1、一、名詞解釋：共10題，每題2分，共20分。1. 基因: 是DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列，是遺傳物質的最小功能單位。2. 定位克隆: 獲取基因在染色體上的位置信息，然后采用各種方法對該基因進行定位和克隆3. 融合基因: 是指應用DNA體外重組技術構建的一類具有來自兩個或兩個以上的不同基因核苷酸序列的新型基因。4. 轉化子: 導入外源DNA后獲得了新遺傳標志的細菌細胞或其他受體細胞，又稱重組體。5. 人工接頭：是人工合成的具有一個或數個特定限制性內切酶識別和切割序列的雙股平端DNA短序列。6. RT-PCR: 是指以mRNA在反轉錄酶作用下合成cDNA第一鏈為模板進行的PCR。7

2、. ORF : 起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的連續的密碼子區域，是潛在的編碼區。8. MCS: 指載體上人工合成的含有緊密排列的多種限制核酸內切酶的酶切位點的DNA片段。9. gene targeting : 基因工程中利用活細胞染色體DNA可與外源DNA的同源性DNA序列發生重組的性質，來進行定點修飾改造染色體上某一目的基因的技術10. 5RACE: 是一種通過PCR進行cDNA末端快速克隆的技術，是以mRNA為模板反轉錄成cDNA第一鏈后用PCR技術擴增出某個特異位點到5端之間未知序列的方法。 四、簡答題：共4題，共20分。1簡述獲得目的基因常用的幾種方法。

3、（5分）答：（1）直接從染色體DNA中分離：（1分）僅適用于原核生物、葉綠體和線粒體基因的分離，較少采用。（2）人工合成：（1分）根據已知多肽鏈的氨基酸順序，利用遺傳密碼表推定其核苷酸順序再進行人工合成。適應于編碼小分子多肽的基因。（3）從mRNA合成cDNA：（1分）采用一定的方法釣取特定基因的mRNA，再通過逆轉錄酶催化合成其互補DNA（cDNA），除去RNA鏈后，再用DNA聚合酶合成其互補DNA鏈，從而得到雙鏈DNA。這一方法通常可得到可表達的完整基因。（4）利用PCR合成：（1分）如已知目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR

4、)技術，在體外合成目的基因。（5）從基因文庫中篩選：（1分）首先建立基因組或cDNA文庫，利用探針從文庫中篩選目的克隆。 2. 分子克隆載體應具備哪些特點？（4分）答：(1) 在宿主細胞內必須能夠自主復制（1分）(2) 必須具備合適的酶切位點，供外源DNA片段插入，同時不影響其復制（1分）(3) 有一定的選擇標記，用于篩選（1分）(4) 具有較高的拷貝數，便于載體的制備（1分） 3. cDNA文庫和基因組文庫的主要差別有哪些？（5分）答：（1）基因組文庫克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列；cDNA文庫克隆的是具有蛋白質產物的結構基因，包括調節基因。（2分）（2）基因

5、組文庫克隆的是全部遺傳信息，不受時空影響；cDNA文庫克隆的是不完全的編碼DNA序列，因它受發育和調控因子的影響。（1分）（3）基因組文庫中的編碼基因是真實基因，含有內含子和外顯子，而cDNA文庫克隆的是不含內含子的功能基因。（2分） 4. 某一質粒載體具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因內有一Bgl I的切點。現用Bgl I切割該載體進行基因克隆，問：(1)轉化后涂皿時應加什么樣的抗生素? (2)培養后長出的菌落具有什么樣的抗性基因型? (3)如何利用抗性變化篩選到含有插入片段的重組體? （6分）答：(1)加四環素；(2)TetrKans和TetrKanr；(3)重新點種

6、在含Tet、Kan和只加Tet的 平板上，選擇只在Tet平板上生長的菌落，即為所需的重組體。 五分析題  10分 科學家將人的生長素基因與大腸桿菌的DNA分子進行重組，并成功地在大腸桿菌中得以表達。過程如右圖所示，據圖回答：(1)人的基因之所以能與大腸桿菌的DNA分子進行重組，原因是什么？                     

7、0;                   (2)過程表示的是采取什么的方法來獲取目的基因？(3)檢測大腸桿菌B是否導入了質粒或重組質粒，可采用的方法和理由？(4)如果把已經導入了普通質粒A或重組質粒的大腸桿菌，放在含有四環素的培養基上培養，發生什么現象？分析原因？ 答:（1）人的基因與大腸桿菌DNA的組成成分相同，結構相同 (2分)(2) 反轉錄法(逆轉錄法) (2分)(3)將得到的大腸桿菌B涂布

8、在一個含有氨芐青霉素的培養基上，能夠生長的，說明已導入了質粒A或重組質粒，反之則沒有導入。   因為普通質粒A和重組質粒上都有抗氨芐青霉素基因 (2分)(4)有的能生長，有的不能生長   導入普通質粒A的細菌能生長，因為普通質粒A上有四環素抗性基因；導入重組質粒的細菌不能生長，因為目的基因正插在四環素抗性基因中，破壞了其結構和功能。(4分) 六、論述題：共1題，15分。1在基因工程操作過程中，使用的克隆載體需要具備哪些條件？選擇受體細胞時需要具備哪些基本原則？答：克隆載體需要具備條件：（7分）載體都能攜帶外源DNA片段(基因

9、)進入受體細胞，或停留在細胞質中自我復制，或整合到染色體DNA上，隨著染色體DNA的復制而同步復制。(1分)載體都具有合適的篩選遺傳標記。(1分)載體都具有供外源基因插入的限制性核酸內切酶位點，即多克隆位點。(1分)載體都必須是安全的，不應含有對受體細胞有害的基因，并且不會任意轉入除受體細胞以外的其他生物細胞，尤其是人的細胞。(1分)載體本身的分子量都比較小，可容納較大的外源基因片段。(1分)載體在細胞內的拷貝數要高，方便外源基因在細胞內大量擴增。(1分)載體在細胞內穩定性要高，保證重組體穩定傳代而不易丟失。(0.5分)載體的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。(0.5分) 

10、受體細胞的選擇應具備的基本原則：（8分）便于重組DNA分子的導入。(1分)便于重組體的篩選。根據所用的表達載體所含的選擇性標記與受體細胞基因是否相匹配，從而易于對重組體進行篩選。(1分)遺傳穩定性高，易于進行擴大培養或易于進行高密度發酵而不影響外源基因的表達效率。對動物細胞而言，所選用的受體細胞具有對培養的適應性強，可以進行貼壁或懸浮培養，可以在無血清培養基中進行培養。(1分)受體細胞內內源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表達產物在細胞內積累，可促進外源基因高效分泌表達。(1分)安全性高，無致病性，不會對外界環境造成生物污染。一般選用致病缺陷型的細胞或營養缺陷型細胞作為受體細胞。

11、(1分)能使重組DNA分子穩定存在于細胞中。從受體細胞的角度出發，通常的做法是是對其作適當的修飾改造，如選用某些限制性核酸內切酶缺陷型的受體細胞就可以避免其對重組DNA分子的降解破壞作用。(1分)受體細胞在遺傳密碼子的應用上無明顯偏倚性。(1分)具有較好的轉譯后加工機制等，便于真核目的基因的高效表達。(0.5分)在理論研究和生產實踐上有較高的應用價值。(0.5分)    基因工程原理復習題思考題基因工程緒論1、基因工程的定義與特征。定義：在體外把核酸分子（DNA的分離、合成）插入載體分子，構成遺傳物質的新組合（重組DNA），引入原先沒有這類分子的受體細胞

12、內，穩定地復制表達繁殖，培育符合人們需要的新品種（品系），生產人類急需的藥品、食品、工業品等。特征：1、具跨越天然物種屏障的能力。      2、 強調了確定的DNA片段在新寄主細胞中的擴增。2、試述基因工程的主要研究內容。1）、目的基因的分離2）、DNA的體外重組（載體、受體系統等）3）、重組DNA分子轉移到受體細胞及其篩選4）、基因在受體細胞內的擴增、表達、檢測及其分析。3、基因工程在食品工業上有何應用發展？主要是通過基因重組，使各種轉基因生物提高生產谷氨酸、調味劑、酒類和油類等有機物的產率；或者改良這些有機物組成成分，提高利用價

13、值。4、轉基因是一把雙刃劍，請客觀談談對轉基因及轉基因食品安全性的認識。轉基因技術所帶來的好處是顯而易見的，在人類歷史進步和發展中起到了積極作用。首先，通過該項技術可以提供人們所需要的特性，改良培育新品種；第二，延長食品保存時間或增加營養成分；第三，將抗蟲防菌基因轉入到作物中，使作物本身產生抵抗病蟲害侵襲的能力， 減少了農藥的使用量，有利于環境保護；第四，轉基因技術及基因食物在醫學方面得到廣泛研究和應用。人們對轉基因技術的主要擔憂在于環境方面。外源基因的導入可能會造就某種強勢生物， 產生新物種或超級雜草、損害非目標生物、破壞原有生物種群的動態平衡和生物多樣性，也即轉基因生物存在潛在的環境安全問

14、題。轉基因作物的大面積種植已有數年， 食用轉基因食品的人群至少有10億之多，但至今仍未有轉基因食品對生命造成危害的實例；更何況目前每一種基因工程食品在上市前，都要經過國家法律認可， 食品衛生部門和環境部門的嚴格檢測。只有測試合格了，才能投放市場。因此公眾完全可以安全地消費、大膽地食用轉基因食品。 第一章    DNA的分子特性與利用1、 原核生物和真核生物的基因表達調控有何差別？1）原核基因表達調控的三個水平：轉錄水平調控、翻譯水平調控、蛋白質加工水平的調控原核基因表達調控主要是在轉錄水平上的調控。2）真核生物基因表達的特點：l

15、60;       1基因組DNA存在的形式與原核生物不同；l        2真核生物中轉錄和翻譯分開進行；l        3基因表達具有細胞特異性或組織特異性；l        4真核基因表達的調控在多個水平上進行：DNA水平的調控、轉錄水平調控、轉錄后水平調控、翻譯水平調控、蛋白質

16、加工水平的調控；2、 什么是基因？根據基因的產物，基因可分為哪三類？基因是具有生物學功能的、在染色體上占據一定位置的一段核苷酸序列，是分子遺傳的功能單位。根據基因的產物，基因可分為三類：l       轉錄并翻譯編碼蛋白質的基因:  包括結構蛋白基因、編碼酶的基因、調節基因l       轉錄但不翻譯產物的基因:   包括tRNA、rRNAl    

17、0;  不轉錄但有功能的DNA區段:   如啟動子、操縱基因3、 引起核酸變性的因素主要有哪些？核酸變性后性質有何變化？引起核酸變性的因素：-溫度、酸、堿、甲醛和尿素等。DNA變性后，它的一系列性質發生變化，如紫外吸收(260 nm)值升高（增色效應）, 粘度降低等，如DNA增加2540%. RNA約增加1.1%。4、 DNA復性及其影響因素。變性DNA在適當的條件下，兩條彼此分開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結構，這一過程稱為復性。DNA復性的程度、速率與復性過程的條件有關，也與它本身的組成和結構有關：分子量越大復性越難。濃

18、度越大，復性越容易。（附加：注意：將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時，DNA不可能復性。但是將變性的DNA緩慢冷卻時，可以復性。復性的應用：核酸的雜交，分子擴增） 第二章    基因工程操作的基本技術1.         DNA凝膠電泳中核酸分子分離的機理。    在堿性環境下，核酸分子帶負電荷，在外加電場的作用下，分子在凝膠多孔性剛性濾孔中從負極向正極泳動，其中主要由于分子篩效應和電荷效應達到分離不同大小核酸分子的目

19、的。2.         DNA凝膠電泳中影響電泳遷移率的因素主要有哪些？1）分子本身的影響   Ø分子的大小：小則快   Ø帶電荷數：多則快   Ø分子構型：超螺旋>解螺旋2）電場：直流電場    Ø電壓高則快    Ø電壓太高則結果不準確常用35V/CM3）支持物介質 

20、  Ø種類：瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠   Ø凝膠濃度: 濃度大，篩孔小，適合小分子電泳；濃度小，篩孔大，適合大分子電泳4）電泳緩沖液   Ü pH值：偏堿性，帶負電荷   Ü 離子濃度：離子濃度高_ 電流大_發熱快_膠溶解   Ü種類：TAE、TBE、TPE、TNE3.         PCR的原理和主要反應過程，并

21、分析影響PCR擴增的影響因素。PCR原理：變性溫度下， DNA雙鏈變性雙螺旋解開成單鏈DNA，在退火溫度中人工合成的特異引物根據堿基互補配對原則與單鏈DNA特異結合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸溫度下不同的脫氧核苷酸按照堿基互補配對原則在引物的引導下合成與模板DNA互補的新鏈，實現DNA的擴增。影響PCR擴增的影響因素：§(1)Taq酶：常用1U/25µL            ³濃度低，擴增產物不夠；   &

22、#160;        ³濃度高，非特異性擴增增加；            ³酶的活性；§(2)dNTP的濃度：常用100-200µmol/L，不能低于20µmol/L，特異性、保真性；§(3)模板：主要考慮純度及使用量，對純度要求不高，但含有酚、氯仿等雜質則難以成功。使用量從幾個ng到100ng.§(4)引物濃度：0.1-0

23、.5µmol/L之間，過多則非特異擴增增加，形成引物二聚體；§(5)Mg2 濃度：常用 0.5-2.5mmol/L；      影響：酶的活性、引物-模板退火、特異性§(6)PCR反應程序設定：變性溫度和時間、引物退火溫度Tm與時間、引物延伸溫度與時間和循環數4.         PCR引物設計的原則，若給一指定DNA序列并需要通過PCR擴增此序列，如何設計擴增引物？（關于如何設計這個問題，靠自己了）引物設計原則：&

24、#160;         1、G C含量45-55%；          2、Tm值高于55；          3、引物特異性；          4、引物擴增跨度；   &#

25、160;      5、是否形成引物二聚體5.         定量PCR的原理？Ct值的含義。原理：通過實時檢測PCR每一個循環擴增產物相對應的熒光信號，來實現對起始模板進行定量及定性的分析。初始模板量X0的對數值與C(T) 值之間呈線性關系：log X0= - log(1 Ex) *Ct log N            &

26、#160;  Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號開始由本底進入指數增長階段時到達設定的域值時所經歷的循環數（如后圖所示，圖僅供參考）  Threshold lineC(t) value     C(t) value 18.12 /-0.04  閾值線Ct值           Ct值    6.  

27、60;      分子雜交的類型主要有哪些？探針的標記方法與標記類型？常用的雙鏈DNA的標記方法是哪兩種？探針的標記方法：切口平移法、隨機引物合成法，末端標記法，PCR標記法，體外轉錄標記法。探針按核酸分子分：DNA探針和RNA探針；按標記物的不同：放射性標記探針和非放射性標記探針。標記類型：按核酸分子的不同：可分為DNA探針和RNA探針根據標記物的不同：可分放射性標記探針和非放射性標記探針；雙鏈DNA探針標記主要方法：切口平移法、隨機引物合成法； 7.      

28、   Southern雜交一般過程及影響雜交因素。Southern雜交操作步驟:(1) 用限制性內切酶酶切DNA, 經凝膠電泳分離各酶切片段；(2) 轉膜：將DNA片段轉移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上；(3) 預雜交：封阻濾膜上非特異性位點；(4) 雜交：讓探針與同源DNA片段特異性結合；(5) 洗脫：去除非特異性結合的探針；(6) 自顯影檢查目的DNA所在的位置。Southern雜交影響因子1）、目的DNA在總DNA中所占的比例2）、探針的大小和標記效率3）、轉移到濾膜上的DNA量4）、探針與靶DNA的同源性 8.   &#

29、160;     基因組文庫的構建過程？如何確定文庫的大小？基因組文庫的構建過程：1）從生物體提取大片斷的基因組DNA；2）用適當的限制性內切酶（常為4堿基識別位點）進行部分酶切或超聲波打斷基因組DNA ；3）在瓊脂凝膠電泳上或蔗糖梯度離心篩選適當長度的DNA片斷（根據載體的要求）；4）載體的酶切、回收；5）將處理好的基因組DNA片斷與載體連接；6）將重組子導入宿主細胞7）文庫的鑒定、收集、保存；確定文庫大小的方法：以在構建的基因組文庫中任一基因存在的概率來衡量文庫的質量或完備性，它與基因文庫最低所含克隆數N（即文庫大小）之間的關系可用下式表示

30、：       N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f ) 其中： N：文庫所需的總克隆數； P：任一基因被克隆（或存在于基因文庫中）的概率； f：克隆片段的平均大小/ 生物基因組的大小。9.         基因文庫的類型包括哪兩種？各有什么特點？10.     一般質粒DNA的構型有哪幾種？在瓊脂糖凝膠電泳中的有何特點？超螺旋質粒D

31、NA、開環質粒DNA、線狀質粒DNA在瓊脂糖凝膠電泳的特點是：電泳的泳動速度由大到小分別是：超螺旋質粒DNA>線狀質粒DNA>開環質粒DNA11.     堿裂解法提取質粒DNA的原理，分析影響試驗結果的各種可能因素。堿裂解法原理：在堿性條件下，雙連DNA氫鍵斷裂，結構破壞變性，環狀超螺旋質粒不充分變性。在中性條件下變性質粒恢復原來構型，而線性大分子細菌DNA不能復性呈不溶物而經離心除去。（各種可能因素是上一屆的，具體其實大家可以根據那天師兄說的去寫）提取失敗：1）洗去雙鏈時，將質粒DNA洗去；   &

32、#160;  2）破壁失敗，質粒沒析出；      3）加劑問題電泳失敗：1）電壓太高          2）沒加染色劑          3）膠穿孔            4）電泳時間過長12.&#

33、160;    電泳緩沖液使用一定時間后出現DNA在凝膠中跑不動現象的原因，有何解決辦法？原因：電泳緩沖液的離子的富集作用；解決方法：1.更換成新配置的電泳緩沖液；      2.把電泳槽中的緩沖液倒出混勻后再重新使用13.     電泳的指示劑和染色劑有何區別，各自的作用是什么？指示劑一定要在電泳前加入，指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液；（一般為：溴酚蘭，二甲苯青）作用：預知電泳的速率及方向；使樣品呈現顏色，便于加樣；一些高濃

34、度蔗糖或其它物質增加DNA的密度，可以防止DNA的擴散染色劑即可以在電泳前加入樣液，又可以電泳后再對凝膠染色；（溴化已錠EB、硝酸銀、Goldview染料）作用：呈現出核酸電泳后的帶型。 第三章  基因克隆的酶學基礎1、 限制性核酸內切酶的類型，基因工程常用的是哪種限制性核酸內切酶？（常用II型）2、 什么是星活性，產生星活性的因素可能有哪些？在非最適合的條件下酶的識別特異性降低，產生非特異性帶，這種活性稱星活性。產生Star活性的因素：（書上P46-P47答案）高濃度甘油，堿性pH，存在Mn2 ，低離子強度，低鹽濃度，低pH3、 結

35、合已做的實驗，分析影響酶切的因素。（這個答案是上屆的，僅供參考）1）DNA的純度：DNA中的雜質如蛋白質、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會影響酶的活性。2）DNA的甲基化程度 ：dam甲基化酶（修飾GATC中的A）； dcm甲基化酶（修飾CCA/TGG的C）。3）溫度 ：不同的限制性內切酶的最適反應溫度不同。大多數是37 oC，少數要求40-65 oC。4）緩沖液(Buffer)：是影響限制酶活性的重要因素。 MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2 和離子強度；Tris-HCl：維持pH；二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩定性；牛血清白蛋白BSA等：

36、有助于酶的穩定；巰基乙醇：保持酶的穩定性，防止酶失活4、 限制性核酸內切酶命名規則及各字母代表的含義。（例子和圖幫助大家理解而已）命名規則：寄主菌屬名的第1個字母種名的前兩個字母菌株或菌型代號（大寫）空白發現序列（羅馬數字）例子：EcoR(E：屬名；co：種名；R：株；：發現次序)5、 簡單敘述同尾酶和同裂酶的差別。同尾酶：來源不同，識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端，連接后不能被相關的酶同時切割。同裂酶：識別序列相同，切割位點有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：識別位點和切點完全相同。    

37、60; 不完全同裂酶：識別位點相同，但切點不同。）6、 連接酶主要有哪些類型？有何異同點？影響連接酶連接效果的因素主要有哪些？類型：DNA連接酶和RNA連接酶異同點：相同點：都能以DNA為模板，從5'向3'進行核苷酸或脫氧核苷酸的聚合反應。不同點：DNA聚合酶識別脫氧核糖核苷酸，在DNA復制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在轉錄中起作用。影響因素：（影響因素就四個，后面分析覺得煩的話大家自己看著辦啦）1）連接所用的目的片段的狀態：       ¹ 效率：粘性末端>

38、;平端(100倍)；       ¹ 5，突出>3，突出；       ¹平端：HaeIII>AluI>HinCII>SmaI2）連接溫度       ¹連接效果最好在37 ，但形成的互補不穩定;¹最佳連接溫度：12-16 ，較好的連接效果，互補又較穩定;3）反應液中的成分：    &

39、#160;  ¹ ATP：反復凍熔，ATP活性降低，ATP溶解度不高，連接緩沖液宜分裝；       ¹單價離子：150-200mM NaCl，提高連接效果；       ¹ PEG：5%以下可以提高連接效率4）插入片段與載體的濃度比例          ¹載體DNA與外源DNA的分子摩爾

40、比通常為13左右，甚至110 或更高。       ¹目的或作用：增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現象。 7、 試分析提高平端DNA連接效率的可能方法。（傳說中的網上答案）1、低溫下長時間的連接效率比室溫下短時間連接的好。2、在體系中加一點切載體的酶，只要連接后原來的酶切位點消失。這樣可避免載體自連，應該可以大大提高平端連接的效率。3、足夠多的載體和插入片段是最重要的 。4、平端的連接對于離子濃度很敏感5、盡可能縮小連接反應的體積6、建議放在四度冰箱連接兩天效率更高比1

41、4度好8、 基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？1）大腸桿菌DNA聚合酶2）Klenow fragment3）T7 DNA聚合酶4）T4 DNA聚合酶5）修飾過的T7 DNA聚合酶6）逆轉錄酶7）Taq DNA聚合酶第四章      基因克隆的載體系統1、 作為基因工程載體，其應具備哪些條件？! 具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉移性）；! 具有合適的篩選標記；! 具有較高的外源DNA的載裝能力；! 具有多克隆位點（MCS）；! 具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點。2、 質粒的不相容性及

42、其分子機理。 定義：任何兩種含有相似復制子結構的不同質粒，不能同時存在于一個細胞中，這種現象稱為質粒的不相容性。 分子機理：兩種含有相似復制子結構的不同質粒，在復制同時受到同一種拷貝數控制系統的干擾，致使兩種質粒的最終拷貝數不同，其中拷貝數多的質粒在以后的細胞分裂周期中更具優勢。3、 載體的類型主要有哪些？在基因工程操作中如何選擇載體？基因工程中常用的載體(vector)主要包括質粒(plasmid)、噬菌體(phage)和病毒(virus)三大類。這些載體均需經人工構建，除去致病基因，并賦予一些新的功能，如有利于進行篩選的標志基因、單一的限制酶切點等。4、 質粒轉化原理，

43、影響轉化率的因素有哪些？A、 化學法（CaCl2法)轉化原理：是Ca2 與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結構，后者經熱脈沖發生收縮作用，使細胞膜出現空隙，質粒或DNA重組分子便可進入細胞內（感受態細胞）。B、 電穿孔轉化轉化原理：將待轉化的質粒或DNA重組連接液加在電穿孔轉化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場，在強大電場的作用下，細菌細胞壁和細胞膜產生縫隙，質粒或DNA重組分子便可進入細胞內。影響轉化率的主要影響因素:1）載體本身的性質及其空間構象：超螺旋構象轉化率最高；2）插入片段的大小：插入片段越大，轉化效率越低；3）受體細胞的類型及預處理；4）轉化方法：電擊法高于化學法。5、重組體分子的選擇方

44、法主要有哪些？并簡單闡述其原理。從總體上看，重組體分子的選擇與鑒定方法基本上可以分為如下幾個類型：                                      （1）基于載體遺傳標記檢測法在構建基因工程載體

45、系統時，載體DNA分子上通常攜帶了一定的選擇性遺傳標記基因，轉化或轉染宿主細胞后可以使后者呈現出特殊的表型或遺傳學特性，據此可進行轉化子或重組子的初步篩選。（2）基于克隆DNA序列檢測法Southern印跡雜交：根據毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉移并結合在適當的濾膜上，然后通過與已標記的單鏈DNA探針的雜交作用以檢測這些被轉移的DNA片段。（3）基于外源基因產物檢測法如果目的基因產物能降解某些藥物使菌株呈現出抗性標記，或者基因產物與某些藥物作用是顯顏色反應，則可根據抗性或顏色直接篩選含目的基因的克隆子。6、用已學過的重組體分子的選擇與鑒定技術，試設計一個試驗方案，假如一特異

46、PCR擴出的基因或基因片斷重組進T載體并轉化大腸桿菌，如何鑒定并獲得真實轉化子？(自理)第五章  基因的克隆一般方法1、基因的克隆方法主要有哪些？并闡述其克隆原理（至少3種，都是書上找的，自選哈，建議必選DD RT-PCR和SSH，原因請看下題）？1）差減雜交（SH）通過DNA復性動力學原理富集目的基因序列，并以此構建減數文庫的方式來進行目的基因分離克隆的。2）抑制性差減雜交（SSH）SSH的核心技術是抑制性PCR，它是一種將檢測子cDNA單鏈標準化步驟和消減雜交步驟結合為一體的技術。其中標準化步驟均等了檢測子中的cDNA單鏈豐度，而消減雜交步驟去除了檢測子和驅趕子之間的共

47、同序列，使檢測子和驅趕子之間不同的序列得到擴增。3）差異顯示PCR（DD RT-PCR）利用真核生物mRNA結尾處有POLY（A）結構，在其3端設計象5-T11GA樣引物，該引物可與mRNA總數的十二分之一結合，從而使這部分基因得到逆轉錄，同時結合5端的隨機引物（20條10-mer），可以使不同長度的基因得到擴增。4）DNA代表性差異分析（DNA RDA）代表性差別分析是通過突變型（驅趕DNA，driver DNA）與野生型（檢測DNA，tester DNA）基因組之間的差異來分離和鑒定突變基因的方法。5）擴增限制性片段長度多樣性（AFLP）基因組DNA經過限制性內切酶消化后，產生粘性末端。使

48、用人工合成的短的雙鏈接頭，該接頭一端具有同樣的內切酶識別粘性末端，互補連接后成為DNA模板。接頭和與接頭相鄰的酶切片斷的幾個堿基序列作為引物的結合位點。參考文獻：關德軍.AFLP技術原理及其在植物研究中的應用.安徽農業科學，2006，34（15）：3625-3628）6）cDNA微陣列建立一套統一且具有高質量、高代表性的cDNA列陣膜，在這一列陣膜上每個cDNA克隆都有固定的位置和編號，這樣大大方便了數據的綜合比較分析，并可對每個cDNA克隆子進行定量分析。在列陣雜交的基礎上，還可以進行雜交測序，從而測定每個cDNA克隆子的序列。2、簡單闡述差異顯示PCR克隆基因的原理及其優缺點，有何應用？主

49、要原理：利用真核生物mRNA結尾處有POLY（A）結構，在其3端設計象5-T11GA樣引物，該引物可與mRNA總數的十二分之一結合，從而使這部分基因得到逆轉錄，同時結合5端的隨機引物（20條10-mer），可以使不同長度的基因得到擴增。優點：l       簡便、靈敏、高效、省時，能快速顯示mRNA的組成。l       所需的mRNA量少。l       各樣本mRNA的差異可同時進行

50、比較。l       擴出的cDNA可直接用于測序、文庫篩選等。缺點：l       假陽性條帶多，對低豐度的基因表達不容易檢測。l       工作量大。l       無法定量研究。l       擴出的條帶往往是3端比較短的UTR區的一段序列，

51、提供的信息較少。利用該技術，目前已有越來越多的差別表達基因得以分離和鑒定，在分子生物學和基因工程研究領域發揮了極大的作用。（P221）3、抑制性差減雜交的原理與應用。原理：SSH的核心技術是抑制性PCR，它是一種將檢測子cDNA單鏈標準化步驟和消減雜交步驟結合為一體的技術。其中標準化步驟均等了檢測子中的cDNA單鏈豐度，而消減雜交步驟去除了檢測子和驅趕子之間的共同序列，使檢測子和驅趕子之間不同的序列得到擴增。應用：l 基因突變體的研究：如基因的表達與不表達；l 基因時空表達的研究：如根、莖、葉；l 不同處理條件下的基因表達差異：如施肥與不施肥、光照與不光照。4、酵母雙雜交技術、噬菌體表面展示技

52、術的原理。A酵母雙雜交技術原理：大部分真核生物的位點特異轉錄激活因子通常具有兩個可分隔開的結構域，一個是DNA特異結合域（DNA-binging domain,BD），一個是轉錄激活域(transcriptional activation domain,AD)。這兩個結構域各具功能，互不影響，但一個完整的、具有激活特定基因表達的激活因子必須同時含有這兩個結構域，否則無法完成其激活功能。不同來源的激活因子的BD區與AD區結合后則能特異地激活BD結合基因的表達。B噬菌體表面展示技術原理：當外源DNA片段插入絲狀噬菌體基因組的一個外被蛋白基因中時，如果兩者讀碼框結構保持一致，這個外源DNA片段所編碼

53、的產物可與此外被蛋白一起以融合蛋白的形式表達，并顯示在噬菌體的表面。利用抗此外源基因編碼產物（多肽或蛋白）的抗體，通過親和純化，就能從大量的噬菌體中富集、分離出含有所要的基因的融合噬菌體。然后，通過基因擴增，得到大量所要的目的基因。5、T-DNA標簽法克隆基因的一般技術路線。Ø       農桿菌侵染植物得到轉化苗，篩選出表現某種突變性狀的個體。Ø       建立突變體基因組文庫及野生型基因組文庫.Ø  

54、     用T-DNA片段做probe篩選突變體文庫，獲得陽性克隆。Ø       用獲得的陽性克隆篩選野生型基因組文庫，獲得野生型的陽性克隆。Ø       把陽性克隆轉化突變體進行功能互補及進行測序分析。第七章  克隆基因的表達1、通過比較，分析大腸桿菌表達系統和酵母表達系統各有何優缺點。大腸桿菌表達外源基因的優勢：  ò全基因組測序

55、，共有4405個開放型閱讀框架；  ò基因克隆表達系統成熟、完善；  ò繁殖迅速、培養簡單、操作方便、遺傳穩定；  ò被FDA批準為安全的基因工程受體生物。大腸桿菌表達外源基因的劣勢：   ò缺乏對真核生物蛋白質的復性功能；   ò缺乏對真核生物蛋白質的修飾加工系統；   ò內源性蛋白酶降解空間構象不正確的異源蛋白；   ò周質內含有種類繁多的內毒素。甲醇酵母表達系統的優點：ü       具有強的受嚴格調控的AOX1啟動子ü       表達蛋白的翻譯后的加工和修飾ü       營養要求低，工業化生產成本低ü       可高密度發酵ü