1、交聯溫度對京尼平交聯膠原/殼聚糖組織工程支架的影響         10-05-04 09:57:00     編輯：studa20               作者：曹崢，胡蘊玉，潘緯敏，白雪東，畢龍，李丹，楊小彬，劉民【摘要】  目的通過研究材料的孔徑、交聯度、溶脹率、降解率、細胞毒性及組織相容性的變化，探討交聯溫度對京尼平

2、交聯膠原/殼聚糖支架的影響。方法 采用冷凍干燥法制備膠原/殼聚糖復合多孔支架，分別于4、20、36條件下，在0.5%京尼平水溶液中交聯24 h。以未交聯的膠原/殼聚糖復合多孔支架作為對照，評價所得支架的孔徑、交聯度、溶脹率、降解率、細胞毒性及組織相容性特點。結果隨交聯溫度升高，支架的交聯度明顯增大，溶脹率和降解率逐漸減小。4組支架交聯度47.88%±6.4%，溶脹率為721%±46%，4周后降解3.95%±6.4%;20組支架交聯度67.69%±3.6%，溶脹率為662%±72%，4周降解0.91%±5.9%;36組支架交聯度70.3

3、2%±5.7%，溶脹率為635%±27%，4周降解0.66%±7.3%，三組上述觀察指標均優于未交聯組(P/0.01)。結論京尼平交聯可以顯著降低膠原/殼聚糖支架的降解率和溶脹率，且對支架結構和生物相容性無明顯影響。交聯溫度增加可以提高支架的交聯度和抗降解能力，較快獲得具有良好生物相容性和降解率的組織工程支架。 【關鍵詞】  交聯溫度; 殼聚糖; 膠原; 京尼平; 組織工程Abstract: ObjectiveTo investigate the changes of pore sizes,crosslinking index,swelling rati

4、on,degradation rate,cytotoxicity and biocompatibility of genipin crosslinked collagen/chitosan scaffolds affected by the different crosslinking temperature points.MethodThe freeze-dried collgaen/chitosan scaffolds crosslinked with 0.5% genipin within 24 h were divided into 3 groups by crosslinking t

5、emperature:4 group,20 group and 36 group.The characteristics of pore sizes,crosslinking index,swelling ratio,degradation rate,cytotoxicity and biocompatibility were evaluated.Collagen/chitosan scaffolds without crosslinking were chosen as control group.ResultWith the increase of temperature,crosslin

6、king index was increased,but swelling ratio and degradation rate were decreased.In 4 group,the crosslinking index was 47.88%±6.4%,the swelling ratio was 721%±46%,and the degradation rate was decreased by 3.95%±6.4% at 4 weeks.In 20 group,the crosslinking index was 67.69%±3.6%,the

7、 swelling ration was 662%±72%,and the degradation rate was 0.91%±5.9% in 4 weeks.In 36 group,the crosslinking index was 70.32%±5.7%,the swelling ration was 635%±27%,and the degradation rate was 0.66%±7.3% at 4 weeks.The above indexes of the three groups were much better than

8、 those of control group(P<0.01).ConclusionIt was indicated that the swelling ratio and degradation rate of the collagen/chitosan scaffolds are significantly decreased by genipin without any obvious change of pore sizes and toxicity.The biocompatibility and degradation rate of this tissur engineer

9、ing scaffold can be well obtained with genipin by increasing crosslinking temperature within 24 h.Key words：crosslink temperature; chitosan; collagen; genipin; tissue engineering膠原因其良好的組織相容性和可降解性被廣泛用于組織工程研發領域。但由于其機械強度不足，在體內水解過程中不能保持空間構型，且吸收過快，因此，在應用時常加入殼聚糖等成分，以提高支架的彈性模量、臨界形變和強度1。交聯可進一步提高支架的機械強度和抗蛋白酶

10、降解的能力。但物理交聯法交聯度較低且不均一，而化學交聯法采用戊二醛、甲醛等傳統的交聯劑，易引起中毒或不良反應。京尼平是一種提取自梔子果實的天然交聯劑，其毒性遠遠低于傳統的化學交聯劑。細胞實驗表明其毒性低于戊二醛104倍，而細胞增殖能力高于戊二醛組5×103倍2。但是既往對于京尼平的研究多集中于單一材料，且多關注交聯時間及交聯劑濃度對于材料交聯的影響，而觀察交聯溫度對京尼平交聯復合支架影響的研究未見報道。本實驗擬通過觀察支架孔徑、交聯度、降解率、溶脹率、細胞毒性及組織相容性的變化，探討交聯溫度對京尼平交聯膠原/殼聚糖復合支架的影響。1 材料與方法1.1 材料與儀器殼聚糖(WOLSEN)

11、，鼠尾膠原，京尼平(和光純藥工業株式會社)，甘氨酸(solarbio)，冰醋酸、異丙醇、乙二醇甲醚、茚三酮均購自國藥集團化學試劑有限公司。DMEM培養基(gibco)，胎牛血清(hyclone)，胰蛋白酶(sigma)，冷凍干燥機(CHRIST)，倒置相差顯微鏡(nikon)，分光光度計(HITACHl)，掃描電鏡(HITACHl)。1.2 多孔支架的制備及交聯配制0.2 mol/L的醋酸溶液，分別稱取一定質量的殼聚糖和膠原粉末，將其完全溶解于稀醋酸溶液中，靜置脫除溶液中的氣泡。將兩種溶液按一定比例混合，充分攪拌混合均勻。將膠原、殼聚糖混合液注入模具中，置于冷凍柜中-20冷凍成型，樣品完全凍結

12、后冷凍干燥12 h，制得膠原/殼聚糖復合支架。將上述支架于風箱中揮發殘留醋酸后，置于0.5%的京尼平水溶液中，分別于4、20、36交聯24 h后，蒸餾水沖洗后置于飽和甘氨酸溶液中浸泡，換液至溶液不再變色后用蒸餾水反復沖洗，重新冷凍干燥。1.3 掃描電鏡觀察將樣品裁剪成直徑4 mm高2 mm大小的小片，真空噴金后，掃描電鏡觀察表面結構和孔徑變化，選擇合適的放大倍數拍攝掃描照片。1.4 交聯度測定參照Mi的方法采用茚三酮法測定交聯度3。具體為：1.05 g的檸檬酸和10 ml(1.0 mol/L)的NaOH和0.04 g的氯化亞錫(SnCl2·2H2O)混合，加去離子水調至25 ml，另

13、將1 g的茚三酮加入25 ml乙二醇甲醚中，再將上述兩液體混合攪拌45 min，制成茚三酮溶液，避光保存。稱取樣品，加入4 ml茚三酮溶液，100水浴20 min，冷卻至室溫，加20 ml 50%異丙醇溶液，用分光光度計在570 nm下測量吸光度。用甘氨酸溶液做標準曲線，并通過此標準曲線查找各樣本中自由氨基酸的摩爾數。所有反應均在暗室進行。以Mo表示未加京尼平的相應支架中含自由氨基酸摩爾數，Mt表示各組交聯樣品中氨基酸摩爾數，按以下公式計算各組材料的交聯度：交聯度=(Mo-Mt)/Mo×100%。1.5 降解率測定各組受試材料分別稱重(Wo)，將材料放回離心管中封裝好，環氧乙烷消毒，

14、然后加25 ml PBS溶液，3 d換液1次，1，2，4周取出，蒸餾水反復沖洗后再次凍干后稱重(Wt)。降解率=(Wo-Wt)/Wo×100%。1.6 溶脹率測定稱取支架在干態時的質量為Wo，然后將支架在PBS中浸泡24 h后小心取出，用濾紙吸干表面的水分，稱重為Wt，則支架溶脹率=(Wt-Wo)/Wo×100%。1.7 細胞毒性實驗將京尼平交聯的膠原/殼聚糖切成直徑4 mm高2 mm大小，Co60照射消毒。參照胡聲鎖等的方法制備兔成體脂肪干細胞4，消化狀態較好處于對數生長期的兔脂肪干細胞調整濃度至1×106/ml，負壓接種于支架上，在37、5%CO2、飽和濕度條件下孵育4 h后將細胞支架復合體置入96孔板，每孔加入培養液200 l，設為實驗組。將細胞以密度為1×104/ml直接接種于96孔板，每孔200 l，設為對照組。另將單純材料加入96孔板，每孔加入培養液200 l，設為實驗調零組，空白孔加入培養液200 l，設為對照調零組。在37、5%CO2、飽和濕度條件下孵育，培養液繼續培養，隔天換液。培養1、3、5、7、14 d MTT法檢測細胞活力，實驗組、對照組分別