1、基因表達的調控和基因工程（一）名詞解釋1.操縱子；2.啟動子；3.增強子；4.衰減子；5.反式作用因子；6.降解物基因活 化蛋白；7.克隆技術；8.限制性核酸內切酶； 9.基因組DNA文庫；10. cDNA文庫。（二）填充題1 .正調控和負調控是基因表達的兩種最基本的調節形式，其中原核細胞常用 模式，而真核細胞常用 模式。2 .在原核細胞中，由同一調控區控制的一群功能相關的結構基因組成一個基因表達調 控單位，稱為 ,其調控區包括 基因和 基因。3 .有些基因的表達較少受環境的影響，在一個生物體的幾乎所有細胞中持續表達，因此被稱為 ;另有一些基因表達極易受環境的影響，在特定環境信號刺激下，相應的

2、基 因被激活，基因表達產物增加，這種基因是可 的基因，相反，如果基因對環境信號 應答時被抑制，這種基因是可 的基因。4 .在基因重組技術中，切割DNAffl,連接DN刖。5 .除噬菌體外， 和 也是分子克隆的常用載體。6 .用動物病毒DNAa造的基因載體有 和。用于植物基因工程的常用載體是 O7 .將重組質粒導入細菌稱 ,將噬菌體 DNA專入細菌稱 。8 .Southern印跡法、Northern印跡法和 Western印跡法是分別用于研究 、 和 轉移和鑒定的幾種常規技術。（三）選擇題（在備選答案中選出1個或多個正確答案）1. 一個操縱子通常含有A. 一個啟動序列和一個編碼基因B. 一個啟動

3、序列和數個編碼基因C.數個啟動序列和一個編碼基因D. 數個啟動序列和數個編碼基因E兩個啟動序列和數個編碼基因2 .有關操縱子學說的論述，正確的是A.操縱子調控系統是真核生物基因調控的主要方式B.操縱子調控系統是原核生物基因調控的主要方式C.操縱子調控系統由調節基因、操縱基因、啟動子和結構基因組成D.誘導物與阻遏蛋白結合啟動轉錄E.誘導物與啟動子結合而啟動轉錄3 .轉錄因子是A.調節DNA結合活性的小分子代謝效應物B.調節轉錄延伸速度的蛋白質C.調節轉錄起始速度的蛋白質D.調節轉錄產物分解速度的蛋白質E.促進轉錄產物加工的蛋白質4 .阻遏蛋白（阻抑蛋白）識別操縱子中的A.啟動基因 B.結構基因

4、C.操縱基因 D.內含子 E.調節基因5 .在下列哪種情況下，乳糖操縱子的轉錄活性最高A.高乳糖，低葡萄糖B.高乳糖，高葡萄糖C.低乳糖，低葡萄糖D.低乳糖，高葡萄糖E.不一定6 .順式作用元件是指A.基因的5,側翼序列 B.基因的3,側翼序列C.基因的5,和3,側翼序列D.基因的5,和3,側翼序列以外的序列E. 具有轉錄調節功能的特異DNA序列7 .反式作用因子是指A.具有激活功能的調節蛋白B.具有抑制功能的調節蛋白C.對自身基因具有激活功能的調節蛋白D.對另一基因具有激活功能的調節蛋白E.對另一基因有調節功能的蛋白質因子8 .下列關于限制性內切酶的敘述哪一項是錯誤的A.它能識別DNA寺定的

5、堿基順序，并在特定的位點切斷DNAB.切割點附近的堿基順序一般呈回文結構C.它能專一性降解經甲基化修飾的DNAD.是重組DNA的重要工具酶E.主要從細菌中獲得9 .基因工程中，不常用到的酶是A.限制性核酸內切酶B.DNA 聚合酶 C.DNA 解鏈酶 D.DNA 連接酶 E.反轉錄酶10下列哪項不能作為表達載體導入真核細胞的方法？A.磷酸鈣轉染B.電穿孔 C.脂質體轉染D.氯化鈣轉染E. 顯微注射11 .重組體的篩選方法有A.抗藥標志篩選B.標記補救C.分子雜交D.免疫化學 E.酶聯免疫檢測12 .CDNA 是指A.在體內合成的與病毒 DNAe RNA5補的DNAB.在體外經反轉錄合成的與 DN

6、A互補的DNAC.在體外經轉錄合成的與 DNA互補的RNAD.在體外經反轉錄合成的與 RNA互補的DNAE.在體內經轉錄合成的與 DNAM補的RNA13 .建cDNA文庫時，首先需分離細胞的A.染色體 DNA B.線粒體 DNA C.總 mRNA D.tRNA E.rRNA （四）判斷題1 .高等真核生物的大部分 DNA是不為蛋白質編碼的。2 .大多數管家基因編碼低豐度的mRNA.3 .乳糖可以誘導乳糖操縱子的表達，所以乳糖對乳糖操縱子的調控屬于正調控系統。4 .某些蛋白質既可以作為阻遏蛋白又可以作為激活蛋白參與基因表達的調控。5 .準備用原核生物表達真核基因時，最好通過CDNA獲取目的基因。

7、6 .用原核生物表達真核生物的糖蛋白，其表達產物不會有正常的生物學功能。7 .Ti質粒可以隨土壤農桿菌進入植物細胞。8 .用入噬菌體作克隆載體時，外源DNA片斷越小，克隆的成功率越高。9 .基因克隆選擇的宿主細胞必須無限制性核酸內切酶。10 .采用藍白斑選擇法時，藍色菌落或噬菌斑是含有重組載體的克隆。（五）分析與計算題1 .簡述操縱子的基本結構。2 .舉例說明基因表達的誘導與阻遏，正調控與負調控。3 .概述原核生物基因表達調控的特點。4 .概述真核生物基因組的特點。5 .概述真核生物基因表達調控的特點。6 .簡答真核生物基因表達的調控方式。7 .常用的限制性核酸內切酶有哪些特點？8 .在基因克

8、隆中，目的基因有哪些主要來源？9 .什么是cDNA文庫？ cDNAC庫與基因組文庫有何差別？10 .用于DNA重組的載體應具備什么條件？常用的載體有哪一些？各有何特點？11 .簡述連接目的基因與載體的主要方法？12 .概述篩選和鑒定 DNAt組體的常用方法。參考答案（一）名詞解釋1 .原核生物的幾個功能相關的結構基因往往排列在一起，轉錄生成一個mRNA然后分別翻譯成幾種不同的蛋白質。這些蛋白可能是催化某一代謝過程的酶，或共同完成某種功能。這些結構基因與其上游的啟動子，操縱基因共同構成轉錄單位，稱操縱子。 順式調控元件：指可影響自身基因表達活性的真核DNA序列。根據順式作用元件在基因中的位置、轉

9、錄激活作用的性質及發揮作用的方式，分為啟動子、增強子及沉默子等。2 .是RNAm合酶結合位點周圍的一組轉錄控制組件，包括至少一個轉錄起始點。 在真核基因中增強子和啟動子常交錯覆蓋或連續。 有時，將結構密切聯系而無法區分的啟動子、 增 強子樣結構統稱啟動子。3 .是一種能夠提高轉錄效率的順式調控元件，最早是在SV40病毒中發現的長約 200bp的一段DNA可使旁側的基因轉錄提高 100倍，其后在多種真核生物，甚至在原核生物中都 發現了增強子。增強子通常占100200bp長度，也和啟動子一樣由若干組件構成，基本核心組件常為812bp,可以單拷貝或多拷貝串連形式存在。4 .在原核生物的Trp操縱子結

10、構中，第一個結構基因與啟動子 P之間有一個區域含 Trp 密碼子，稱衰減子。當環境中Trp濃度很高時，它可通過編碼并翻譯，使正在轉錄的mRNA形成終止信號，從而終止Trp操縱子的表達。這種轉錄衰減實質上是轉錄與一個前導肽翻譯 過程的偶聯，它是原核生物特有的一種基因調控機制。5 .大多數真核轉錄調節因子由某一基因表達后，通過與特異的順式作用元件相互作用 （DNA-蛋白質相互作用），或通過與基它調節因子的相互作用（蛋白質-蛋白質相互作用），反式激活另一基因的轉錄，故稱反式作用蛋白或反式作用因子。6 .也就是cAMP受體蛋白（cAMPreceptor protein,CRP ）,它與cAMP的復合物

11、可以促進 某些原核操縱子（如乳糖操縱子）的轉錄。7 . “克隆”作為名詞指相同的分子或細胞構成的群體，或一個共同的祖先通過無性繁 殖所得到的群體，作為動詞指獲取“克隆”的過程。克隆技術特指獲取“克隆”的過程，包 括分子克隆，細胞克隆等技術。8 .就是識別DNA勺特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA勺一類核酸內切酶。限制性核酸內切酶存在于細菌體內，與相伴存在的甲基化酶共同構成細菌的限制、修飾體系，限制外源DNA保護自身DNA對保持細菌遺傳物質的穩定具有重要意義。限制性核酸內切 酶分為三類，其中的H類酶能特異性在一定的核甘酸序列處切割雙鏈DNA因而在基因工程中得到廣泛的應用。9 .利用限制

12、性核酸內切酶將染色體DNAU割成一定大小的片段，將這些片段分子與適當的克隆載體拼接成重組 DNA分子，繼而轉入受體菌，使每個細菌內都攜帶一種重組DN6子。不同細菌中的重組 DN6子可能包含不同的染色體DNA片段，這樣，只要得到的轉化細菌所攜帶的重組DNA分子種類足夠多，則全部轉化細菌所攜帶的各種染色體片段就代表了染色體 的整個基因組。存在于轉化細菌內，由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA片段的集合稱基因組DNA文庫。基因組 DNA文庫涵蓋了基因組的全部基因信息。10 .以mRN朋模板，經反轉錄酶催化，在體外反轉錄成cDNA與適當的載體(常用噬菌體或質粒載體)連接后轉化受體菌，則每個細菌含有一段c

13、DNA并能繁殖擴增，這樣包含著細胞全部 mRNA言息的cDNA克隆集合稱為該組織細胞的 cDNA文庫。基因組含有的基因 在特定的組織細胞中只有一部分表達，而且處在不同環境條件、 不同分化時期的細胞其基因表達的種類和強度也不盡相同，所以cDNA文庫具有組織細胞特異性。cDNA文庫顯然比基因組DNA文庫小得多，能夠比較容易從中篩選克隆得到細胞特異表達的基因。另外，對真核細胞來說，從基因組 DNAt庫獲得的基因與從 cDNA文庫獲得的不同，基因組 DNA文庫所含的 是帶有內含子和外顯子的基因組基因，而從cDNA文庫中獲得的是已經過剪接，去除了內含子的cDNA 一般來說，從cDNA文庫獲得的基因，因不

14、含內含子而片段較小，更適合于用作 基因工程的目的基因。由于原核生物不存在將hnRN劭口工成mRNA勺酶系統，若用原核生物表達真核基因，則目的基因一定要通過cDNA獲取。(二)填充題1. 負調控，正調控；2.啟動子，啟動，操縱； 3.管家基因，誘導，阻遏； 4.限制性核酸內切，DNA連接；5.質粒，病毒；6.腺病毒載體，反轉錄病載體，Ti質粒。7.轉化，轉導；8. DNA, RNA,蛋白質；(三)選擇題(在備選答案中選出1個或多個正確答案)2. (B)操縱子均含有數個編碼基因，但啟動序列只有1個。3. (B, C, D)操縱子調控系統由調節基因，操縱基因，啟動子和多個結構基因組成， 是原核生物基

15、因表達調控的主要方式，誘導物與組遏蛋白結合啟動轉錄。誘導物不能直接與啟動子結合。真核生物不存在操縱子調控系統。4. (C)轉錄因子是調節轉錄起始的蛋白質，對轉錄延伸的速度，轉錄產物分解的速度 和轉錄產物的加工均無影響。5. (C)操縱基因位于啟動基因與結構基因之間，阻遏蛋白與操縱基因結合后，與啟動 基因結合的RNA聚合酶不能轉錄結構基因。6. (A)參與乳糖代謝的三種酶的表達同時受控于正負調控兩種機制，只有在正調控發 揮作用，負調控不起作用的時候，這三種酶才能有效的表達。當培養基中加入乳糖的時候， 參與負調控的阻遏蛋白將失去活性，但如果培養基中含有葡萄糖，則細菌優先利用葡萄糖， 這時參與乳糖代

16、謝的酶仍然不能有效的表達，這是因為葡萄糖降低了細胞內的cAMP7K平，而cAMP度的降低，導致降解物激活蛋白喪失活性，正調控的機制失去作用，這時三種酶 不可能正常的表達。7. (E)順式作用元件是對某基因自身有調節功能的DNA序列，其中的啟動子多在基因的5/側翼，但增強子既可以在 5/側翼，又可以在 3/側翼，一般距基因較遠。有些順式 作用元件甚至可以在基因內部。8. (E)反式作用因子是指對另一基因的表達有激活或抑制作用的蛋白質因子。9. (Q限制性核酸內切酶主要存在于細菌，它可以水解外源DNA而自身DNA因在特定位點被甲基化而可以免遭水解。限制性核酸內切酶由于可識別特定的堿基序列并在特定的

17、 位點切割雙鏈DNA因而在基因工程中得到廣泛的使用。10. (Q DNA聚合酶可用來獲取目的基因，測序和PCR等項工作，限制性核酸內切酶用于DNA酶切片段長度的多態性分析，載體和目的基因的特異性切割等工作，DNA1接酶可用于基因重組的連接反應。DNAB鏈酶在基因工程中幾乎用不到。11. (D) CaCl2處理受體細胞是提高細菌轉化率的常用方法，不適用于真核生物，題中 列出的其余4種方法均可用于將表達載體導入真核細胞。12. (A, B, C, D, E)題中列出的5種方法均可用于重組體的篩選。13. (D) cDNA指在體外經反轉錄合成的與RNA互補的DNA14. （C） cDNA文庫應包含某

18、一細胞在某一狀態下所表達的基因，因此，構建cDNAC庫首先要分離細胞的總 mRNA（四）判斷題1 .對。高等真核生物的 DNA中含有不少高度重復序列的非編碼序列，基因內部又有內 含子，不少基因內含子的總長度遠遠大于外顯子。因此，真核生物的編碼區只占DNA總長度的一小部分，一般認為，編碼區不超過總長度的5%。2 .對。管家基因是才!續表達的，mRNA豐度不高，但壽命較長，翻譯效率較高。3 .錯。乳糖被轉化為別乳糖后，與乳糖操縱子調節基因產生的阻遏蛋白結合，使阻遏蛋 白失去活性。由于這一調控方式起作用的是阻遏蛋白，故屬于負調控。4 .對。某些蛋白質能夠與 DNA分子的不同區域結合，分別發揮激活蛋白

19、或阻遏蛋白的 作用。5 .對。真核生物的基因多數含有內含子，原核生物缺乏從轉錄初級產物切除內含子的加 工系統，另外，如果將基因組 DNA作為目的基因，基因片段因含有內含子而過大，也會降 低基因轉移的成功率。cDNA是以成熟mRNA為模板經過反轉錄制成的，不含內含子，適 合于作為目的基因用于基因的克隆或表達。6 .對。原核生物缺乏真核生物的翻譯后加工系統。不能對蛋白質進行糖基化。因此，表 達糖蛋白要用真核表達系統。7 .錯。土壤農桿菌可以促進 Ti質粒進入植物細胞，但農桿菌本身并不進入植物細胞。8 .錯。入噬菌體的外殼蛋白只能包裝長度為人噬菌體DNA78%105%的DNA ,若外源DNA片段太小

20、，重組體DNA的長度小于K噬菌體DNA的78%,就不能在體外包裝成噬菌 體，因而，克隆很難成功。9 .對。如果宿主細胞有限制性核酸內切酶，將會水解進入宿主細胞的重組體DNA ,導致克隆失敗。10 .錯。采用藍的斑選擇法時，克隆位點被選在表達口-肽的基因內，含有空載體的受體菌可以在IPTG （異丙基硫代-P-D-半乳糖甘）的誘導下，表達 ot-肽，通過與受體菌的 a - 互補，能夠水解 X-gal （5-澳-4氯-3-口引喋-P-D-半乳糖甘）生成藍色的水解產物，因而菌落 或噬菌斑為藍色。含有重組DNA的受體菌，由于外源基因插入表達 a-肽的基因內，不能表 達a-肽，因而，菌落或噬菌斑為白色。（

21、五）分析與計算題1 .操縱子的調控區有一個操縱序列，一個啟動序列及一個CAP位點，調控區下游有幾個結構基因，還有一個調節基因編碼阻遏蛋白，阻遏蛋白與操縱序列結合， 使操縱子受阻遏而處于關閉狀態。若 cAMP與CAP結合，形成的復合物與 CAP位點結合，可增大操縱子 的轉錄活性。阻遏蛋白的負性調節和CAP的正性調節共同調節結構基因的表達，操縱子機制在原核基因表達調控中具有較善遍的意義，因其多是幾個功能相關基因串聯于同一操縱子上，故在同一啟動序列控制下， 可轉錄出能為多種蛋白質編碼的mRNA ,即多順反子mRNA。2 .在特定的環境信號刺激下，相應的基因被激活，基因表達產物增加，則這種基因是可誘導

22、的。可誘導基因在特定的環境中表達增強的過程稱為誘導。例如有 DNA損傷時，修復 酶基因就會在細菌內被誘導激活，使修復酶的活性增加。相反，如果基因對環境信號應答時被抑制則這種基因是可阻遏的，可阻遏基因表達產物水平降低的過程稱為阻遏，例如，當培養液中色氨酸供應充分時， 在細菌內編碼色氨酸合成相關酶的基因表達會被抑制。如果某種基因在沒有調節蛋白存在時是表達的，加入某種調節蛋白后基因表達活性便被關閉，這樣的控制為負調控。例如，乳糖操縱子。相反，若某種基因在沒有調節蛋白存在時是關閉的，加 入某種調節蛋白后基因活性就被開啟，這種控制稱為正調控。例如代謝物阻遏。3 .原核基因表達調控與真核存在很多共同之處，

23、但因原核生物沒有細胞核和亞細胞結構，其基因組結構要比真核生物簡單，基因表達的調控因此而比較簡單。雖然原核基因的表達也受轉錄起始、轉錄終止、翻譯調控及 RNA、蛋白質的穩定性等多級調控，但其表達開、 關的關鍵機制主要發生在轉錄起始。其特點包括以下3方面：（1） b因子決定RNA聚合酶的識別特異性：原核生物只有一種RNA聚合酶，核心酶催化轉錄的延長，仃亞基識別特異啟動序列，即不同的仃因子協助啟動不同基因的轉錄。（2）操縱子模型的普遍性：除個別基因外，原核生物絕大數基因按功能相關性成簇地連續排列在染色體上，共同組成一個轉錄單位即操縱子，如乳糖操縱子等。一個操縱子含一個啟動序列及數個編碼基因。在同一個

24、啟動序列控制下，轉錄出多順反子mRNA o （3）阻遏蛋白與阻遏機制的普遍性：在很多原核操縱子系統，特異的阻遏蛋白是控制啟動序列活性的重要因素。當阻遏蛋白與操縱基因結合或解離時，結構基因的轉錄被阻遏或去阻遏。4 （1）基因組結構龐大：哺乳動物基因組DNA由約3Ml09bp的核甘酸組成。大約有 3萬個左右的基因，90%以上的DNA不為蛋白質編碼。真核細胞 DNA與組蛋白結合形成復 雜的染色質結構，基因表達調控機制更加復雜。（2）單順反子：真核基因轉錄產物為單順反子，即一個編碼基因轉錄生成一個mRNA分子，經翻譯生成一條多肽鏈。許多蛋白質由幾條不同的多肽鏈組成，因此存在多個基因的協調表達。（3）重

25、復序列：重復序列在真核 DNA中普遍存在，重復序列長短不一，短的在 10個核甘酸以下，長的達數百，乃至上千個核昔 酸。據重復頻率不同分為高度重復序列、中度重復序列及單拷貝序列。（4）基因的不連續性：結構基因的兩側有不被轉錄的非編碼序列，往往是基因表達的調控區。在編碼基因內部有一些不為蛋白質編碼的間隔序列，稱內含子，而編碼序列稱外顯子， 因此真核基因是不連續的。5.同原核生物一樣，真核基因表達調控的最基本環節也是轉錄起始，而且某些機制是相 同的，但也存在明顯差別：（1） RNA聚合酶：真核有3種RNA聚合酶，分別負責3種RNA 轉錄。（2）活性染色質結構變化：當基因被激活時，可觀察到染色體相應區

26、域發生結構和性 質變化。包括對核酸酶敏感，DNA拓撲結構變化，DNA堿基修飾變化和組蛋白變化。（3）正調節占主導地位：真核 RNA聚合酶對啟動子的親和力極小或根本沒有實質性的親和力， 二者的結合必須依賴一種或多種激活蛋白。盡管發現少量基因存在負性順式作用元件，但普遍存在的是正性調節機制。（4）轉錄與翻譯分隔進行：真核細胞有胞核及胞質等區間分布，轉錄與翻譯在不同亞細胞結構中進行。（5）轉錄后加工：真核基因的內含子和外顯子均被轉錄，內含子在轉錄后要被剪接去除，使外顯子連接在一起，形成成熟的mRNA。不同剪接方式可形成不同的 mRNA ,翻譯出不同的多肽鏈。因此，轉錄后加工是真核基因表達調控 的另一

27、重要環節。6. （1） DNA水平的調控：a.基因丟失，即DNA片段或部分染色體的丟失，如蛔蟲胚胎 發育過程有27%的DNA丟失。b.基因擴增，即特定基因在特定階段的選擇性擴增，如非洲 爪蟾卵母細胞中的 rDNA是體細胞的4000倍。c.DNA序列的重排，如哺乳動物免疫球蛋 白各編碼區的連接。d.染色質結構的變化，通過異染色質關閉某些基因的表達。e.DNA的修飾，如DNA的甲基化關閉某些基因的活性。（2）轉錄水平的調控 。a.染色質的活化，如核小體結構的解開、非組蛋白的作用等。b.轉錄因子的作用，轉錄因子與RNA聚合酶及特定的DNA序列（啟動子、增強子）相互作用實現對轉錄的調控。（3）轉錄后水

28、平的調控。a.mRNA前體的加工，如 51端加帽、3'端加尾、拼接、修飾、編輯等。B.mRNA的選擇性拼接，如抗體基因的選擇性拼接。（4）翻譯水平的調控。a.控制mRNA的穩定性，如5'端的帽子結構、3'端polyA尾巴和mRNA與蛋白質的結合有利于 mRNA的穩定。b.反義 RNA的作用，反義RNA可以選擇性抑制某些基因的表達。c.選擇性翻譯，如血紅素缺乏時，通過級聯反應使 eIF2磷酸化。d.抑制翻譯的起始。（5）翻譯后水平的調控。 a.多肽鏈的加工 和折疊，如糖基化、乙酰化、磷酸化、二硫鍵形成、蛋白質的降解。b.氨基酸的重排，如合成伴刀豆蛋白A時，氨基酸序列大幅度

29、地被剪接重排。c.通過肽鏈的斷裂等的加工方式產生不同的活性多肽。7. n型限制性核酸內切酶（限制酶）是基因工程中常用的重要工具酶，是一類能識別雙鏈DNA分子中特異核甘酸序列的核酸內切酶，常用的限制酶主要有以下特點：（1）均來自于微生物，并以其來源的微生物學名進行命名；（2）相對分子質量小，僅需M作為輔助因子，無需ATP; （3）識別特異性DNAOt順序，在序列內特異切割產生特異性DNA段；（4）識別序列長度為連續的 4/6/8bp ; （5）識別序列呈二重旋轉對稱，稱回文結構，富含 GC （6） 有3種切口： 5'端突出的黏性末端（如 Hind m） , 3'端突出的黏性末端（

30、如 Pst I）和平 末端（如H加工）。8. （1）從染色體 DNA中直接分離：主要針對原核生物。（2）化學合成法：由已知多肽的氨基酸序列，推得編碼這些氨基酸的核甘酸序列，利用DN蛤成儀人工合成其基因。（3）從基因組DNA文庫中篩選分離組織/細胞染色體DNA利用限制性核酸內切酶將染色體DNA切割成片段，與適當的克隆載體連接后轉入受體菌擴增，即獲得基因組DNA文庫，用核酸探針將所需目的基因從基因文庫中“釣”取出來。（4）從文庫中篩選 cDNA提取mRNA利用反轉錄酶合成與其互補的 DNA（cDNA分子，再復制成雙鏈 cDNA片段，與適當載體連接后 轉入受體菌，即獲得 cDNA文庫，然后采用適當方

31、法從 cDNA文庫中篩選出目的 cDNA （5） 用PCR從基因組DNAe cDNA中擴增目的基因。9 .同mRNAT補的DNA為cDNA cDNA文庫是以某一細胞的總 mRN徼模板，在無細胞 系統中，在反轉錄酶的作用下，首先合成互補DNA的第一鏈，破壞RNA莫板后，再以第一鏈為模板合成第二鏈， 得到雙鏈cDNA選用適合的載體，與合成的cDNA重組，導入寄主細胞， 經篩選得到的cDNA克隆群稱為cDNA文庫。由于cDNA技術合成的是不含內含子的功能基因， 因此是克隆真核生物基因的一種通用方法。由于細胞內的基因在表達的時間上并非是統一 的，具有發育的階段性和時間性，有些則需要特殊的環境條件。所以

32、，cDNA文庫不可能構建得十分完全，也就是說任何一個cDNA文庫都不可能包含某一生物的全部編碼基因。cDNA文庫與基因組文庫的主要差別是：（1）基因組文庫克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列，cDNA文庫克隆的是具有蛋白質產物的結構基因，包括調節基因。（2）基因組文庫克隆的是全部遺傳信息，不受時空影響，cDNA文庫克隆的是被轉錄 DNA序列（因它受發育和調控因子的影響）。（3）基因組文庫中的編碼基因是含有內含子和外顯子，而cDNA克隆的基因不含內含子。10 .DNA重組載體應具備的條件：（1）能自主復制；（2）具有一種或多種限制性內切酶 的單一切割位點，并在位點中插入外源基因后，不影響其

33、復制功能；（3）具有12個篩選標記；（4）克隆載體必須是安全的， 不應含有對受體細胞有害的基因，并且不會任意轉入其他生物細胞；（5）易于操作，轉化效率高。常用的基因載體有以下幾種：（1）質粒：是細菌染色體以外的小型環狀雙鏈 DN6子，本身有復制功能，且帶有某些選擇信息， 但可插入的 目的基因片段較小。（2）噬菌體DNA是一種病毒 DNA能插入比較大的外源 DNA片段，在 DNA子上有多種限制性核酸內切酶識別位點，便于多種外源DNA酶切片段的克隆。（4）柯斯質粒載體和酵母人工染色體：前者結合了質粒和 九噬菌體載體的優點， 也是一種環形雙鏈DNA子，具有質粒的性質，可以轉化大腸桿菌，并自行復制和增

34、殖，但它不會產生子代噬 菌體，構建成的此種載體較小，因此能插入比較大的外源 DNM段，所以被廣泛地用于構建 基因組文庫。后者既含有大腸桿菌來源的質粒復制起始位點，又含有酵母菌染色體 DNAt絲點，端粒和復制起始位點的序列，以及合適的選擇標記基因，可在轉化的酵母菌細胞內，按染色體DNAM制的形式復制重組 DNA容納外源DNA段的能力比前3種載體大得多。11 . （1）黏性末端連接：用同一限制酶切割載體及目的基因后，產生完全相同的黏性末 端，可以用DNA連接酶直接進行共價連接。或兩種不同的限制性核酸內切酶切割產生的配 伍末端（相同類型的黏性末端）之間也可以進行黏性末端連接。（2）平端連接：某些限制酶切割DNA后產生平頭末端，由于平頭末端 5'端帶有磷酸，3'帶有游離羥基,可在 DNA 連接酶作用下直接連接， 并且不管末端序列如何均可連接，但連接效率要比黏性末端之間的連接低。（3）同聚物加尾連接：利用同聚物序列，如多聚 A與多聚T之間的退火作用完成 連接。如果載體和目的基因上找不到共同的酶切點時，可經不同的限制酶切割