，PCR擴(kuò)增產(chǎn)量太少、易出現(xiàn)假陰性；過高的dNTP濃度會(huì)導(dǎo)致聚合將其錯(cuò)誤摻入。一般認(rèn)為最適的dNTP濃度為50200umol/L

22、。（3）模板核酸：PCR可以以DNA或RNA為模板進(jìn)行核酸的體外擴(kuò)增。RNA的擴(kuò)增首先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后才能進(jìn)行PCR循環(huán)。（4）Mg2+：Mg2+濃度過低時(shí)，酶活力顯著降低；Mg2+濃度過過高時(shí)，通常會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的累積。通常Mg2+濃度范圍為0.5-2mmol/L；對(duì)于一種新的PCR反應(yīng)，可以用0.1-5mmol/L的遞增濃度的Mg2+進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)，選出最適的Mg2+濃度。在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜。34、 PCR技術(shù)的應(yīng)用方面答：1、核酸的基礎(chǔ)研究：基因組克隆 ；2、不對(duì)稱PCR制備單鏈DNA用于DNA

23、測(cè)序；3、反向PCR測(cè)定未知DNA區(qū)域；4、反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDNA；5、熒光定量PCR用于對(duì)PCR產(chǎn)物實(shí)時(shí)監(jiān)控；6、cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)；7、檢測(cè)基因的表達(dá)；8、在醫(yī)學(xué)方面：檢測(cè)細(xì)菌、病毒類疾病；診斷遺傳疾病；診斷腫瘤；應(yīng)用于法醫(yī)物證學(xué)等。35、什么是DNA遷移率變動(dòng)試驗(yàn)答：DNA遷移率變動(dòng)試驗(yàn)(DNA mobility shift assay，EMSA)，又叫凝膠阻滯(gel retardation)試驗(yàn)，是一種體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的特殊的凝膠電泳技術(shù)。36、 凝膠阻滯試驗(yàn)的原理答：凝膠阻滯試驗(yàn)的原理：

24、在凝膠電泳中，由于電場(chǎng)的作用，小分子DNA片段比其結(jié)合了蛋白質(zhì)的DNA片段向陽極移動(dòng)的速度快，因此，可標(biāo)記短的雙鏈DNA 片段，將其與蛋白質(zhì)混合后，對(duì)混合物進(jìn)行凝膠電泳，若目的DNA與特異性蛋白質(zhì)結(jié)合其向陽極移動(dòng)的速度受到阻滯，對(duì)凝膠進(jìn)行放射性自顯影，就可找到DNA結(jié)合蛋白。將該實(shí)驗(yàn)改進(jìn)，DNA 與更多的蛋白結(jié)合移動(dòng)速度進(jìn)一步減慢，這種方法又稱超級(jí)遷移率變動(dòng)試驗(yàn)(supershiftassay)。37、 DNase 足跡試驗(yàn)的原理答：DNase足跡試驗(yàn)的原理為：蛋白結(jié)合在DNA 片段上保護(hù)結(jié)合部位不被DNase破壞，這樣蛋白質(zhì)在DNA片段上留下了足跡在電泳凝膠的放射性自顯影圖片上相應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)

25、合的部位沒有放射性標(biāo)記條帶。38、 基因工程操作的基本條件答：基因工程操作的基本條件：1、用于核酸操作的工具酶；2、用于基因克隆的載體；3、用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞。39、 什么是RNase、DNase答：RNase叫做核糖核酸酶，是專門水解斷裂RNA分子的酶。DNase叫做脫氧核糖核酸酶，是特異斷裂DNA分子的酶。通過切割相鄰的兩個(gè)核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵，從而導(dǎo)致核酸分子多核苷酸鏈發(fā)生水解斷裂的蛋白酶叫做核酸酶。40、 影響核酸內(nèi)切限制酶活性的因素答：核酸內(nèi)切限制酶，是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某些特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。它主要從原核生物中分離純化出來

26、的。影響核酸內(nèi)切限制酶活性的因素：1、DNA的純度；2、DNA的甲基化程度；3、酶切消化反應(yīng)的溫度；4、DNA的分子結(jié)構(gòu)；5、溶液中離子濃度及種類；6、緩沖液的pH值。41、 DNA連接酶的特性答：能催化在2條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶叫DNA連接酶。DNA連接酶的特性：1、DNA連接酶并不直接連接兩條單鏈的DNA分子，或環(huán)化單鏈DNA分子。2、是封閉雙螺旋DNA骨架上的缺口，而不是封閉裂口。3、DNA連接酶的來源：由大腸桿菌染色體編碼的叫DNA連接酶；由大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼的叫做T4DNA連接酶。4、連接酶的最佳反應(yīng)溫度為37 ，但粘性末端之間的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的，只有幾個(gè)堿基配

27、對(duì)，一般認(rèn)為415 比較合適。方法1：用DNA連接酶連接具有互補(bǔ)粘性末端的DNA片段。方法2：用T4DNA連接酶直接將平末端的DNA片段連接，或是用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給具平末端的DNA片段加上poly(dA)-poly(dT)尾巴之后，再用DNA連接酶將它們連接起來。方法3：先在DNA片段末端加上化學(xué)合成的接頭，使之形成粘性末端后，再用DNA連接酶將它們連接起來。三種方法的共同點(diǎn)是：利用DNA連接酶所具有的連接和封閉單鏈DNA的功能。42、 平末端的連接的方法答：DNA連接酶不具備催化連接平末端的DNA片段，除非DNA十分稠密。T4DNA連接酶除DNA連接酶的性質(zhì)外，在ATP和高濃度酶的作用

28、下，能連接具有完全堿基配對(duì)的平末端的DNA分子，但目前機(jī)制不清楚。平端連接的效率是比較低的，一般通過提高DNA的濃度或增加連接酶的用量可提高平端的連接效率，有時(shí)也可采取在平端加上合成的接頭的方法，產(chǎn)生粘性末端，也可以提高連接的效率。主要有：方法一：同聚物加尾法（利用核酸外切酶處理后，再在末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶（能將dNTP加在DNA單鏈延伸末端的3端的-OH上，其特點(diǎn)不需要模板的存在）的作用下，在一端只有一種堿基存在下形成同類型的尾巴（長度可達(dá)100bp，一般在1040bp）方法二：銜接物連接法（用化學(xué)方法合成的由1012bp組成有具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的平末端的DNA片段，再連接。）方法三：

29、DNA接頭連接法。43、 什么是LCR答：連接酶鏈反應(yīng)(Ligase chain reaction，LCR)，是一種新的DNA體外擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)，主要用于點(diǎn)突變的研究及靶基因的擴(kuò)增。44、 DNA聚合酶的特點(diǎn)答：DNA聚合酶的特點(diǎn)： 1、以脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)為前體催化合成DNA； 2、需要模板和引物的存在； 3、不能起始合成新的DNA鏈； 4、催化dNTP加到生長中的DNA鏈的3'-OH末端； 5、催化DNA合成的方向是5'3'。 （T4DNA聚合酶與大腸桿菌DNA聚合酶相比的特點(diǎn)：1、它無5'3'外切酶活性； 2、它需要一條有引物的單鏈DNA

30、作模板。T4 噬菌體DNA 聚合酶與Klenow 酶相似：但3'-5' 外切活性強(qiáng)200 倍，且不從單鏈DNA模板上替換引物，因此在誘變反應(yīng)中更有用，誘變率約提高1 倍。Taq DNA聚合酶：是一個(gè)耐熱DNA聚合酶，具有5'3'聚合酶活性和雙鏈DNA特異性的5'3'外切酶活性。）45、 磷酸酶的作用答：磷酸酶的作用是：將DNA末端中的5-端磷酸基除去，使其5-端變成了OH基。該酶有2個(gè)主要的用途：一是將載體末端的磷酸基除掉，避免在DNA重組時(shí)載體分子的自我連接；另一用途就是和T4多聚核苷酸激酶聯(lián)用，用于DNA的末端標(biāo)記。46、 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移

31、酶的作用答：末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶作用：在DNA載體和cDNA末端加互補(bǔ)同聚物尾巴或3末端標(biāo)記。（分離自小牛的胸腺，該酶催化將dNTP重復(fù)添加到一個(gè)DNA鏈的3-OH末端；核苷酸的聚合不依賴于模板。）47、 載體的功能答：載體的功能：1、運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞；2、 為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力；3、 為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供條件。48、 載體應(yīng)具備的條件答：載體應(yīng)具備的條件：1、具有對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）；2、具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)；3、長度盡可能小，以提高其載裝能力；4、具有多種單一的酶切位點(diǎn)；5、具有合適的選擇性標(biāo)記。49、 質(zhì)粒的一般生物

32、學(xué)特性答：（1）自主復(fù)制性：質(zhì)粒DNA含有自己的復(fù)制起始點(diǎn)以及控制復(fù)制頻率的調(diào)控元件，即復(fù)制子（replicon）結(jié)構(gòu)，使質(zhì)粒DNA能夠擺脫宿主染色體DNA復(fù)制調(diào)控系統(tǒng)而進(jìn)行自主復(fù)制（autoreplication）。（2） 不相容性：具有相同或相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)及特征的兩種不同質(zhì)粒不能穩(wěn)定地存在于同一受體細(xì)胞內(nèi)，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性(incompatibility)。（3） 轉(zhuǎn)移性：在天然條件下，很多質(zhì)粒可以通過細(xì)菌接合作用從一個(gè)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)移(transferability)到另一個(gè)宿主細(xì)胞，甚至另一種親緣關(guān)系較近的宿主菌。（4）選擇標(biāo)記：編碼產(chǎn)物賦予細(xì)菌某些性狀特征（5）可自行丟失與消除

33、。50、堿變性法提取質(zhì)粒DNA的基本原理答：1、染色體DNA 分子量比較大，在堿性環(huán)境中（高 pH）變性，雙鏈解拆開，抽提時(shí)由于機(jī)械剪切力的作用，環(huán)狀斷裂成線狀，當(dāng)pH 恢復(fù)中性時(shí)，無法恢復(fù)成環(huán)狀，就呈網(wǎng)狀與蛋白質(zhì)一起通過離心沉淀下來。2、質(zhì)粒DNA 分子量小，在堿性環(huán)境中（高pH），雙鏈解旋，但不拆開，當(dāng)pH恢復(fù)中性時(shí)，恢復(fù)成環(huán)狀。由于分子量小，所以離心沉淀時(shí)，不下沉，保留在上清溶液中。51、 如何對(duì)含有Ampr Tetr和Ampr Tets轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選答：采用環(huán)絲氨酸富集法對(duì)含有Ampr Tetr和Ampr Tets轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。具體操作：1、將轉(zhuǎn)化混合物涂布在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基

34、上，37°C培養(yǎng)12h；2、取上述培養(yǎng)基，挑取單一菌落（含有Ampr）于含有氨芐青霉素的培養(yǎng)液中搖菌培養(yǎng)適宜時(shí)間，取適量菌液涂布于含四環(huán)素和環(huán)絲氨酸的選擇培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12h，長出的菌落即為含有Ampr Tets的轉(zhuǎn)化子。原理：1、四環(huán)素通過抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，迫使細(xì)胞停止生長，但不會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌死亡（抑菌性抗生素）； 2、氨基酸的類似物：環(huán)絲氨酸，如果在細(xì)胞分裂生長過程中參入到新合成的蛋白質(zhì)多肽鏈，將導(dǎo)致細(xì)菌死亡。結(jié)果：1、在四環(huán)素培養(yǎng)基中：環(huán)絲氨酸能殺死生長的Tet r細(xì)胞，環(huán)絲氨酸不能殺死生長的Tet s細(xì)胞 ；2、Tet r基因內(nèi)插入外源DNA，成為Tet s

35、，進(jìn)入大腸桿菌，環(huán)絲氨酸處理，Tet s細(xì)胞數(shù)明顯上升，得到富集。（四環(huán)素Ter、氨芐青霉素Amp，若質(zhì)粒對(duì)氨芐青霉素有抗性-Ampr）52、 質(zhì)粒載體不穩(wěn)定性的類型答：1、結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定：由轉(zhuǎn)位作用和重組作用所引起的質(zhì)粒DNA的重排與缺失。 2、分離的不穩(wěn)定：在細(xì)胞分裂過程中，有一個(gè)子細(xì)胞沒有獲得質(zhì)粒DNA拷貝，并最終增殖成為無質(zhì)粒的優(yōu)勢(shì)群體。53、 pUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子篩選的機(jī)制答：pUC質(zhì)粒載體是在PBR322質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上，組入一個(gè)在其5-端帶有一段多克隆位點(diǎn)的lacZ基因，能水解乳糖的結(jié)構(gòu)類似物：5溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷（x-gal，無色），但當(dāng)它被lacZ的基因產(chǎn)物水解后形成游離

36、的5'溴-4-氯吲哚，這種化合物在中性pH下呈藍(lán)色所以凡接受pUC18/19質(zhì)粒的大腸桿菌菌落均呈藍(lán)色。54、 什么是穿梭質(zhì)粒答：穿梭質(zhì)粒是指一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇記號(hào)，因而可在兩種不同寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。由于這類質(zhì)粒載體可以攜帶著外源DNA序列在不同物種的細(xì)胞之間，特別是在原核和真核細(xì)胞之間往返穿梭，故稱穿梭質(zhì)粒。55、 什么是噬斑答：一個(gè)空斑系由一個(gè)噬菌體復(fù)制增殖并裂解細(xì)菌后形成，稱為噬斑(plaque)，不同噬菌體噬斑的形態(tài)與大小不盡相同。56、 噬菌體的溶菌生命周期答：1、吸附：吸附于大腸桿菌外膜上的受體（正常功能是運(yùn)轉(zhuǎn)麥芽糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)），麥芽糖

37、可誘導(dǎo)這些受體的合成，故它也可促進(jìn)噬菌體的吸附與感染（尾部吸附）。2、 注入：吸附之后，線狀DNA通過尾部的管道被注入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，堿基配對(duì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。3、合成：從單一ori區(qū)滾筒復(fù)制，形成線狀多聯(lián)體，DNA上兩個(gè)基因的產(chǎn)物激活復(fù)制的起始，但復(fù)制所需的蛋白因子系統(tǒng)則由宿主細(xì)胞提供。4、組裝：包裝蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)合成，包裝蛋白首先結(jié)合在cos區(qū)的附近，形成包裝啟動(dòng)復(fù)合物，因此cos區(qū)對(duì)包裝是至關(guān)重要的。5、釋放：每個(gè)細(xì)胞內(nèi)容納了多達(dá)100個(gè)成熟的噬菌體，這時(shí)兩種負(fù)責(zé)裂解宿主細(xì)胞的蛋白被合成，細(xì)菌細(xì)胞被裂解，成熟的噬菌體釋放出去，又去感染另外的宿主細(xì)胞，直至大腸桿菌細(xì)胞全部被裂解。57、什么是

38、COS末端答：COS末端即為粘性末端，指基因組DNA其兩端的5末端帶有12 個(gè)堿基的互補(bǔ)單鏈（12 個(gè)堿基的序列為5-GGGCGGCGACCT-3）。58、 什么是原噬菌體答：進(jìn)入細(xì)菌的DNA可整合(integrate）入細(xì)菌的染色質(zhì)DNA中，隨細(xì)菌染色體DNA復(fù)制，傳給細(xì)菌后代，這個(gè)穩(wěn)定潛伏在細(xì)菌染色質(zhì)DNA中的DNA稱為原噬菌體(prophage)、前噬菌體。（DNA的整合是可逆的，原噬菌體可從宿主DNA中切出，進(jìn)入溶菌性方式的繁殖。）59、 什么是溶源菌答：含有原噬菌體的細(xì)菌稱為溶源菌(lysogen)。61、體外包裝：重組DNA分子在加入含有完成噬菌體包裝所需的所有蛋白質(zhì)的細(xì)菌細(xì)胞抽提

39、物時(shí)，它們能被組裝成噬菌體顆粒，此過程叫做體外包裝 。62、-DNA 作為載體的優(yōu)點(diǎn)-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效感染大腸桿菌；-DNA作為載體，其裝載外源DNA的能力為23kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量；重組-DNA的篩選較為方便 ；重組-DNA分子的提取比質(zhì)粒容易。63、柯斯質(zhì)粒：是含有 -DNA兩端cos區(qū)的質(zhì)粒，是用正常的質(zhì)粒同噬菌體的cos位點(diǎn)構(gòu)成。64、 柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)1、具有噬菌體的特性：（1）重組外源片段后，在體外包裝成噬菌體顆粒，可以高效轉(zhuǎn)入寄主細(xì)胞大腸桿菌；（2）重組柯斯質(zhì)粒載體進(jìn)入細(xì)胞后能環(huán)化；但由于不含有噬菌體的全部必要基因，不能通過溶菌周期形成子代噬菌體。2

40、、具有質(zhì)粒載體的特性：（1）具有質(zhì)粒復(fù)制子，能夠象質(zhì)粒一樣在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制；（2）在氯霉素的作用下進(jìn)一步擴(kuò)增；（3）具有抗菌素抗性標(biāo)記或基因插入失活的克隆位點(diǎn)。3、具有高容量的克隆能力：（1）由于是質(zhì)粒+cos位點(diǎn)，其分子量較小，一般為57Kb；（2）插入外源片段能力大（上表中數(shù)據(jù)表明）。4、具有與同源序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力。65、 M13-DNA 作為載體的優(yōu)點(diǎn)及用途1、最為顯著的優(yōu)點(diǎn)是它能使插入的外源DNA片段變成單鏈，單鏈DNA的用途：（1）用于雙脫氧末端終止測(cè)定DNA順序（2）用于單鏈DNA的定點(diǎn)誘變（3）用于合成探針2、篩選方便感染的受體細(xì)胞生長緩慢，形成渾濁圈，易于挑選辨認(rèn)而且重組分

41、子越大，渾濁圈的渾濁度亦越大，這樣可以直接辨認(rèn)哪些菌落含有的外源DNA片段，哪些含有小的。66、噬菌粒：是由單鏈?zhǔn)删wM13與質(zhì)粒載體重組而成的新型載體。它具有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、選擇性標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)等，方便DNA的操作，可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在；又具有單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起點(diǎn)，在輔助噬菌體的存在下，可進(jìn)行噬菌體的繁殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體。67、基因克隆的過程1、用于基因克隆的DNA材料的選擇以及DNA分子的片段化；2、外源DNA片段與載體分子的體外連接反應(yīng)；3、將人工重組的DNA分子導(dǎo)入它們能夠進(jìn)行正常復(fù)制的寄主細(xì)胞的程序；4、獲得了重組體分子的轉(zhuǎn)化子克隆的選擇或篩選。68、基因文庫：是含有某種生物體

42、全部基因的隨機(jī)片斷的重組DNA克隆群體。69、 蔗糖梯度離心分離 DNA 的原理蔗糖的最大密度是1.3g/cm3，離心分離密度大于1.3g/cm3的樣品，如DNA、RNA時(shí)會(huì)沉積在離心管的底部，從而與其他低密度的雜質(zhì)分離開。如要進(jìn)一步分離，需要使用密度比蔗糖大的介質(zhì)。重金屬鹽氯化銫(CsCl)是目前使用的最好的離心介質(zhì)，它在離心場(chǎng)中可自行調(diào)節(jié)形成濃度梯度，并能保持穩(wěn)定。在氯化銫形成的密度梯度中，離心管頂部的密度為:1.65g/cm3，底部為:1.75g/cm3。DNA的密度是1.70g/cm3，會(huì)停留在離心管的中部。70、 連接反應(yīng)的注意事項(xiàng) （1）阻止線性載體分子的自身環(huán)化（2）正確調(diào)整載體

43、分子和外源分子的比例（3）控制DNA的總濃度（4）注意溫度對(duì)連接反應(yīng)的影響。71、基因克隆的實(shí)驗(yàn)方案：是指主要內(nèi)容為cDNA基因克隆、基因組DNA克隆、基因定位克隆等基因克隆的操作方法和步驟。72、 cDNA 文庫的優(yōu)點(diǎn)(1)用RNA病毒可建立文庫；(2)因克隆數(shù)比基因組文庫少得多，易于篩選；(3)從分化特異的細(xì)胞的cDNA文庫中可分離到特異表達(dá)的基因。(4)建庫時(shí)已排除了其它的RNA，使假陽性率減低。73、 寡聚脫氧核苷酸引導(dǎo)法合成全長雙鏈 cDNA 的方案首先，第一鏈的合成，以mRNA為模板在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以oligo（dT）為引物dNTPs為底物合成cDNA，并用末端轉(zhuǎn)移酶在雜交雙鏈

44、的兩端增加粘性末端；然后，水解模板mRNA，堿性蔗糖梯度離心回收全長cDNA；最后，第二鏈的合成，以oligo（dG）為引物dNTPs為底物合成cDNA互補(bǔ)鏈形成雙鏈DNA分子。雙鏈合成后可通過同聚物加尾或加銜接物的辦法插入載體分子。74、基因組 DNA 克隆的方案基因組的克隆方案：PCR擴(kuò)增獲取全長基因組片段PCR產(chǎn)物純化回收根據(jù)基因組片段的大小及酶切位點(diǎn)的特征等選擇合適的連接載體（對(duì)于一些極大的基因組，如真核基因組可先通過機(jī)械破碎或酶切使之成為一定大小的片段）一般可通過頭銜物連接法或酶切法將基因片段連接到噬菌體（需進(jìn)行體外包裝形成具有高效感染性的噬菌體顆粒）或者質(zhì)粒上轉(zhuǎn)化進(jìn)入受體細(xì)胞利用特

45、殊噬菌斑或者氨芐青霉素抗性、Lac Z 基因的互補(bǔ)篩選進(jìn)行重組體篩選重組-DNA分子或質(zhì)粒的提取PCR技術(shù)進(jìn)行篩選確定將陽性重組體送往公司測(cè)序。完整的基因組文庫（ genomic library ）是含有某種生物體全部基因的隨機(jī)片段的重組 DNA 克隆群體，構(gòu)建文庫時(shí)先將基因組 DNA 通過機(jī)械剪切隨機(jī)打斷（使用hydroshear 或超聲波細(xì)胞粉碎儀）或酶切使之成為一定大小的片段，與適當(dāng)?shù)妮d體重組、克隆。例1：通過銜接物連接法在噬菌體上構(gòu)建基因組文庫。例2：用Sau3A限制酶消化真核基因組DNA在噬菌體載體上構(gòu)建基因組文庫。細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chrom

46、osomes， BAC， fosmids) 基礎(chǔ)：大腸桿菌F質(zhì)粒導(dǎo)入宿主：電轉(zhuǎn)化 載體篩選：顯性選擇標(biāo)記 供體DNA大小：>300kbp。主要應(yīng)用：大基因組分析 載體在每個(gè)細(xì)胞中維持一個(gè)或兩個(gè)拷貝，產(chǎn)生少量供體DNA。BAC 載體空載時(shí)大小約 7.5kb ，在大腸桿菌中以質(zhì)粒的形式復(fù)制，具有一個(gè)氯霉素抗性基因。外源基因組 DNA 片段可以通過酶切、連接克隆到 BAC 載體多克隆位點(diǎn)上，通過電穿孔的方法將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌重組缺陷型菌株。裝載外源 DNA 后的重組質(zhì)粒通過氯霉素抗性和Lac Z 基因的 互補(bǔ)篩選。75、 定位克隆：通過遺傳標(biāo)記 ，先獲得某一表型基因在染色體上的定位 ，再在

47、候選區(qū)域內(nèi)選擇已知基因 ，進(jìn)行致病突變的篩選 ，并獲得cDNA及全基因。76、提高探針的特異性的方法1、選基因的特異序列為探針；2、長度不低于1720nt；3、控制退火溫度。77、應(yīng)用差別雜交法分離克隆的目的片段的方案首先，從表達(dá)目的基因的細(xì)胞中提取mRNA分別制備帶有放射標(biāo)記的cDNA探針和反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，合成得到雙鏈DNA后重組到載體上轉(zhuǎn)染E.coli構(gòu)成cDNA文庫；然后，從不表達(dá)目的基因的細(xì)胞中提取mRNA制備帶有放射標(biāo)記的cDNA探針；最后，將影印有E.coli菌落的NC膜分別與兩種帶有放射標(biāo)記的cDNA探針進(jìn)行雜交，對(duì)比找到具有差別的菌落雜交單位作為可能的克隆目的片段。78、基因的差別表達(dá)：在生物個(gè)體發(fā)育的不同階段、或是在不同的組織或細(xì)胞中發(fā)生的不同基因按時(shí)間、空間進(jìn)行有序的表達(dá)方式，叫做基因的差別表達(dá)。79、應(yīng)用 mRNA 差別顯示技術(shù)分離克隆的目的基因的原理以一種與mRNA的poly（A）結(jié)合的寡聚核苷酸序列作為錨定引物，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，形成mRNAcDNA的雜交分子。再加入另一短的隨機(jī)序列作為隨機(jī)引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。隨機(jī)引物可與反轉(zhuǎn)錄成的單鏈cDNA相結(jié)合，隨機(jī)進(jìn)行PCR，最后用聚丙烯酰胺凝膠顯示擴(kuò)增片段。80、為什么克隆基因需要選擇與鑒定因?yàn)椋ㄟ^克隆后形成的DNA分子可能包括以下類型：1、僅載體分子2、僅數(shù)個(gè)外源D