1、2008年度新苗人才計(jì)劃項(xiàng)目項(xiàng)目名稱：殼寡糖的酶法制備和分離技術(shù)的研究一、 立項(xiàng)背景及意義殼寡糖(Chitooligosaccharide) ,又名甲殼低聚糖，是由氨基葡萄糖通過(guò)B -1,4- 糖苷鍵連接而成的聚合度約為 2-20 的低聚糖，其分子量低于 5000，具有 穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)。殼寡糖可運(yùn)用殼聚糖經(jīng)過(guò)生物酶技術(shù)降解制得。殼聚糖廣泛存在于自然界的蝦殼、蟹殼和真菌中，雖然有特殊的生物活性， 但由于其分子量大、 水溶性差， 在人體不易被吸收而使其應(yīng)用受到限制。 作為一 種生物技術(shù)產(chǎn)品， 殼寡糖幾乎包括了所有殼聚糖的所有優(yōu)點(diǎn)， 它具有良好的生物相容性和生物降解性、親水性、吸附性、生物學(xué)活性等多

2、種理化特征以及天然、 高效、毒副作用少、抗藥性不顯著、性能多樣等特點(diǎn)。科學(xué)研究表明，殼寡糖的 功能作用和生物活性比起殼聚糖將提高數(shù)十倍、 應(yīng)用領(lǐng)域更加廣泛、 人體吸收率 近 100%（殼聚糖吸收率 6.48%），而且增加了促進(jìn)鈣吸收的新的功能作用，具有 較高的科技含量和附加值，發(fā)達(dá)國(guó)家稱其為“軟黃金”。殼寡糖具有三調(diào)（免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)pH值、調(diào)節(jié)荷爾蒙）、三降（降血脂、降 血糖、降血壓）、三排（排膽固醇、 排重金屬離子、 排毒素）、三抑（抑制癌細(xì)胞、 抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、 抑制癌毒素） 等功能，同時(shí)， 還具有抗自由基、 防輻射、 抗炎、 止血以及促進(jìn)傷口愈合等功能。殼寡糖及其衍生產(chǎn)品可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥

3、、保健、 食品、日化、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。在醫(yī)藥保健領(lǐng)域具有提高免疫、活化細(xì)胞、調(diào)節(jié)血糖 血脂血壓膽固醇、預(yù)防治療癌癥、強(qiáng)化肝功、促進(jìn)鈣吸收、增殖腸道有益菌等功 能；在食品飲料領(lǐng)域是一種良好的健康食品添加劑， 可增殖乳酸菌、 雙歧桿菌等 人體有益菌 100 倍以上；在日化領(lǐng)域具有營(yíng)養(yǎng)皮膚、抑菌、保濕等功能，性能優(yōu) 于傳統(tǒng)的透明質(zhì)酸等產(chǎn)品； 在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域可激活植物免疫系統(tǒng)和酶系活性， 能促進(jìn) 植物生長(zhǎng)、提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)、增強(qiáng)抗病力、增殖生物菌肥有益菌群等，具有 藥肥雙效功能，被譽(yù)為“不是農(nóng)藥的農(nóng)藥，不是化肥的化肥”，市場(chǎng)前景極其廣 闊。目前殼寡糖產(chǎn)品的年需求量在 6000 噸以上。在精細(xì)化工領(lǐng)域，由于殼

4、寡糖 的綠色天然的特性符合世界日化產(chǎn)品的發(fā)展趨勢(shì)， 含天然活性物質(zhì)的化妝品順應(yīng) 回歸自然、科學(xué)美容的消費(fèi)趨勢(shì)，歐洲現(xiàn)已有 60 多個(gè)與殼寡糖相關(guān)的化妝品品 牌，年需求殼寡糖 1500 噸。我國(guó)化妝品年銷售額從 1982年的 2 億元人民幣發(fā)展 到 2001 年的 400 億元，居亞洲第二位。在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，從中國(guó)產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究 中心統(tǒng)計(jì)可知， 2005 年我國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)工業(yè)總產(chǎn)值將達(dá)到 400 億-500 億元。 在保健食品領(lǐng)域，韓國(guó)于 1996 年即批準(zhǔn)殼寡糖為功能性保健食品，我國(guó)現(xiàn)在已 有許多保健品及藥品等年需求殼寡糖上百噸的保健食品生產(chǎn)廠家， 國(guó)許多醫(yī)藥保 健品公司正在申報(bào)殼寡糖保健食品

5、文號(hào)，預(yù)計(jì)年需求量將以高于30%的速度遞增。在農(nóng)林畜牧領(lǐng)域，因殼寡糖具有良好的抗病蟲(chóng)害功能 , 且有安全、微量、高 效、成本低等優(yōu)勢(shì)，可使水果、蔬菜、糧食增產(chǎn) 10%-30%，因而可以應(yīng)用于生物 農(nóng)藥產(chǎn)品，部分替代化學(xué)農(nóng)藥。目前我國(guó)農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害共 2000 余種，受災(zāi)面積數(shù) 10 億畝。因此殼寡糖在農(nóng)林畜牧上的應(yīng)用對(duì)我國(guó)的農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意 義，以殼寡糖為基礎(chǔ)的生物農(nóng)藥將有廣闊的發(fā)展空間。 科技部已將 “殼寡糖新產(chǎn) 品的開(kāi)發(fā)應(yīng)用”列為國(guó)家“九五”攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目和“十五”招投標(biāo)項(xiàng)目，要求建 立數(shù)條年產(chǎn) 500 噸以上的殼寡糖生產(chǎn)線， 到 2015 年總產(chǎn)值可達(dá) 1100億-1300 億 元，從

6、而滿足國(guó)市場(chǎng)的需求。殼寡糖的級(jí)別不同，售價(jià)差額較大。農(nóng)業(yè)專用殼寡 糖市場(chǎng)價(jià)為 400 元/ 公斤；食品級(jí)殼寡糖市場(chǎng)價(jià)為 600元/ 公斤；而化妝品級(jí)殼寡 糖市場(chǎng)價(jià)為 150 元/ 公斤。隨著殼寡糖應(yīng)用圍的不斷擴(kuò)大，加之作為一種性能優(yōu) 異的基礎(chǔ)原料， 市場(chǎng)需求量將呈穩(wěn)步上升趨勢(shì)。 同時(shí)，殼寡糖作為一種中間原料， 出口市場(chǎng)穩(wěn)定。近年來(lái)，隨著我省海產(chǎn)品加工業(yè)的發(fā)展， 尤其是甲殼素綜合利用產(chǎn)業(yè)的興起， 我省逐步成為東南亞地區(qū)海產(chǎn)品加工利用中心和主要的甲殼素產(chǎn)業(yè)發(fā)展基地。 。 2001年全省甲殼素制品的直接經(jīng)濟(jì)總產(chǎn)值約 10 億元左右（與其相關(guān)的、間接的 紡織、食品、醫(yī)藥、化工等行業(yè)的產(chǎn)值達(dá)數(shù)百億元）

7、。在此基礎(chǔ)上，本項(xiàng)目從殼 聚糖的局限性出發(fā)， 著重研究了通過(guò)專一性酶法技術(shù)降解殼聚糖， 制備聚合度均 一的殼寡糖產(chǎn)品，將使產(chǎn)品的附加值得到大幅度地提升。因此，本項(xiàng)目的實(shí)施，對(duì)于有效利用甲殼素資源，促進(jìn)我省甲殼素行業(yè)健康 發(fā)展，意義重大。由于項(xiàng)目原料來(lái)源方便、價(jià)格低廉，將大大降低了加工企業(yè)的 生產(chǎn)成本，滿足了市場(chǎng)緊缺，且安全無(wú)公害，推廣應(yīng)用前景廣闊，對(duì)全國(guó)的水產(chǎn) 加工業(yè)發(fā)展具有重要影響。二、 國(guó)外研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)開(kāi)發(fā)應(yīng)用殼寡糖是甲殼質(zhì)行業(yè)的制高點(diǎn)，也是當(dāng)今生物制藥技術(shù)的一個(gè)亮 點(diǎn)。目前，其科研開(kāi)發(fā)主要集中在日本、韓國(guó)等國(guó)家。殼寡糖的主要制備方法有化學(xué)法、 物理法和生物法。 化學(xué)法主要包括酸水解

8、 法、氧化法、超臨界流體法、配位降解法等。目前，國(guó)對(duì) H2O2 氧化降解法研究較 多，可在降解過(guò)程中伴隨的副反應(yīng)還需要探索出有效的遏止方法， 另外必須注意 氧化降解對(duì)產(chǎn)品活性的影響以及存在殘留的 H2O2 對(duì)食品安全性是否產(chǎn)生隱患也 是值得考慮。物理法包括微波法、超聲波法、光降解法、丫射線法等。生物法主 要有酶法降解、 反應(yīng)器和酶降解、 糖基轉(zhuǎn)移法等。 其中已用于工業(yè)化生產(chǎn)的有酸 水解法、氧化降解法 , 但是存在產(chǎn)品相對(duì)分子質(zhì)量分布較寬 , 均一性差， 分離純 化難度高以及污染嚴(yán)重等問(wèn)題； 物理方法也有一定的缺點(diǎn) , 不能作為主體方法用 于殼寡糖的制備； 酶降解法條件溫和 , 產(chǎn)物不用脫鹽，

9、工藝易于控制 , 易于得到 所需聚合度的殼寡糖 , 并且對(duì)環(huán)境不產(chǎn)生污染， 是較理想的制備方法， 特別是酶 降解和反應(yīng)器聯(lián)合方法 , 已經(jīng)在產(chǎn)業(yè)化道路上邁出第一步， 但在制備工藝上還有 許多有待改進(jìn)提高產(chǎn)量的地方。20世紀(jì) 90 年代末，酶法生產(chǎn)殼寡糖在日本、韓國(guó)實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化。我國(guó)對(duì)該 產(chǎn)品的研究雖起步較晚，但近年來(lái)做了大量的工作，并趨于活躍。 2002 年 8 月， 山力、海得貝公司利用復(fù)合酶法制備殼寡糖的生產(chǎn)線正式投產(chǎn)， 殼寡糖在我國(guó)第 一次實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。 復(fù)合酶比起專一性酶制備殼寡糖， 所得降解產(chǎn)物相對(duì)分 子量分布不容易控制，聚合度不夠均一。但因?yàn)槟壳笆袌?chǎng)上專一性酶價(jià)格昂貴， 如何尋

10、找到降解效果好、成本又不高的專一性酶，是一個(gè)急需解決的技術(shù)難題。 而這一技術(shù)難題的解決無(wú)疑將為我國(guó)整個(gè) 甲殼素 行業(yè)的發(fā)展提供幫助。、項(xiàng)目主要研究開(kāi)發(fā)容、技術(shù)關(guān)鍵以及科研創(chuàng)新的主要方式 （一）主要研究容：采用平板1、專一性酶菌種的篩選。 通過(guò)制作以殼聚糖為唯一碳源的平板篩選分離培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。 劃線分離法接種，放入30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)3-4天。之后，觀察培養(yǎng)基，取有透明 圈的平板，挑選菌種，進(jìn)一步進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定酶活。2、產(chǎn)酶菌種的發(fā)酵培養(yǎng)。根據(jù)已優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，對(duì)發(fā)酵上清液中粗酶，采用 75% 飽和度乙醇沉淀，獲得粗酶粉，測(cè)定酶活力，低溫保存。3、殼寡糖的酶法制備和

11、性質(zhì)研究通過(guò)還原端基、 酶解產(chǎn)物聚合度、 水解液調(diào)堿性后透光率變化測(cè)定以及酶解 產(chǎn)物的TLC HPLC分析，研究殼聚糖酶降解殼聚糖過(guò)程中殼聚糖脫乙酰化度、 殼聚糖濃度、酶用量、反應(yīng)時(shí)間和 pH值對(duì)酶促反應(yīng)速率和產(chǎn)物聚合度的影響。4、研究殼寡糖的分離技術(shù)、純化工藝；超濾/ 離子交換樹(shù)脂5、殼寡糖的含量檢測(cè)方法研究；采用高效液相色譜法（HPLC）、測(cè)定低聚糖類的含量。6、殼寡糖產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定。（二）關(guān)鍵技術(shù)：1、高活力殼聚糖酶制劑的制備以及殼聚糖酶酶活的測(cè)定；2、殼寡糖的酶法制備技術(shù)；3、殼寡糖的分離技術(shù)；4、殼寡糖制品分析檢驗(yàn)技術(shù)，包括還原端基、酶解產(chǎn)物聚合度、水解液調(diào)堿性 后透光率變化的測(cè)

12、定；殼寡糖的含量和純度、相對(duì)分子質(zhì)量、雜質(zhì)含量的測(cè)定； 殼寡糖水溶性、水分的測(cè)定以及酶解產(chǎn)物的 TLC、HPLC分析。（三）創(chuàng)新的主要方式：1、殼寡糖產(chǎn)品加工采用酶法工藝，克服了傳統(tǒng)化學(xué)法分子量分布圍寬、易變色 的缺點(diǎn)，且不會(huì)帶來(lái)環(huán)境污染問(wèn)題2、為殼聚糖的高值化利用提供了新途徑。四、項(xiàng)目預(yù)期目標(biāo)（一）主要技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)1、目標(biāo)：（1）以殼聚糖為原料，采用酶法的技術(shù)有效地制備、分離殼寡糖；（2）提供完整的加工技術(shù)研究報(bào)告，包括提取工藝、分離技術(shù)、產(chǎn)品質(zhì)量研究、 操作技術(shù)流程等。2、殼寡糖產(chǎn)品技術(shù)指標(biāo)（1）水分含量 <7% （ 105C）；（2）分子量為 500-5000Da （Waters

13、600E 檢測(cè)）；（3）不溶物w 1.0 %;（4）粘度（5%）< 10 mPaS（ 5） pH 4-6;（6）脫乙酰度70%;（7）六、七、八糖含量達(dá)到50鳩上；（8）分散度小于1.5 ;3、經(jīng)濟(jì)指標(biāo)（1）發(fā)表相關(guān)學(xué)術(shù)論文1篇；（2）提供符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的樣品。（二）應(yīng)用或產(chǎn)業(yè)化前景殼寡糖在食品加工中可用殼寡糖做填充劑、 增色劑、脫色劑、穩(wěn)定劑和保鮮 包狀膜。殼寡糖的應(yīng)用圍在不斷擴(kuò)大，受到了國(guó)家的高度重視。目前市場(chǎng)上殼寡糖價(jià) 格比較高，一直處于求大于供的現(xiàn)象。如何有效地解決這一問(wèn)題，就需要研究和 探索可行的方法來(lái)制備殼寡糖。酶法生產(chǎn)殼寡糖項(xiàng)目，將有利促進(jìn)了我國(guó)殼寡糖 行業(yè)的發(fā)展。與其它降解

14、法相比，酶降解法具有反應(yīng)條件溫和，降解過(guò)程及降解 產(chǎn)物相對(duì)分子量分布容易控制，制備的低聚糖生物活性高，產(chǎn)物不用除鹽。過(guò)程 容易控制，且不對(duì)環(huán)境造成污染等優(yōu)勢(shì)，是理想的殼寡糖生產(chǎn)方法。本項(xiàng)目的制備方法解決了產(chǎn)品的安全性問(wèn)題， 減少資源浪費(fèi)，滿足市場(chǎng)要求， 應(yīng)用前景廣闊。但低聚殼聚糖的制備，尤其是聚合度6-8殼寡糖的制備大都處于 實(shí)驗(yàn)室的研究階段。因此，本項(xiàng)目擬在實(shí)驗(yàn)室研究的基礎(chǔ)上， 通過(guò)專一性酶法制 備殼寡糖，進(jìn)一步發(fā)展成產(chǎn)業(yè)化，以滿足國(guó)外對(duì)殼寡糖的需求。五、項(xiàng)目實(shí)施方案（一）技術(shù)路線1、采用專一性酶解法進(jìn)行制備殼寡糖；2、殼寡糖的分離，純化精制技術(shù)研究采用水解產(chǎn)物薄層層析（TLC）分析、水解產(chǎn)

15、物（HPLC）分析。3、提取率及品質(zhì)分析采用數(shù)理統(tǒng)計(jì)的方法來(lái)分析提取率的高低，此外，采用相應(yīng)的方法進(jìn)行質(zhì)量、 水溶性、水分的檢測(cè)。4、技術(shù)流程（二）組織方式以組員分工合作的形式來(lái)負(fù)責(zé)完成此項(xiàng)課題（三）課題分解（1）菌種的篩選；（2）產(chǎn)酶菌種的發(fā)酵培養(yǎng)；（3）殼寡糖的酶法制備和性質(zhì)研究；六、計(jì)劃進(jìn)度安排日期工作進(jìn)度2008年7月至2009篩選產(chǎn)專一性殼寡糖酶的菌種并對(duì)菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)的 技術(shù)。殼寡糖的酶法制備，以及殼寡糖的分離、純化技術(shù)。年1月2009年2月至2009殼寡糖產(chǎn)品分析與檢驗(yàn)。年3月2009年4月至2009年6月定七、現(xiàn)有工作基礎(chǔ)與條件實(shí)驗(yàn)室具備實(shí)驗(yàn)所需的設(shè)備：TGL-16C臺(tái)式離心機(jī)電熱恒溫水浴鍋XW-80A漩渦混合器隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱HYG-A型回轉(zhuǎn)恒溫調(diào)速搖瓶柜手提式火菌鍋超凈臺(tái)磁力攪拌器WFZ-W210紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)W1100紫外分光光度計(jì)Mettler Toledo 320-5 pH 計(jì)烏氏粘度計(jì)上海安亭科學(xué)儀器廠金壇縣國(guó)華儀器廠上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械儀器一廠太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠市第二醫(yī)療器械廠凈化設(shè)備廠江陰科研器械廠尤尼柯(上海)儀器有限公司 北京瑞利分析儀器公司上海梅特勒進(jìn)一步完善并優(yōu)化生產(chǎn)技術(shù)，