1、第十三章第十三章 遺傳工程動物遺傳工程動物遺傳工程胚胎工程操作對象基因（基因工程）基因（基因工程）早期胚胎、配子技術手段獲取目的基因獲取目的基因構建表達載體構建表達載體目的基因導入受體細胞目的基因導入受體細胞目的基因檢測與鑒定目的基因檢測與鑒定胚胎移植體外受精胚胎分割胚胎干細胞培養理論基礎中心法則中心法則哺乳動物受精卵早期胚胎發育規律中心法則： 在細胞分裂過程中，遺傳信息通過DNA的復制傳遞給子代，在子代的個體發育過程中遺傳信息又從DNA傳遞到RNA，最后翻譯成特異的蛋白質，在某些病毒（如煙草花葉病毒等）中的RNA能夠自我復制，指導病毒蛋白質生物合成，某些病毒（如致癌病毒等）還能以RNA為模板

2、逆轉錄成DNA。基因敲除動物基因敲除動物 基因敲入動物基因敲入動物 根據外源基因在染色體上的整合情況，可將遺傳工程動物分為以下幾類：轉基因動物轉基因動物 染色體工程動物染色體工程動物 將特定的外源基因或經過改造的自身基因成分通過各種技術手段導入動物受精卵或胚胎內，使之穩定整合于動物的染色體基因組并能遺傳給后代的一類動物。第一節第一節 轉基因動物轉基因動物“特定的外源基因或經過改造的自身基因成分”目的基因“各種技術手段”各種轉基因技術 轉基因研究技術的中心環節即為DNA重組技術，其最終目的是將DNA片段轉入為一個生物體，從而使該生物體具有表現某種性狀。 轉基因通過獲取基因、重組基因和表達基因等過

3、程來實現。 轉基因打破了物種的界限，使不同種的生物的遺傳物質在分子水平上重新組合在一起，并且完全可以按照人的意志或目的，實現對生物體的改造。1.1974年，Jaenisch等人把純化的SV40病毒DNA注入小鼠囊胚腔后，發現動物的許多組織中都有該基因序列，表明外源基因已整合于胚胎細胞的基因組中。 2.1980年，Gorden等進一步完善了顯微操作技術，首次應用顯微注射的方法，把克隆的人胸苷激酶基因注射到小鼠受精卵的雄性原核內，建立了轉基因小鼠。 3.1982年，Palmiter將大鼠生長激素基因結構區融合在SMT金屬巰蛋白基因（MT）啟動子中，注射到小鼠受精卵雄性原核內，獲得了體型似大鼠的轉基

4、因巨型小鼠。 一、轉基因動物研究發展概況一、轉基因動物研究發展概況3.1985年，Smithies等建立了ES細胞基因打靶技術，首先在球蛋白位點上進行基因打靶，獲得基因敲除小鼠。 4.1987年，英國Roslin研究所研制成功-抗胰蛋白酶轉基因綿羊，乳汁中分泌-抗胰蛋白酶含量高達30mg/L，標志著利用轉基因技術生產生物藥品在實踐上是可行的。 5.1995年，Ramirez-Solis等用重組酶Cre/LoxP系統首先制作成功染色體重排小鼠。6.2000年，McCreath等用體細胞基因打靶技術獲得轉基因綿羊，乳汁中分泌-抗胰蛋白酶含量高達650ugml。 我國的轉基因動物研究始于20世紀80

5、年代初期，中國科學院率先成功地制作了人-珠蛋白基因、大腸桿菌galk和gpt基因、牛及人生長激素等多種轉基因小鼠，在轉基因豬、牛、羊和兔等的研究方面，也取得了成功，并在國際上首先將人生長激素基因轉移到金魚受精卵中，為培育高產優質和具有抗性的魚類新品種開拓了新途徑。 1994年在上海、1995年在長春、分別召開了兩屆全國轉基因動物學術討論會，2002年在上海召開了國際轉基因動物學術討論會。 目前，遺傳工程動物、模式動物疾病動物模型的研究被列為國家“863”計劃的重點項目之一。 2001年，國家科技部資助南京大學建立了“國家遺傳工程小鼠資源庫”，專門用于研究開發、收集、保存和供應遺傳工程小鼠，形成

6、資源共享的公共服務平臺。 轉基因動物技術的成熟和發展是在20世紀80年代以后，從國際上發表的論文數量來看，有關轉基因的論文呈直線上升，表明遺傳工程動物研究已經成為生命科學研究的熱點之一。 乳動物有大約30,000個基因，傳統基因功能研究方法如基因剔除和化學誘變等，技術要求高、時間長、費用大，轉座因子是一類可以進入基因組內不同位置的基因載體，科學家利用它們插入基因，導致基因突變以了解基因功能，也利用它們培育轉基因生物。2005年，復旦大學發育生物學研究所的科研人員將一種源于飛蛾甘藍尺蠖中的DNA轉座因子系統piggyBac(PB)用于小鼠和人類細胞的基因功能研究，表明PB轉座系統可作為一種新型實

7、用的小鼠和其他脊椎動物的高效遺傳操作工具，為大規模研究哺乳動物基因功能提供了新方法。這是我國生命科學研究近年取得的重大成果之一。（一）獲取外源目的基因 從復雜的生物細胞基因組中，經過酶切（限制性內切酶）消化或PCR擴增等步驟，分離得到帶有目的基因的外源性DNA片段。 對于分子質量較大而又不知其序列的基因，可從特定細胞里提取所需基因的mRNA后，借助逆(反)轉錄酶的作用合成堿基互補的DNA片段，即cDNA，再在DNA聚合酶的催化下合成雙鏈cDNA。 或者通過探明目的基因所含的遺傳密碼及其排列順序，然后用化學方法人工合成所需基因序列。 基因轉運載體是具有自體復制能力的一種環狀DNA分子，它經過人工

8、改造后能與外來基因連接，重新形成新的重組DNA分子，并帶有必要的標記基因，用于攜帶目的基因轉移到受體細胞中。 能在受體細胞內進行獨立和穩定的DNA復制； 在其DNA插入外源基因后，仍然保持穩定的復制狀態和遺傳特性； 易于從宿主細胞中分離，并進行純化； 在其DNA序列中，具有適當的限制酶位點。 （二）構建基因轉運載體 目前，常用的基因載體主要有兩大類型：一類是質粒，另一類是病毒（如逆轉錄病毒）。 質粒主要存在于細菌中，可用溶菌酶分解細菌細胞壁，然后用物理化學方法，把質粒與其他成分分開，從而得到純粹的質粒，用于進行體外重組DNA分子構建的操作。（三）構建重組DNA分子（重組外源目的基因） 通過專一

9、限制性內切酶處理或人為方法，使帶有目的基因的外源DNA片段和能夠自我復制并具有選擇標記基因的載體DNA分子產生末端，并通過連接酶在體外使兩者連接起來，形成一個帶有目的基因的重組DNA分子。“剪刀與漿糊”工具酶 限制性核酸內切酶 DNA連接酶 末端轉移酶 單鏈核酸酶 反轉錄酶等 每一種酶都有自身每一種酶都有自身特定的功能。有的像手特定的功能。有的像手術刀可以對術刀可以對DNADNA分子進分子進行定向進行切割；有的行定向進行切割；有的像砌磚機，可以合成完像砌磚機，可以合成完整的雙鏈整的雙鏈DNADNA分子。分子。（四）將重組DNA分子導入受體細胞進行擴增 用顯微注射等人工方法，將重組DNA分子轉移

10、到適當的受體細胞中，使它能在細胞中“定居”下來，并與之一起增值。 (五) 篩選與克隆、培育，獲得轉基因產物 從大量的細胞群體中篩選出獲得重組DNA分子的受體細胞克隆； 從篩選出的受體細胞克隆中提取出已經得到擴增的目的基因； 將目的基因克隆到表達載體上，導入宿主細胞，使之在新的遺傳背景下實現功能表達，產生出人類需要的物質。*1.顯微注射法： 在顯微鏡下利用玻璃顯微注射針將外源DNA直接注入到受體的受精卵雄性原核內。二、將重組DNA分子導入受體細胞的方法2.逆轉錄病毒載體法： 逆轉錄病毒是一種單鏈的RNA病毒，能夠在逆轉錄酶的作用下，形成雙鏈的DNA原病毒，目前已成為基因轉移載體的最佳選擇，它可有

11、效的整合入靶細胞基因組并穩定持久地表達所帶的外源基因。主要用于基因轉移和基因治療。3.精子載體法： 將外源DNA與動物精子一起孵育，在體外受精過程中由精子將外源DNA帶入受精卵內。4.電穿孔法： 細胞暴露于高電壓時，細胞膜為高電壓瞬時擊穿，從而使外源DNA被攝入細胞中。5.脂質體法： 將外源DNA裝入脂質體（一種人造膜）與培養細胞一起溫育，即可將外源DNA導入受體細胞。6 基因槍法：7.DEAE-葡聚糖介導法：8.磷酸鈣介導法： 超數排卵、取超數排卵、取受精卵受精卵向受精卵雄性原核注入外源向受精卵雄性原核注入外源性性DNADNA溶液，溶液，將細胞胚胎移將細胞胚胎移植到假孕雌鼠的輸卵管中植到假孕

12、雌鼠的輸卵管中。 正常雄鼠正常雄鼠雌鼠雌鼠A A 結扎輸精管的雄鼠結扎輸精管的雄鼠 （品系不限（品系不限) )雌鼠B假孕雌鼠（假孕雌鼠（ICRICR或或KMKM）（選擇（選擇C57BL/6C57BL/6或或BD62F1BD62F1）二、轉基因動物制作實例轉基因小鼠（顯微注射法） 用結扎了輸精管的雄性小鼠與發情期的雌性小鼠進行交配，雖然不能受精，但可以刺激子宮頸管，使雌性小鼠體內的黃體活化，造成能繼續妊娠的內分泌環境，這種小鼠稱為假孕雌鼠。 假孕雌鼠一般采用遠交系，如ICR或昆明種等，因其母性好，善帶仔鼠；體重最好大于25克。體型較大，便于移植。已產過仔并成功撫育過幼鼠的作假孕雌鼠最理想。一、轉

13、基因動物在生物制藥中的應用： 作為基因藥物的“生物反應器”，生產具有醫藥價值的生物活性蛋白質藥物： 將抗凝血酶、人血清白蛋白、B一干擾素、降鈣素、胰島素、人生長激素等的基因通過基因打靶技術，定點轉入牛或羊的乳球蛋白質基因中，在乳腺中高效表達，便可自乳汁中回收該蛋白質。目前已從轉基因的動物乳汁中生產出的治療蛋白主要有：奶山羊乳汁中高度表達的抗凝血酶和Or-1一蛋白酶抑制因子，綿羊乳汁中表達的OL-1一抗胰蛋白酶和人凝血因子，牛乳中表達的a-乳蛋白和乳鐵蛋白,兔乳中表達的a-葡萄糖苷酶等。第二節 遺傳工程技術的應用二、轉基因技術在人類疾病研究中的應用：1.建立診斷和治療人類疾病的轉基因動物模型 人

14、類的許多疾病都與遺傳因素相關。但人類倫理道德一般不允許直接對人的受精卵進行基因操作，因而只有將處理過的體細胞移植到遺傳病患者體內。但這種操作具有一定的危險性，必須首先在動物體內進行試驗。所以，通過培育缺陷性狀矯正的動物新品系，可以為這類疾病的基因治療提供寶貴的經驗和動物模型。迄今為止，這方面的研究已取得了不少進展。 2.生產可用于人體器官移植的轉基因動物器官 轉基因動物不僅可以用來摸索基因療法的經驗，轉基因動物不僅可以用來摸索基因療法的經驗，而且還可能為因患病而導致某個器官功能衰退的病而且還可能為因患病而導致某個器官功能衰退的病人提供健康的器官，如心、肝、腎等。人提供健康的器官，如心、肝、腎等

15、。 英國劍橋的幾位科學家為一只豬胚胎導入了人英國劍橋的幾位科學家為一只豬胚胎導入了人的基因，因而培育出了世界上首例具有人的基因的的基因，因而培育出了世界上首例具有人的基因的轉基因豬，在世界上引起強烈反響，目前，這種轉轉基因豬，在世界上引起強烈反響，目前，這種轉基因豬已發展到數百頭。科學家的目的是希望這種基因豬已發展到數百頭。科學家的目的是希望這種轉基因豬能為人類提供健康的器官。現在，他們已轉基因豬能為人類提供健康的器官。現在，他們已在進行把轉基因豬的器官移植到靈長目動物身上的在進行把轉基因豬的器官移植到靈長目動物身上的試驗，預計移入人體的試驗將在本世紀末得以實施。試驗，預計移入人體的試驗將在本

16、世紀末得以實施。如果這項計劃能夠成功的話，那么將解決人類備用如果這項計劃能夠成功的話，那么將解決人類備用器官的缺乏，使千百萬名患者脫離死亡。器官的缺乏，使千百萬名患者脫離死亡。 除了開展異種器官移植研究之外，異種細胞移植的研究也在進行中。已知很多疑難疾病、生理功能紊亂都與細胞凋亡或細胞功能異常有關，但到目前為止，人類細胞還不能很好地傳代培養，因此將異種細胞尤其是豬的細胞移植到合適的位點，將使人類實現細胞治療成為可能。 1994年，Groth等將豬的胰島細胞移植給糖尿病病人，取得了一定的成效。 1997年,Deacon等將豬胎兒神經細胞移植到患有帕金森疾病的病人大腦中，研究發現移植后的細胞能長久

17、保持活力。 3.轉基因技術用于基因治療 將外源正常基因導入靶細胞，以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，達到治療目的。 目前的基因療法是先從患者身上取出一些細胞，然后利用對人體無害的逆轉錄病毒當載體，把正常的基因嫁接到病毒上，再用這些病毒去感染取出的人體細胞，讓它們把正常基因插進細胞的染色體中，使人體細胞就可以“獲得”正常的基因，以取代原有的異常基因。 基因療法的典型例子是半乳糖血癥病人的基因治療。這種基因療法的典型例子是半乳糖血癥病人的基因治療。這種病人由于細胞內缺少基因病人由于細胞內缺少基因G G，不能產生半乳糖，不能產生半乳糖1 1磷酸磷酸尿苷尿苷酰轉換酶，以致大量半乳糖酰轉換酶，以致

18、大量半乳糖1 1磷酸和半乳糖堆積在肝組織磷酸和半乳糖堆積在肝組織中，這些半乳糖可轉變為酒精，因而造成肝臟損害。為了治愈中，這些半乳糖可轉變為酒精，因而造成肝臟損害。為了治愈這種病人，人們把大腸桿菌這種病人，人們把大腸桿菌( (一般內含一般內含G G基因基因) )能產生半乳糖酶能產生半乳糖酶的脫氧核糖核酸片段提取出來，讓噬菌體作為運載體帶入病人的脫氧核糖核酸片段提取出來，讓噬菌體作為運載體帶入病人的細胞內，病人細胞便開始產生半乳糖酶。這樣，原來不能利的細胞內，病人細胞便開始產生半乳糖酶。這樣，原來不能利用半乳糠的細胞便恢復了對半乳糖的正常代謝。如果這種已經用半乳糠的細胞便恢復了對半乳糖的正常代謝

19、。如果這種已經治愈的細胞用人工的方法移植到人體器官內，使之成為人體的治愈的細胞用人工的方法移植到人體器官內，使之成為人體的正常部分，那么這種病就從根本上治愈了。而且由于病人細胞正常部分，那么這種病就從根本上治愈了。而且由于病人細胞內脫氧核糖核酸的缺陷部分得了糾正，這種病也就不會再遺傳內脫氧核糖核酸的缺陷部分得了糾正，這種病也就不會再遺傳給下一代了。給下一代了。第一個成功的基因治療第一個成功的基因治療 1990 1990年年9 9月月1414日美國的一個年僅日美國的一個年僅4 4歲的小女孩歲的小女孩接受了基因治療而且取得了成功。她患的是遺傳接受了基因治療而且取得了成功。她患的是遺傳性的嚴重復合免

20、疫缺損癥，原因是她繼承了父母性的嚴重復合免疫缺損癥，原因是她繼承了父母親的各自的一個缺損基因。基因治療采用的是體親的各自的一個缺損基因。基因治療采用的是體外療法。從患者身上取出免疫系統中的白細胞，外療法。從患者身上取出免疫系統中的白細胞，把野生型即正常的基因引入白細胞，然后把這些把野生型即正常的基因引入白細胞，然后把這些細胞注入血液中，在細胞注入血液中，在4 4個月內重復個月內重復4 4次。患者本來次。患者本來總是面容憔悴而且易受感染，現在已是一個健康總是面容憔悴而且易受感染，現在已是一個健康活潑的小姑娘了活潑的小姑娘了。三、轉基因動物在動物育種中的應用： 通過轉基因克隆技術大量快速地繁殖出具有高產優質性狀的轉基因動物以有利于降低生產成本，提高經濟效益。 轉基因技術用于育種，不僅可以加快改良遺傳性狀的進程，使選擇的效率提高，改良的機會更多，而且不會受到有性繁殖的局限。 人類在轉bGH基因豬方面的研究表明，轉基因豬日增重增加，飼料轉化率提高。Powell等將毛角蛋白型中問細絲基因導入綿羊基因組轉