1、細胞實驗的基本操作細胞培養】 一、細胞的復蘇：非原代培養的細胞一般凍存于液氮之中，需要培養時要先從液氮中取出使之復蘇。細胞復蘇的原則快速融化：必須將凍存在-196C液氮中的細胞快速融化至37C，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細 胞形成再結晶，對細胞造成損害。具體操作如下：1 、實驗前準備：1.1、將水浴鍋預熱至37C，并將含10%FBS的培養液置于其中預熱;1.2、用75%酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。1.3、在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養瓶等等2、取出凍存管及迅速解凍：2.1、根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。2.2、從液氮

2、罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。2.3、迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使 管中的液體迅速融化，約 1-2min 后凍存管內液體完全溶解，取出用酒精棉球擦 拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內。3、平衡離心 將細胞懸液吸到離心管中，1000- 1500rpm離心3分鐘；4、制備細胞懸液 吸去上清液，加入10 ml培養液，用吸管輕輕吹打均勻，使細 胞懸浮；5、細胞計數細胞濃度以5X 105/ml為宜。6、培養細胞 將復合細胞計數要求的細胞懸液吸到培養瓶中，將培養瓶放入 37C和5%CO2的培養箱內培養（略微擰松培養瓶蓋），換液的時間由細胞情況 而定。通

3、常，除少數特別注明對 DMSO 敏感的細胞外， 絕大部分細胞株（包括 懸浮性細胞）， 在解凍之后， 可直接放入含有 10-15ml（ 5 10 倍）新鮮培養基 的培養角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養基以去除 DMSO 即可， 如此可避免大 部分解凍后細胞無法生長或貼附的問題。二、細胞的傳代：培養的細胞生長至一定密度之后，由于培養液中營養逐漸消耗、代謝物逐步積 累（可見到培養液變黃），而且細胞的生長空間也受到限制，就會影響到細胞 的繼續生存。這時就需要分離出一部分細胞和更新培養液，這一過程就叫做傳 代。1、貼壁細胞的傳代 具體操作如下：1.1、傳代前準備：1.1.1、 預熱培養用液：把裝有培養液、

4、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37C水浴鍋 內預熱。1.1.2、用 75酒精擦拭雙手和經過紫外線照射的超凈工作臺1.1.3、正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少 污染。1.1.4、點燃酒精燈：注意火焰不能太小。1.1.5、準備好將要使用的已滅菌的空培養瓶。1.1.6、取出已經預熱好的培養用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內。1.1.7、從培養箱內取出細胞，注意取出細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯 微鏡的臺面，再在鏡下觀察細胞，并做好記錄。1.1.8、細胞培養瓶經用 75酒精擦拭后，再放入超凈臺1.2、胰蛋白酶消化： 1.2.1、將瓶蓋過酒精燈火焰消毒后，打開瓶蓋，靠

5、近酒精燈，小心吸出舊培養 液，用PBS清洗2- 3次，沿壁（無細胞的一面）緩緩加入適量消化液（胰蛋白酶液），輕輕搖晃。注意消 化液的量以蓋住細胞最好，最佳消化溫度是37C。1.2.2、顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質回縮，細胞之 間不再連接成片，表明此時細胞消化適度。1.3、吹打分散細胞：1.3.1、棄去大部分消化液（僅留少量在瓶內），并輕輕拍打培養瓶，使細胞分 散，然后加入新鮮的培養液，再用吸管輕輕吹打成細胞懸液（盡可能不要出現泡沫，否則對細胞有損傷1.4、分裝稀釋細胞1.4.1、將細胞懸液吸出分裝至 2-3個培養瓶中，加入適量培養基旋緊瓶蓋。1.4.2、倒置顯微鏡下觀察細

6、胞量，必要時計數。注意密度過小會影響傳代細胞 的生長，傳代細胞的密度應該不低于5X 105/ml。最后在瓶上做好標記，如細胞代數、日期及姓名等。1.5、繼續培養：1.5.1、用酒精棉球擦拭培養瓶，適當旋松瓶蓋，放入 CO2 培養箱中繼續培養。 傳代細胞 2 小時后開始貼附在瓶壁上。當生長細胞鋪展面積占培養瓶底面積 25時為一個，占 50為，占 75時為 2、懸浮細胞的傳代懸浮細胞可以直接將培養瓶中的液體吸掉，只留下少量，然后加入新鮮培養液 即可。 當細胞懸液中碎片或顆粒物較多，感覺到比較臟時，可以將懸液移到離 心管內，1000- 1500rpm離心3分鐘，棄上清，加入約2ml培養液，吹打至均

7、勻，滴加 2-3滴至已加入新鮮培養液的培養瓶中。然后置于二氧化碳培養箱中培 養（擰松培養瓶蓋）。三、細胞的凍存細胞凍存的原則是要逐步緩慢降溫，以避免細胞內部形成冰晶對細胞造成傷 害。1 、具體操作如下：1.1、從增值期到形成致密單層以前的細胞都可以用于凍存，但最好選擇對數增 長期細胞，已長滿的細胞凍存復蘇后生存率低。在凍存前一天最好換一次培養 液。1.2、貼壁細胞經消化、離心（1000- 1500rpm, 5min）收集，懸浮細胞經離心收 集；1.3大約106個細胞加入1ml凍存液（10% DMSO+90%血清），用吸管吹打， 使細胞分散成單細胞懸液；1.4加入到凍存管中，每個凍存管加1- 1

8、.5ml的細胞懸液；密封；1.5、在凍存管上標明細胞名稱及凍存日期；1.6將凍存管直立放置于塑料盒或紙盒內，管置于 4C半小時，然后置于-20C 兩小時，再置于-70C兩小時，然后置于液氮上方過夜；第二天將細胞置于液氮 中；1.7、記下凍存管存放的位置，作好凍存記錄（凍存的細胞名稱、代數、凍存日 期等）。2、注意事項：2.1、使用 DMSO 前，不需要進行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌 反而會破華它的分子結構，以至于降低冷凍保護效果。在常溫下， DMSO 對人體有害，故在配制時最好戴上 手套操作。2.2、不宜將凍存細胞放置在0C-60C這一溫度范圍內過久，低溫損傷主要發 生在這一溫度

9、區內，是“危險溫區”。2.3、注意定期檢查液氮罐內液氮量，及時添加。2.4、細胞在液氮中貯存的時間理論上是無限的。但為妥善起見，特別是很多未 被凍存過的細胞在首次凍存后要在短期內復蘇一次，觀察細胞對凍存的適應性。已建系的細胞最好也每年 取一支復蘇一次后，再繼續凍存。四、細胞計數實驗原理：當待測細胞懸液中細胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中 的細胞的數目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數目。具體操作如下：1、準備工作：取一瓶傳代的細胞，按上述二的傳代方法繁殖細胞，待長成單層 后以使用。2、細胞懸液制備：細胞懸液的制備方法：用 0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液 洗滌后，加入培養液（或

10、Hanks液或PBS等平衡鹽溶液），吹打制成待測單細 胞懸液。3、細胞計數：2.1、蓋好蓋玻片：取一套血球計數板，將特制的蓋玻片蓋在血球計數槽上。2.2、 制備計數用的細胞懸液：用吸管吸適量細胞懸液（如5 滴）到一離心管 中，加入等體積臺盼藍染液（ 0.4%）或苯胺黑，活細胞不會被染色，加入染液 后就可以在顯微鏡下區別活細胞和死細胞。若僅是單純的進行細胞計數，不考 慮細胞的活力，則可省略臺盼藍染色步驟。2.3、將細胞懸液滴入計數板：將待測細胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿 蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能 讓懸液流入旁邊槽中。2.4、統計四個大格的細胞數：將

11、血球計數板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移 動計數板，當看到鏡中出現計數方格后，數出四角的四個大格（每個大格含有 16個中鉻）中沒有被染液染上色的細胞數目。2.5、計算原細胞懸液的細胞數 :按照下面公式計算細胞密度：（細胞懸液的細胞數）/ml =（四個大格子細胞數/4） x2X 104說明：公式中除以 4 因為計數了 4 個大格的細胞數。公式中乘以 2 因為細胞懸液于染液是 1： 1 稀釋。公式中乘以 1 04因為計數板中每一個大格的體積為：1.0mm （長）x 1.0mm （寬）x 0.1mm （高）=0.1mm3 ;而 1ml= 1000mm3細胞計數要點： 進行細胞計數時，要求懸液中細胞數

12、目不低于104個/ml，如果細胞數目很少要進行離心再懸浮于少量培 養液中; 要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計數準確性。 取樣計數前，應充分混勻細胞懸液，尤其時多次取樣計數時更要注意每次取 樣都要混勻，以求計數準確； 數細胞的原則是只數完整的細胞，若細胞聚集成團時，只按照一個細胞計 算。如果細胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計右線，不計左線。 操作時，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新 計數。注： 4臺盼藍母液的配制：100毫升，用濾紙過濾，稱取 4 克臺盼藍，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至4C保存。使用時，用PBS稀釋至0.4%。五、細胞活力的測定1.

13、染料排斥試驗： 其原理是細胞損傷或死亡時，某些染料可穿透細胞膜，與解體的 DNA 結合，使 其著色。而活細胞則能阻止該染料進入細胞內。借此可鑒別死細胞和活細胞。 常用的染料有臺盼藍、伊紅 Y 和苯胺黑等。以臺盼藍染色為例。步驟同上述細胞計數的操作步驟。注意以下幾點 : 計數：在3 10min內，用血球計數板分別計數活細胞和死細胞（死細胞被染 成淡藍色，活細胞則拒染）。 臺盼藍染色時，時間不宜太長，否則活細胞也會著色，從而干擾計數。 活細胞率（%）=活細胞總數/（活細胞總數+死細胞總數）x 100%2、MTT 比色實驗：可測定測藥物或病毒的 IC50原理：活細胞線粒體琥珀酸脫氫酶催化四甲基偶氮唑

14、鹽 （MTT），還原成紫色不溶 性結晶物，沉積于細胞中。用酸性異丙醇或 DMSO 溶解后，于酶標儀上測定光 吸收值。紫色不溶性結晶物形成的多少與活細胞數目和功能狀態相關。2.1、將細胞接種于96孔板上，密度為大約105個/ml，每孔接種100認;2.2、培養至對數生長期加入待測樣品；2.3作用一定的時間之后，加入三蒸水配制的 5 0ml的MTT溶液，每孔20卩 l；2.4、37C溫育4小時；2.5、取出培養板，小心吸去上清，注意不要吸掉底部的藍紫色沉淀；如果是懸 浮細胞則用板離心機離心后除去上清；26每孔加入1001的DMSO,搖床上搖動30分鐘以使沉淀溶解；2.7、用酶聯免疫檢測儀（DNA

15、Expert ）在595nm （或490nm）波長處檢測96孔 平板中每孔細胞的光密度值（ OD 值），按下列公式計算藥物或病毒對細胞生長的抑制率：細胞存活率（%）=治療組 OD值/對照組OD值X 100%2.8、求出各藥物（或病毒）濃度下的 OD 值占對照 OD 值的百分比，用此百分 比對藥物（或病毒）濃度作圖；在所得的曲線上，百分比值為 50時所對應的濃度就是 IC50 值。或根據各濃度 下細胞的存活率，采用 Logit法計算 IC50。六、細胞的運輸裝運細胞的方法有兩種：1 、冷凍貯存運輸即利用特殊內內盛液氮或干冰凍存，保存效果較好，但較麻煩，且不能長時間 運輸，多需空運。2、充液法 2

16、.1、選生長狀態良好的細胞，去掉培養液，充滿新培養液，液量要達到培養瓶 頸部，擰緊螺帽或塞以膠塞，保留微量空氣。若空氣留量過多，運輸時大氣泡來回流動對細胞有干擾作用。2.2、妥善包裝、運輸。一般在四五天內到達目的地，對細胞活力無多大影響， 時間過長則細胞活力下降。2.3、到達目的地后，倒出大部分培養液，保留維持細胞生長所需的液量，置 37C培養,次日傳代。注：從其他研究室所取細胞時，應注意了解細胞的性狀、培養液、培養時的注 意事項等【 細胞轉染】一、脂質體轉染（ Lipofetmiane 2000）1、轉染前細胞的處理（以 24 孔板培養為例）：貼壁細胞：在轉染前一天，在 24孔板內鋪上0.5

17、X 105細胞，500ul無抗生素培 養基培養一天，到轉染時使細胞達到 80%90%的匯合率。懸浮細胞:在制備混合物前，將4 8X 105細胞用無抗生素培養基培養鋪鋪于 24 孔板內。2、轉染方法（以質粒 DNA 轉染為例）2.1、將 DNA 質粒溶于 50ul無血清的 Opti MEM I Reduced Serum Mediur中。 混合均勻。2.2、將適量Lipofectamine 2000溶于50ul無血清的Opti MEM I中，混合均 勻。在室溫下孵育 5 分鐘（在 2 5分鐘內進行步驟 c）。2.3孵育5分鐘后，將上述兩種混合物混合（總體積100u）。輕輕混合均勻在室溫下孵育 2

18、5分鐘（可能出現霧狀沉淀）。復合無在室溫下六小時內穩定。2.4、在24孔板中每孔加入100ul的復合物以及適量培養基。十字法混合均勻。2.5細胞在37。C CO2培養箱中培養18 48個小時后，測量轉染效率。在加完 復合物 4 6 小時候可更換培養基。3、轉染注意事項3.1、轉染嚴格來說，每種細胞的條件是不一樣的，如果實驗時，不能確定最佳 轉染條件，請在細胞實驗組共享文件夾查找類似細胞的轉染方法；3.2、轉染結果的好壞，與 DNA 質量密切相關，務必在實驗之前對去內毒素質 粒 DNA 的質量進行嚴格鑒定，至少采用以下兩種方法：瓊脂糖凝膠電泳和紫外 分光光度檢測，如果有條件，可對質粒 DNA 去

19、內毒素質量的進行檢測。細胞相關實驗操作方法【小量細胞樣品 TotalRNA 的提取方法】一、實驗步驟（以細胞為例）1.1、 細胞樣品（1.0X 107個）去上清之后，加入1ml TRIzol溶液反復吹打至溶 液清亮，轉移入1.5ml Tube中室溫下放置10min,如不能立即提取則放于-80C 保存（可保存一個月），提取時取出放于室溫融化；也可按照正常凍存方法保存1X 107個細胞，提取時37C迅速融化，5000rpm離心3min去除上清液后迅速 加入 1ml TRIzol 溶液反復吹打至溶液清亮,室溫下放置 10min；1.2、加入200ul氯仿（1/5TRIzol體積），先用槍混勻10-1

20、5下，再充分顛倒混 勻2min,使兩相充分混合，室溫靜置 3min;1.3 4C、10000g（ 12000rpm）離心 15min;1.4、小心吸取上清（中間有厚厚的蛋白層）至一新的1.5ml Tube中（可取干凈），加入0.5mI異丙醇（1/2 TRIzol體積）先用槍混勻10-15下，再充分顛倒 混勻2min,室溫放置10min;1.5 4C、10000g（ 12000rpm）離心 10min;1.6小心吸去上清液（注意不要吸起白色沉淀），加入1ml 70%乙醇（-20C預冷）旋轉漂洗 RNA 沉淀;1.7、4C、10000g（ 12000rpm）離心 5min;1.8小心吸去上清液，空

21、氣中干燥 2-3min,加入84ul DEPC水充分溶解RNA（如溶解困難，4C放置過夜）；將RNA稀釋5倍，電泳，（若是對 RNA 的質量要求不高,做到這一步即可,以下是純化的步驟）依次加入 2ul RNase Inhibitor40U/ul > , 10ul 10x DNase I Buffer, 4ul DNase IRNase Free 5U/ul >，充分混勻后 37C反應 60min;1.9 補加200ul DEPC水至總體積300u,再加入300ul PCI （DEPC水飽和）， 充分混勻 5min,室溫 10000g（ 12000rpmj）離心 10min;1.10

22、小心取上清（幾乎看不見中間層，取的較干凈）于一新的1.5ml Tube中，再 加入 300ul CI，充分混勻 5min，室溫 10000g（ 12000rpm）離心 10min;1.11、小心取出上清液 （幾乎看不見中間層,取的較干凈 ）于一新的 1.5ml Tube 中，加入30ul 3M CH3C00Na充分混勻1min后加入750ul無水乙醇（-20C預 冷），充分混勻2min, -20C放置40min;1.12、4C、10000g（ 12000rpm）離心15min,小心取出上清（可用槍取干凈）；1.13加入1ml 70%乙醇（DEPC水配制）（-20C預冷），旋轉振蕩清洗 RNA

23、沉淀，4C、10000g（ 12000rpm）離心 10min;1.14小心吸去上清液，室溫干燥 2-3min,加入80ul DEPC水溶解；1.15、分別取 2ul RNA 溶液溶于 10ul DEPC 水中，混勻后各取出 5ul 進行 1%瓊 脂糖凝膠電泳，根據電泳結果判定 RNA 是否有降解;1.16、按照電泳結果估計 RNA 濃度，按比例使用 TE Buffer （PH 8.0） 稀釋到 0.3 至 0.5OD 吸光度范圍內;二、實驗注意事項1.1、 整個實驗過程中應該使用橡膠手套和口罩，實驗前，使用70%乙醇擦拭雙 手和工作臺以及實驗用品;1.2、實驗用試劑必須保證質量，對 pH 值

24、有要求的必須以滅菌后的測量值為 準;1.3、貴重的樣品，抽完之后，必須取出一定量作為實驗室保存;1.4、 必要時，可以將槍頭剪掉一部分使用，以免RNA 大量斷裂。【PBS溶液的配制使用以及保存方法】一、試劑用途實驗中主要用來溶解稀釋固體試劑，形成含有緩沖體系的鹽離子溶液二、配制，使用和保存方法1、溶液配制按 1L 的標準量配制 稱取下列藥品：NaCl 8.0gNa2HPO4 1.15gKCl 0.2gKH2PO4 0.2g溶解、定容，使用實驗室用超純水；2、除菌實驗室采用過濾滅菌，使用0.22g的除菌膜；4C保存。3、使用使用過程中應該保證嚴格的無菌操作，為了防止污染，可用50ml無菌離心管對

25、dPBS進行分裝。【抗生素配制使用以及保存方法】一、原核細胞用抗生素細胞培養相關實驗中，為了防止培養過程中出現細菌污染，需要在培養基中添 加雙抗，即青霉素和鏈霉素。1、藥物使用濃度根據細胞種類的不同，一般（P/S ）的終濃度保持在100U/ml,具體的實驗過程 中，可以根據細胞對抗生素的敏感程度減少或增加雙抗用量，原則來說，抗生 素的使用范圍為： 50U/ml-200 U/ml 。2、藥物配制方法（干粉狀的抗生素）2.1、藥物溶解使用少量的dPBS溶液溶解干粉狀的抗生素，溶解過程中，應盡量減少dPBS的用量，使藥物保持在較高濃度；2.2、溶液除菌使用0.22口的除菌膜過濾，然后分裝，-20C保

26、存。2.3、日常使用按實驗要求的終濃度將抗生素溶液添加到培養基當中，注意無菌操作。2.4、注意事項 總的原則是現用現配，盡量減少溶液反復凍融次數，防止抗生素失效； 培養基最好是現用現配，在含有血清的完全培養基中，添加抗生素，應4C保存且有效使用期不能超過 1 個月。 抗生素并非越多越好，在實驗細胞條件不明確之前，應該先從最小使用量開 始。二、真核細胞用抗生素本實驗室現在常用的真核用篩選標記物主要有兩種：neomycin （ G41 8） 和Puromyci n,實驗中主要用來篩選細胞穩定株或者陽性細胞群落。1 、藥物配制和保存方法如下：藥品 保存 溶液配制G418 Prepared in a

27、highly buffered solution （e.g. 100 mM HEPES, pH 7.3, or cell culture medium）.本實驗室使用 dPBS, pH 7.3固體保存： SHELF (+20°C). This product is stable for 2 years液體保存： Following reconstitution, sterilize by filtration through a 0.22n or 0.45 卩 mm pore size filter, aliquot and freeze (-2°0C) for long

28、term storage or refrigerate (+4°C) for short-tern storage. assupplied. Sterile stock solutions are stable for at least 1 year at +4° C.Hygronycin B Sterile-filtered at 50 ng/nl active antibiotic in PBS; Sterile-filtered at 50 mg/ml active antibiotic in 50mM HEPES, PH7.2本實驗室使用 dPBS, pH 7.3

29、固 體保存： Storage at 兀,is stable for 2-3years assupplied.Puromycin Soluble in H2O(50 mg/ml)or methanol (20 mg/ml)本實驗室使用 dPBS， pH 7.3固體保存： Freezer(-2CC ).Protect from moisture. Follow ing recon stitutio n, sterilize by filtrati on through a 0.22 um pore-size filter,aliquot and freeze (-2().This product is atable for 2 years as supplied.液體保存： Stock so