1、-文讀懂 免疫組化步驟、結果分析及注意事項導語實驗室花花師姐正在教導新來的師弟：“想拿 高分文章，不學免疫組化怎么行？ ”免疫組化王子毛博旁邊 插話：“是這個理，今天我就豁出去，將我十多年的心得和 經驗奉獻給小師弟你了。”小師弟感激涕零，唯諾細聽兩位 前輩的教誨免疫組化，免疫組織化學技術（immunohistochemistry）, 是一項利用抗原抗體反應，通過使標記抗體的顯色劑顯色來 確定組織細胞內抗原，對蛋白定位，定性的實驗技術。免疫 組化主要用的是組織標本和細胞標本兩大類，組織標本包括 石蠟切片（病理切片和組織芯片）和冰凍切片。石蠟切片， 對組織形態保存好，保存時間也長

2、，雖然對組織抗原暴露有 影響，但可以抗原修復，所以石蠟切片仍然是首選的標本制 作方法。免疫組化步驟詳解免疫組化結果分析很多時候， 我們千辛萬苦地染出了一張張漂亮的免疫組化片子。但是卻 不知道如何正確地分析，得出理想的結果。這實在是一件憾 事。如下圖，正常的結果應該是這樣的：鏡下細胞核呈藍色, 陽性結果呈深淺不一的棕色。結果分析主要有兩種方法，陽 性著色細胞計數法和評分法。前者是在40*光鏡下，隨機20 個視野下計數陽性著色細胞；后者則是在光學顯微鏡下按染 色程度（0分陰性著色，1分淡黃色，2分淺褐色，3分深褐 色）和陽性范圍（1分0-25%, 2分26-50%, 3分51-75%, 4 分76

3、-100%）評分，最終分數相加。免疫組化結果分析是毛博的特長，以下是他傳授的獨門 絕技。1對照染色和做實驗的時候必須設立對照組一樣，免疫組化也必須 設立對照染色。沒有對照染色的免疫組化結果是不可信的。 對照一般有陽性組織對照，陰性組織對照，陰性試劑對照， 自身對照。一般來說，有一個陽性組織對照和一個陰性組織 對照就足夠了。2 定位抗原表達必須在特定部位。如LCA應定位在細胞膜上； CK應定位在細胞漿內；PCNA及p53蛋白應定位在細胞核內 等等。不在抗原所在部位的陽性著色，不能視為確切的陽性 結果。有可能是非特異性染色或者假陽性。不能確定怎么 辦？這就要用到上一段提到的對照染色了。3 半定位現

4、在一般用圖像分析系統進行定量。如果你的實驗室不 幸沒有那么高大上的話，就只好趕鴨子上架，用肉眼定一下 量了。因為人為主觀性比較強，所以只能稱作半定量。免疫 組化的半定量一般就分為三級：弱（ + ）,中（+）,強（+卄）。 以綠色免疫熒光為例，則表現為淺綠色熒光、明顯綠色熒光 和亮綠色耀眼熒光。弱（+ ） =1,中（+） =2,強（卄+） =3o 至少隨機觀察540個HPF。然后根據（+ ） %xl+ （+） %x2 + （+） %x3計算出數值；總數值25者為（+）。4圖像分 析儀如果要進行精確定量的話，就要用到圖像分析儀。圖像 分析儀類型很多。這里就不一一介紹了。其實毛博最想隆重 推薦的是一

5、款圖像分析軟件:image Jo毛博當年在米國做博 士猴的時候，就是用的這款軟件。這是NIH開發的免費軟件。 一般的免疫組化結果分析用它就綽綽有余了。現在已經開發 到了 1.50版。網上可以免費下載。其界面非常簡潔，如下圖 所示。現在，根據一個實例來看看如何用Image J來進行圖 像分析。如下圖所示，我們有一張細胞的免疫熒光染色的照 片。那么，如何用Image J來計數細胞的個數呢？首先，要 把彩色的圖像轉換成黑白圖像。步驟如下：ImageType 16-bito轉換成黑白圖像后，將要計數的部分用高亮標示出來。 步驟如下：ImageAdjustThreshold。然后拖動鼠標，直到 所有的細

6、胞被標示岀來。有時候2個細胞靠得比較緊密，會 被計數為1個細胞。這個時候可以采用Image J的水洗功能。 步驟如下：Images Binary-* Watershed。如下圖的藍色箭頭 所示，這些是本來計數成一個的細胞，經過水洗之后，更加 精確地被計數成了 2個細胞。然后，就可以正式開始分析了。 步驟如下：AnalyzeAnalyze Particles。在得出最后的結果之 前，還有一些選項需要選擇。如果想要計數全部的細胞，那 么Size項里面選擇“Oinfinity”。Circularity的默認值為"0.00-1.00"o 一般就取默認值。最后的結果如下圖所示。軟 件

7、自動測量了每個細胞的大小。這里因為是二維圖像，所以 就是每個細胞的面積。然后計數了一共有72個細胞，總面 積為21286.00,平均大小為295.64o免疫組化是個苦活，時 間長，步驟多，還要經常接觸有毒致癌物質。大家辛辛苦苦 染岀了漂亮的片子，最后都希望得出自己想要的結果。以上, 毛博介紹了一些自己的心得體會。希望廣大的實驗狗們都能 做出自己想要的結果，早點發文章。非特異性染色的八大 原因然而，結果卻未必都是那么如意的，常常出現下面這種 狀況，好好的一張片子染得臟臟的，這就是最常見的非特異 性染色。1.抗體問題，真的是一分錢一分貨啊！一抗用多克隆抗體容易出現非特異性染色，建議用高純 度，高效

8、價的針對更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體來解 決。單克隆抗體很貴，不過結果真的很好。尤其是背景非特 異性染色不會太深。真是一分價錢一分貨。一抗過期也會造 成杯具，所以要注意抗體的有效期。2.抗體濃度過高/孵育時間過長一抗濃度太高也是出現 非特異性染色的常見原因。解決的辦法就是預實驗。每次使 用新抗體前應該多做預實驗，摸索出最理想的工作濃度，不 能簡單地按照說明書來用。另一個常見原因就是孵育時間過 長。解決的辦法就是定時器。加上抗體后，立刻調好定時器, 提醒自己及時終止反應，就會避免這個問題。3. DAB染色時間太長/變質DAB的孵育時間過長，會造 成背景非特異性染色。DAB的顯色時間不是一成不

9、變的，主 要靠自己在顯微鏡下盯著，一旦出現淺淺的棕色的時候，就 要馬上沖洗。出現棕色的時間過短，表明抗體濃度過高；出 現棕色的時間過長，表明抗體濃度過低。DAB要保存于避光 干燥的地方，現用現配，臨用前才加入H2O2。圖1就沖洗 的有些晚了；圖2就是剛剛好，染色效果棒棒噠!4.內源性 酶和生物素內源性酶和生物素也會造成非特異性染色，特別 是一些內源性酶生物素含量豐富的組織，如肝臟，腎臟，脾 臟等。處理的辦法為：滅活堿性磷酸酶：最常用的方法是將 左旋咪卩坐（24 mg/mL）加入底物液中，并保持PH值在7.6-8.2, 即能除去大部分內源性堿性磷酸酶；對于酸性磷酸酶，可以 用50 mmol/L的

10、酒石酸抑制；對于內源性過氧化物酶，可以 用0.9%的雙氧水來滅活。對于內源性生物素，染色前將切片 浸于25 H g/mL親和素溶液中15分鐘，PBS清洗15分鐘后 即可染色。也可以24 mg/mL的卵白素封片15分鐘。5.組織變干一下子染太多片子的時候，容易岀現這種情況。解決的 辦法就是不要貪多嚼不爛。一次少染幾張。還有就是試劑充 分覆蓋組織，超出組織邊緣2mmo然后用PAP筆在組織周 圍畫一個圈圈，把修復液圈在里面。避免修復液流走。圈圈 應該距離組織邊緣3-4 mmo 6.浸泡時間過長切片在緩沖液或修復液里面浸泡過夜，也會引起杯具。 這都是偷懶的做法。但是有時候也是可以偷一下懶的。毛博 的獨門秘技就是4。C冰箱。只要把容器放在4。C冰箱里， 過夜完全沒有問題。7. 清洗不充分清洗一定要充分。PBS液一定要雙蒸水新配，用之前再 次測PH值。緩沖液用0.05 mol/L的TrisHCL, 0.15 mol/L的 NaCI即可。如果加一點去垢劑Tween-20就更好了。8. 封閉血清問題是否