1、SDS-PAG由泳標準操作規程（網上）3.程序:3.1. 制膠1.1 .1組裝膠架將潔凈、無水的玻片對齊，形成空腔，插入塑料框的凹槽中，注意箭頭向上，并確保下端平齊。放于制膠架上夾緊，下端緊貼密封條。3.1.2分離膠的配置3.1.2.1 10% 分離膠配方如下表:10%交蒸儲水30%Acr-Bis(29:1)1.5M Tris-HclPH 8.810%SDS10%AP（過硫酸鏤）TEMED5 ml1.3 ml1.7 ml1.9 ml0.05 ml0.05 ml0.007ml3.1.2.2 灌膠混勻后用移液槍將凝膠溶液沿玻棒小心注入到長、短玻璃板間的狹縫內（膠高度距樣品模板梳齒下緣約1cm）。1

2、.2 . 2.3液封 在凝膠表面沿短玻板邊緣輕輕加一層水以隔絕空氣，使膠面平整。靜置約30min觀察膠面變化，當看到水與凝固的膠面有折射率不同的界限時，表明膠已完全凝固，倒掉上層水， 并用濾紙吸干殘留的水液。3.1.3濃縮膠的配置3.1.3.1 5% 濃縮膠配方下表:5%交蒸儲水30%Acr-Bis(29:1)0.5M Tris-Hcl PH6.810%SDS10%AP（過硫酸鏤）TEMED2 ml1.4 ml0.33 ml0.25ml0.02 ml0.02 ml0.02 ml3.1.3.2插入制膠梳混勻后用移液槍將凝膠溶液注入到長、短玻璃板間的狹縫內（分離膠上方），輕輕加入樣品模板梳，小心避

3、免氣泡的出現。約30分鐘，聚合完全。3.2. 電泳3.2.1 安裝電泳槽 將制備好的凝膠板取下，小心拔下梳子。兩塊10%勺凝膠板分別插到 U形橡膠框的兩邊凹形槽中，可往上提起使凝膠板緊貼橡膠。將裝好玻璃板的膠模框平放在仰放的貯槽框上， 其下緣與貯槽框下緣對齊，放入電泳槽內。倒入 1X tris-gly 電泳緩沖液。3.2.2 樣品處理對于蛋白樣品直接取 80M的樣品，依次加上 20d 5x buffer （加了 B-琉基乙醇），混勻。對于菌體或組織等固體樣品，取少量樣品加100ul 2x buffer （加了 B-琉基乙醇）煮沸10分鐘。3.2.3 加樣用移液槍取處理過的樣品溶液10 口，小心

4、地依次加入到各凝膠凹形樣品槽內，marker加入到其中一個槽內，為區別兩塊板，marker可加在不同的孔槽中。3.2.4 電泳 將電泳槽放置電泳儀上，接通電源，正負極對好。電壓調至約150v保持恒壓。待澳酚藍標記移動到凝膠底部時，關電源，把電泳緩沖液倒回瓶中。3.2.5 剝離膠 把電泳槽取出，兩塊板拿下來，用刮片從長短玻片中間翹起，再把濃縮膠刮掉，取下。3.3. 染色放于加有R250染色液的染色皿中，染液漫過膠即可，置于搖床上，轉速約為 45r/min ,時間約1小時, 完成后染液倒掉并用水洗掉染液。3.4. 脫色取出染色過的膠放于加有脫色液的染缸里，脫色液漫過膠即可，置于搖床上，轉速約為45

5、r/min ,時間約1小時，本底色脫凈，條帶清晰可見即可，完成后倒掉脫色液。3.5. 拍照 將脫色后的膠置于透明文件夾中，把膠上面的氣泡趕出（用前也可用酒精棉球擦干凈文件夾），放到掃描儀上，拍照。4.注意事項4.1 根據目的蛋白的大小選擇合適的膠片濃度。一般為 100KD-50KD選用10%交；50KD-30KD選用12%膠； 30KD-10KD選用15%交。4.2 要根據樣品濃度來加樣品溶解液。每加一個樣品后換一支吸頭或清洗吸頭后 再點另一個樣品。4.3 制備聚丙烯酰胺凝膠時，倒膠后常漏出膠液，那是因為二塊玻璃板與塑料條之間沒 封緊，留有空隙，所以這步要特別留心操作.4.4電泳完畢撬板取凝膠

6、時要小心細致不能把膠弄破。4.5 電泳緩沖液可重復利用，如果膠上出現不正常痕跡，就要及時更換新液。4.6 分離膠高度控制得當，確保有大約1cm左右的濃縮膠空間。過長或過短均不能得到理想的電泳結果。4.7 電泳染色液注意進行回收再利用，一般可重復使用2-3次。4.8 AP和TEMED是催化劑，加入的量要合適，過少則凝膠聚合很慢甚至不聚合，過 多則聚合過快，影響倒膠。配膠用的試劑，要提前配好：30%丙烯酰胺貯存液丙烯酰胺29.2g,亞甲雙丙烯酰胺 0.8g,混勻后加ddH2。，37C溶解，定容至100ml, 棕色瓶存于4C。1.5MTris-HCl(pH 8.0):Tris base 18.17g

7、加ddH2O溶解，濃鹽酸調 pH至8.0,定容至100ml, 4c保存。1M Tris-HCl(pH 6.8)Tris base12.11g加ddH2O溶解，濃鹽酸調 pH至6.8,定容至100ml, 4c保存。10% SDS :電泳級SDS 10.0 g加ddH2O 68 c助溶，濃鹽酸調至 pH 7.2,定容至100ml。10%過硫酸錢（AP）:1g過硫酸錢加 ddH2O至10ml o跑膠用試劑：電泳緩沖液（pH 8.3Tris 3.02 g,甘氨酸 18.8 g, 10% SDS 10ml 加 ddH2O 溶解，定容至 1000ml。2 SDS電泳上樣緩沖液：1M Tris-HCl (p

8、H 6.8) 1.0ml ,-疏基乙醇 1.0ml, SDS 0.4 g,甘油 2.0ml, 0.1%澳酚 藍 1.0ml, ddH2O 5.0ml。考馬斯亮藍染色液：考馬斯亮藍 R250 0.25 g,甲醇45ml,冰醋酸10ml, ddH2O 45ml脫色液甲醇 45ml,冰醋酸 10ml, ddKO 45ml。操作步驟：采用垂直式電泳槽裝置1、安裝電泳槽2、配制分離膠（12%） （10ml）：ddH2O3.3ml30%丙烯酰胺貯存膠4.0ml1.5M Tris-HCl2.5ml10% SDS0.1ml10% AP0.1mlTEMED4.0日混勻后灌入玻璃板間，以水封頂，注意使液面水平。（

9、凝膠完全聚合需 30-60min）。3、配制積層膠（5%） （3ml）:ddH2O2.1 ml30%丙烯酰胺貯存膠0.5 ml1M Tris-HCl0.38 ml10%SDS0.03 ml10%AP0.03 mlTEMED3.0 J將分離膠上的水倒去，并用濾紙吸干多余水份，加入上述混合液，立即將梳子插入玻璃板間，完全聚合需15-30min。4、待積層膠完全聚合后，小心拔出梳子，然后將玻璃板固定在電泳槽上。5、樣品處理：將樣品加入等量的2>SDS上樣緩沖液，100c加熱3-5min , 12000g離心1min ,取上清作 SDS-PAGE分析，同時將SDS低分子量蛋白質 Marker作平

10、行處理。6、上樣：取10 M誘導與未誘導的處理后的樣品加入樣品池中，并加入20M低分子量蛋白 Marker作對照。7、電泳：在電泳槽中加入 1電泳緩沖液，連接電源，電泳時，積層膠電壓80V,分離膠電壓120V,電泳至澳酚藍行至電泳槽下端停止（約需 2-3h）。8、染色：將膠從玻璃板中取出，置于考馬斯亮藍染色液中染色，室溫 4-6h。9、脫色：將膠從染色液中取出，放入脫色液中，多次脫色至蛋白帶清晰。10、凝膠攝像和保存：將脫色好的凝膠攝像，凝膠可保存于雙蒸水中或7%乙酸溶液中。注意事項：1、實驗組與對照組所加總蛋白含量要相等。2、為達到較好的凝膠聚合效果，緩沖液的pH值要準確，10%AP在一周內

11、使用。室溫較低時， TEMED的量可加倍。3、未聚合的丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺具有神經毒性，可通過皮膚和呼吸道吸收，應注意防護。周師姐試劑配制：30%丙烯酰胺 (29:1)配制 ：稱取 Acrylamide 29 g 、 Bisacrylamide 1 g ，加入約 60 ml 的去離子水，充分攪拌溶解。加去離子水將溶液定容至100 mL ，用 0.45um 濾膜濾去雜質，于中4避光保存。5kris-Glycine 電泳緩沖液的配制：稱取Tris-base 15.1 g、Glycine 94 g、SDS 5 g置于1 L燒杯中，加入約800 mL 的去離子水，攪拌溶解；加去離子水將溶液定容至1

12、 L 后，室溫保存。10 % 過硫酸胺 (AP) 的配制： 稱取過硫酸胺 0.1 g 溶于 1.0 mL 滅菌的去離子水中，充分混勻后于4 避光保存，保存時間不能超過1 周。10 % SDS 的配制： 稱取 SDS 10 g 溶于 100 mL 滅菌的去離子水中并于50水浴下溶解，室溫保存。如在長期保存中出現沉淀，水浴溶化后，仍可使用。1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)：稱取Tris-base 45.43 g ，加入約200 mL 去離子水，攪拌溶解；用濃鹽酸調pH 至8.8，最后用去離子水定容至250 mL ，室溫下保存。0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)： 稱取

13、 Tris-base 15.14 g ，加入約200 mL 去離子水，攪拌溶解；用濃鹽酸調pH 至6.8，最后用去離子水定容至250 mL ，室溫下保存。12 % SDS-PAGE 分離膠：30%丙烯酰胺 4 mL、去離子水 3.3 mL、1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)2.5 mL、10 % AP 100山、10 % SDS 100 (和TEMED 5也充分混勻后灌膠。15 % SDS-PAGE 分離膠：30%丙烯酰胺 5 mL、去離子水 2.3 mL、1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)2.5 mL、10 % AP 100山、10 % SDS 100 (和TEM

14、ED 5也充分混勻后灌膠。5 % SDS-PAGE 濃膠：30%丙烯酰胺 0.5 mL、去離子水 2.1 mL、0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)0.375 mL、10 % AP 30比、10 % SDS 30(和TEMED 5 L.充分混勻后灌膠。考馬斯亮藍染色液的配制 ：稱取 1 g 考馬斯亮藍R-250 ，置于1 L 燒杯中；量取250 mL 異丙醇加入上述燒杯中，攪拌溶解；加入 100 mL 的冰醋酸，攪拌均勻；加入 650 mL 去離子水，攪拌均勻；用濾紙除去顆粒物質后，室溫保存備用。脫色液的配制：量取冰醋酸100 mL、乙醇50 mL,加去離子水定溶至1L,攪拌均勻，

15、室溫保存備用。轉移緩沖液的配制：稱取Tris-base 1.45 g、甘氨酸7.2 g,加入約200 mL去離子水，攪拌溶解；加入 100 mL甲醇，最后用去離子水定容至500 mL ，室溫下保存備用。洗膜緩沖液(TBST)的配制：稱取NaCl 8.8 g、Tris-base 2.42 g,向燒杯中加入約 800 mL去離子水，充分攪拌溶解；用 1 M HCl 將溶液的 pH 值調至 7.5 ，加入 0.5 mL Tween 20 后充分混勻；加去離子水將溶液定容至1 L后，于 4 保存備用。封閉緩沖液的配制： 稱取 0.5 g 脫脂奶粉溶于 10 mL TBST 緩沖液中，充分混勻后備用。0.1 M 甘氨酸緩沖液配制 ：稱取 0.75 g 甘氨酸加入90 mL 去離子水，充分溶解后用 pH 計將 pH 值調至 2.5，用去離子水定容至100mL后用0.22 m微孔慮膜過濾除菌后，將其