1、免疫組織化學技術免疫組織化學技術 Immunohistochemistry Immunohistochemistry techniques techniques 第一節第一節 免疫組織化學免疫組織化學 技術概述技術概述（一）發展簡史（一）發展簡史 n19411941年年CoonsCoons首先用熒光素標記抗體檢測首先用熒光素標記抗體檢測肺組織內的肺炎雙球菌獲得成功。肺組織內的肺炎雙球菌獲得成功。 n6060年代年代NakaneNakane建立酶標抗體技術運用鐵建立酶標抗體技術運用鐵蛋白標記蛋白標記AbAb技術技術n70 70 、80年代多位科學家改良上述技術，年代多位科學家改良上述技術，建立辣

2、根過氧化物酶建立辣根過氧化物酶-抗過氧化物酶抗過氧化物酶（PAPPAP）技術技術, ,抗生物素抗生物素生物素（生物素（ABC）法法使免疫組織化學進入了應用階段。使免疫組織化學進入了應用階段。 n20002000年以后各種免疫組化技術更加成熟年以后各種免疫組化技術更加成熟, ,使免疫組化技術成為當今生物醫學中形使免疫組化技術成為當今生物醫學中形態、功能代謝綜合研究的一項有力工具。態、功能代謝綜合研究的一項有力工具。其應用范圍深達醫學各個學科，是目前其應用范圍深達醫學各個學科，是目前生命科學工作者應該掌握的基本技術之生命科學工作者應該掌握的基本技術之一。一。定義定義: :是應用是應用免疫學免疫學基

3、本原理基本原理抗原抗原抗體反應，即抗原與抗體抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體標記抗體的顯色劑的顯色劑(熒光熒光素、酶、金屬離子、同位素素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內抗原（多顯色來確定組織細胞內抗原（多肽和肽和蛋白質蛋白質），對其進行定位、定性及定量的研究，稱為），對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫免疫組織化學技術組織化學技術(immunohistochemistry)或或免疫細胞化學技免疫細胞化學技術術(immunocytochemistry)。 將將試劑抗原或試劑抗體用可以微量檢測的標記物進行標記，試劑抗原或

4、試劑抗體用可以微量檢測的標記物進行標記，在與標本中的相應抗體或抗原反應后，可以不必測定抗原抗體在與標本中的相應抗體或抗原反應后，可以不必測定抗原抗體復合物本身，而測定復合物中的標記物，通過標記物的放大作復合物本身，而測定復合物中的標記物，通過標記物的放大作用，進一步提高了免疫技術的敏感性。用，進一步提高了免疫技術的敏感性。（二（二）免）免疫組織化學的原理疫組織化學的原理n抗原抗原是指能夠刺激是指能夠刺激機體機體產生（特異性）產生（特異性）免疫應答，并能與免疫應答產物抗體和免疫應答，并能與免疫應答產物抗體和致敏淋巴細胞在體內外結合，發生致敏淋巴細胞在體內外結合，發生免疫免疫效應效應（特異性反應）

5、的物質。抗原的基（特異性反應）的物質。抗原的基本特性有兩種，一是誘導免疫應答的能本特性有兩種，一是誘導免疫應答的能力，也就是免疫原性，二是與免疫應答力，也就是免疫原性，二是與免疫應答的產物發生反應，也就是抗原性的產物發生反應，也就是抗原性 n病原微生物病原微生物 在醫療中將病原微生物制成疫苗進行在醫療中將病原微生物制成疫苗進行預防預防接種接種，可以提高人的，可以提高人的免疫力免疫力。 n嗜異性抗原嗜異性抗原 一類與種屬特異性無關的、存在于人一類與種屬特異性無關的、存在于人以及某些以及某些動物動物、植物植物、微生物的性質相同的抗原。、微生物的性質相同的抗原。 n腫瘤抗原腫瘤抗原 由物理的、化學的

6、因素或某些病毒誘發由物理的、化學的因素或某些病毒誘發的的實驗動物實驗動物腫瘤，其細胞中或細胞表面均出現特異性腫瘤，其細胞中或細胞表面均出現特異性抗原，稱為抗原，稱為腫瘤特異性抗原腫瘤特異性抗原。已證實在某些人類腫瘤。已證實在某些人類腫瘤中心存在著與病毒密切相關的抗原。中心存在著與病毒密切相關的抗原。 n同種異體抗原同種異體抗原n動物免疫血清動物免疫血清與人類有關的抗原與人類有關的抗原 n抗體抗體（antibody）指機體的免疫系統在）指機體的免疫系統在抗原抗原刺激下，由刺激下，由B淋巴細胞或淋巴細胞或記憶細胞記憶細胞增增殖分化成的殖分化成的漿細胞漿細胞所產生的、可與相應所產生的、可與相應抗原發

7、生抗原發生特異性特異性結合的免疫球蛋白。結合的免疫球蛋白。 世界著名抗體公司世界著名抗體公司 nSanta公司、公司、Abcam公司、公司、nAbgent公司、公司、Proteintech Group、Cell Signaling Technology（CST）、）、n羅氏公司（羅氏公司（Roche） 它它借助于借助于熒光素、酶熒光素、酶等標記抗體等標記抗體與組織切片或細胞涂片中相關與組織切片或細胞涂片中相關抗原抗原相相結合，由于熒光素所發熒光可用熒光結合，由于熒光素所發熒光可用熒光顯微鏡檢出，而酶可經一定的顯色處顯微鏡檢出，而酶可經一定的顯色處理，呈現醒目的陽性色彩，從而可準理，呈現醒目的陽

8、性色彩，從而可準確定位欲測定的抗原物質。確定位欲測定的抗原物質。 標記物標記物熒光素、酶熒光素、酶標記標記抗抗 體體抗抗 原原熒光熒光陽性色彩陽性色彩顯微鏡觀察顯微鏡觀察組織抗原組織抗原抗體抗體 酶酶熒光素熒光素 三大系統三大系統 本技術是應用免疫學原理本技術是應用免疫學原理來識別待測抗原，再通過酶和底物來識別待測抗原，再通過酶和底物的作用外加顯色劑，將上述反應顯的作用外加顯色劑，將上述反應顯示出來。示出來。 免疫組免疫組織化學織化學識別系統識別系統聯結系統聯結系統顯示系統顯示系統n識別系統識別系統是指特異性抗體識別組織是指特異性抗體識別組織或細胞中的靶抗原。抗原抗體的特或細胞中的靶抗原。抗原

9、抗體的特異性結合是本技術的基本依異性結合是本技術的基本依據。據。n聯結系統聯結系統由聯結抗體構成。它的作由聯結抗體構成。它的作用是聯接識別系統和顯示系統。用是聯接識別系統和顯示系統。 n顯示系統顯示系統的目的是使抗原抗體間的的目的是使抗原抗體間的特異性結合變為肉眼可見。因此顯特異性結合變為肉眼可見。因此顯示系統由示系統由標記酶，底物和顯色劑組標記酶，底物和顯色劑組成成，以在靶抗原存在位點上形成有，以在靶抗原存在位點上形成有色沉淀。色沉淀。特點特點： 特異性強特異性強靈敏度高靈敏度高定位準確和簡便快速等優點定位準確和簡便快速等優點又能夠將形態、功能及代謝的研又能夠將形態、功能及代謝的研究有機結合

10、起來。究有機結合起來。IHC方法方法1 1 過過去用過的方法去用過的方法ABCABC法，法，SPSP法法。三步三步法，使用生物素法，使用生物素2 2 目目前最常用的方法前最常用的方法二步法：二步法： EnliVisionEnliVision顯色系統顯色系統（即用型非生物素免疫組化（即用型非生物素免疫組化EnliVisionTM plusEnliVisionTM plus檢測試劑盒檢測試劑盒 ）n將多個抗鼠和抗兔的將多個抗鼠和抗兔的IgGIgG分子二抗與辣根過氧分子二抗與辣根過氧化物酶通過一個多聚葡聚糖骨架聯接成一個大化物酶通過一個多聚葡聚糖骨架聯接成一個大分子多聚體（分子多聚體（polymer

11、polymer），直接放大信號），直接放大信號40-5040-50倍。倍。n敏感、省時、方便、背景低（避免了內源性生敏感、省時、方便、背景低（避免了內源性生物素干擾）。物素干擾）。3 3 最新一代的免疫組化最新一代的免疫組化 NovolinkNovolink Polymer Polymer法：法：使用小分子聚合物（減少細胞薄膜硬脂的阻使用小分子聚合物（減少細胞薄膜硬脂的阻礙，比傳統中的大分子聚合物染色更顯著），礙，比傳統中的大分子聚合物染色更顯著），信號放大更強，還可以檢測到組織中低濃度信號放大更強，還可以檢測到組織中低濃度的抗原。的抗原。 IHC方法方法 EnliVisionEnliVisi

12、on法的工作程法的工作程序序： 切切片，烤片，脫蠟水化（使用防脫片處理的玻片：多聚賴氨酸，片，烤片，脫蠟水化（使用防脫片處理的玻片：多聚賴氨酸，APESAPES）nH H2 2O O2 2處處理（理（阻斷內源性過氧化物酶），蒸餾水漂洗阻斷內源性過氧化物酶），蒸餾水漂洗n組織切片的預處理（枸櫞酸鈉緩沖液中熱修復，酶組織切片的預處理（枸櫞酸鈉緩沖液中熱修復，酶消化消化暴露出暴露出抗原決定簇），抗原決定簇），TBSTBS漂洗漂洗n內源性過氧化物酶的阻斷內源性過氧化物酶的阻斷n一抗孵育，一抗孵育，TBSTBS漂洗漂洗n二抗孵育，二抗孵育，TBSTBS漂洗漂洗nDABDAB顯色，蒸餾水中止反應顯色，蒸餾

13、水中止反應n蘇木素復染及封片蘇木素復染及封片 IHCIHC技術的基本操作流程技術的基本操作流程切片切片烤片烤片脫蠟水化脫蠟水化H H2 2O O2 2處理處理熱修復熱修復一抗一抗二抗二抗EnlivisionEnlivision試劑試劑DABDAB顯色顯色蘇木素復染蘇木素復染IHCIHC染色結果的判讀原則染色結果的判讀原則玻片干燥造成的玻片干燥造成的“邊緣效應邊緣效應”假假陽陽性性未阻止內源性過氧化物酶未阻止內源性過氧化物酶阻止內源性過氧化物酶后阻止內源性過氧化物酶后I. I. 注意影響注意影響IHCIHC結果判讀的因素結果判讀的因素酒精固定酒精固定福爾馬林固定福爾馬林固定胰腺，胰腺，insul

14、in平滑肌肉瘤，平滑肌肉瘤，SMA氣泡影響抗體抗體反應氣泡影響抗體抗體反應冰凍切片冰凍切片石蠟切片石蠟切片結腸，結腸，CEA假陰性：注意內對照假陰性：注意內對照假假陰陰性性蛋白酶處理后蛋白酶處理后蛋白酶未處理蛋白酶未處理皮膚，皮膚，IV膠原膠原甲狀旁腺，甲狀旁腺，PTH微波未處理微波未處理微波處理后微波處理后II. II. 染色的特異性判定染色的特異性判定MitochondoriaMitochondoriaApicalApicalmembranemembraneBasolateralBasolateral membranemembranePlasma Plasma MembraneMembra

15、ne+ +PERPER GolgiGolgiPlasma Plasma membranemembranePER + PER + GolgiGolgiGolgiGolgiapparatusapparatusEndocrineEndocrinegranulegranuleEndocrine granuleEndocrine granuleLysosomeLysosomeCytosolCytosolNucleusNucleusCytoskeletoCytoskeleton nl amylaseamylasel lysozomelysozomel PAcPPAcPl S-100 S-100 l NSE

16、 NSEl prefixationprefixation diffusion diffusion artifact artifactl CEACEAl EMA EMAl ALP ALPlCD10CD10l cytochromecytochrome P-450 P-450l immunogloblinimmunogloblinl AFP AFPl HCG HCGl factor -RA factor -RAl prolactinprolactin in in activated activated pituicytepituicytel SCSCl EGFR EGFRlE-cadE-cadl L

17、euLeu 4 4l HLA-DR HLA-DRl CEA, EMA, CEA, EMA, SC, CA19-9 SC, CA19-9 in cancer cell in cancer celll LeuLeu 1 1l LCA LCAl PALP in PALP in seminomaseminoma cell celllCerb-B2Cerb-B2l SC, AFPSC, AFP EMA, EMA, immunoglobulin immunoglobulin in special in special conditions conditionsl chromograninchromogra

18、nin A Al serotonin serotoninl Peptide Peptide hormonehormonel DNA polymerase DNA polymerase l S-100 (occasional) S-100 (occasional)l estrogen receptor estrogen receptorl keratin inkeratin in carcinoidcarcinoid, , mesotheliomamesotheliomal vimentinvimentinl keratin inkeratin in adenocarcinomaadenocar

19、cinoma hepatocytehepatocytel actinactinl keratinkeratinl vimentinvimentinl GFAP GFAPl tubulintubulin細胞膜陽性細胞膜陽性n細胞粘附分子：細胞粘附分子： E- E-cadherincadherin、CD31CD31、CD56CD56等等n交聯膜蛋白分子：交聯膜蛋白分子：catenincatenin、dystrophindystrophin 等等n細胞表面受體：細胞表面受體：EGFREGFR、c-erbB2c-erbB2、c-kitc-kit/CD117/CD117（酪氨酸激酶受體）等酪氨酸激酶受體

20、）等n絕大多數白細胞抗原絕大多數白細胞抗原: : LCALCA、CD20CD20、CD2CD2、CD5CD5等等n表面或跨膜蛋白：表面或跨膜蛋白：VillinVillin、BerEP4BerEP4、EMAEMA、 CEA CEA、CA125CA125、EBV-LMP1EBV-LMP1等等細胞核陽性細胞核陽性n細胞周期素蛋白細胞周期素蛋白：cyclinscyclins、cyclincyclin 依賴激依賴激酶酶( (cdkcdk) )、cdkcdk 抑制劑抑制劑 ( (如如 p16)p16)等等n細胞增殖相關蛋白細胞增殖相關蛋白：Ki67Ki67、PCNAPCNAn轉錄因子轉錄因子：MyoD1M

21、yoD1、myogeninmyogenin、TTF-1TTF-1、CDX2CDX2、PAX5PAX5n腫瘤抑制基因腫瘤抑制基因：如：如 p53p53、p63p63、RbRb、WT1WT1n基因錯配產物基因錯配產物：如：如 MLH1MLH1、MSH2MSH2n細胞核酶細胞核酶：如 TdTn類固醇激素受體類固醇激素受體：如 ER、PR、ARn細胞核鈣結合蛋白細胞核鈣結合蛋白：如 S100蛋白、calretininn定位細胞核的病毒定位細胞核的病毒：如 CMV、HBcAg（核+核周）nNeuN：neuronal nuclei，表達于成熟的神經元細胞漿內顆粒狀陽性細胞漿內顆粒狀陽性-定位于細胞器定位于

22、細胞器n溶酶體顆粒溶酶體顆粒：如 lysozyme、CD68、myeloperoxidasen黑色素小體和前黑色素小體黑色素小體和前黑色素小體：如 HMB45、Melan-An細胞毒顆粒細胞毒顆粒：如TIA-1、granzyme Bn線粒體線粒體: 如抗線粒體抗體, HEP-PAR1n神經內分泌顆粒神經內分泌顆粒：各種激素（如PTH、 ACTH、insulin）、CgA、SynnW-P W-P 小體小體: F-VIII相關抗原n分泌顆粒分泌顆粒：如BRST-2、surfactant、PSAn細胞內微生物細胞內微生物：如弓形蟲細胞漿纖維狀陽性細胞漿纖維狀陽性-中間絲或微絲中間絲或微絲中間絲中間絲

23、;CK;CK; ;VimentinVimentin; ;DesminDesminGFAPGFAP（glialglial fibrillaryfibrillary acidic protein acidic protein，膠質纖維酸性蛋白膠質纖維酸性蛋白 ）NFNF（NeurofilamentNeurofilament，神經元胞漿，神經元胞漿節細胞節細胞神經瘤，副節瘤神經瘤，副節瘤/ /嗜鉻細胞瘤嗜鉻細胞瘤，神經母細胞，神經母細胞瘤）瘤）NestinNestin：巢蛋白，神經前體細胞巢蛋白，神經前體細胞彌漫或片狀的細胞漿陽性彌漫或片狀的細胞漿陽性n蛋白分布在細胞內液、大量的微囊及內質蛋白分布在

24、細胞內液、大量的微囊及內質網中網中n如如: :myoglobinmyoglobin、hemoglobinhemoglobin、albuminalbumin、AFPAFP、 NSENSE、cytoplasmic Igcytoplasmic Ig、CD3CD3n病毒顆粒病毒顆粒/ /蛋白蛋白n如如: :HBsAgHBsAg（常在核旁著色）（常在核旁著色）n從細胞間液吸收的蛋白從細胞間液吸收的蛋白n如如: : IgIg、 albuminalbumin 分化差惡性腫瘤的診斷和鑒別診斷；分化差惡性腫瘤的診斷和鑒別診斷； 證實內分泌腫瘤和神經內分泌腫瘤；證實內分泌腫瘤和神經內分泌腫瘤； 應用腫瘤胚胎性抗原

25、診斷某些腫瘤，如癌應用腫瘤胚胎性抗原診斷某些腫瘤，如癌胚抗原（胚抗原（CEACEA）對胃腸道癌、甲胎蛋白（）對胃腸道癌、甲胎蛋白（AFPAFP）對肝癌和卵巢內胚竇癌診斷有幫助；對肝癌和卵巢內胚竇癌診斷有幫助； （三）免疫組化的應用（三）免疫組化的應用 有時可幫助確定腫瘤的良惡性，如應用免有時可幫助確定腫瘤的良惡性，如應用免疫球蛋白輕鏈疫球蛋白輕鏈和和來鑒別濾泡性惡性淋來鑒別濾泡性惡性淋巴瘤和濾泡性反應性增生；巴瘤和濾泡性反應性增生； 研究某些癌癥與病毒的關系，如肝癌與乙研究某些癌癥與病毒的關系，如肝癌與乙型肝炎病毒、鼻咽癌與型肝炎病毒、鼻咽癌與EBEB病毒、宮頸癌與病毒、宮頸癌與乳頭狀瘤病毒等

26、的關系；乳頭狀瘤病毒等的關系； 為腫瘤治療的選擇提供依據，如乳腺為腫瘤治療的選擇提供依據，如乳腺癌檢測雌、孕激素受體（癌檢測雌、孕激素受體（ERER、PRPR）呈陽）呈陽性時，應用他莫昔芬（三苯氧胺）治療性時，應用他莫昔芬（三苯氧胺）治療可預期獲得較好的療效；可預期獲得較好的療效； 檢測癌基因和抑癌基因蛋白產物（如檢測癌基因和抑癌基因蛋白產物（如c-erbB2c-erbB2，p53p53）、增生活性抗原（如）、增生活性抗原（如Ki-67Ki-67，PCNAPCNA）用來估計腫瘤的預后。）用來估計腫瘤的預后。 免疫組化在臨床診斷中免疫組化在臨床診斷中 應用病例示范（應用病例示范（Case 1Ca

27、se 1）n臨床病史資料：臨床病史資料：4848歲，男性，胃活檢標歲，男性，胃活檢標本取自胃大彎部位。本取自胃大彎部位。H&EH&E染色切片描述腫染色切片描述腫瘤細胞顯示在間質中呈癌巢樣，鄰近的瘤細胞顯示在間質中呈癌巢樣，鄰近的腺體腸上皮化生，間質中的不規則的巢腺體腸上皮化生，間質中的不規則的巢狀結構待診斷狀結構待診斷. .nH&E染色 n 首先選擇首先選擇Cytokeratin單克隆廣譜角蛋白抗體在單克隆廣譜角蛋白抗體在細胞巢中呈強陽性染色，證明是上皮來源性的細胞巢中呈強陽性染色，證明是上皮來源性的腫瘤，在圖片頂部是非腫瘤性的腺上皮陽性，腫瘤，在圖片頂部是非腫瘤性的腺

28、上皮陽性，腫瘤性的腺體在底部。腫瘤性的腺體在底部。n 腫瘤細胞再進一步進行腫瘤細胞再進一步進行cytokeratin 7 /cytokeratin 20染色，染色證實在腫瘤染色，染色證實在腫瘤細胞中同時缺少細胞中同時缺少cytokeratin 7 /cytokeratin 20的表達。在這張圖片中腸上皮的表達。在這張圖片中腸上皮細胞細胞cytokeratin 20陽性與鄰近的腫瘤細胞陰性形成明顯的對照。陽性與鄰近的腫瘤細胞陰性形成明顯的對照。cytokeratin 7 and 20在臨床中使用中，如果同時都不表達，特異性地表示在臨床中使用中，如果同時都不表達，特異性地表示腫瘤細胞為來源于一些上

29、皮的腫瘤（腫瘤細胞為來源于一些上皮的腫瘤（subset of epithelial tumors），包括腎），包括腎細胞癌，前列腺癌、肝細胞癌和神經內分泌腫瘤等。細胞癌，前列腺癌、肝細胞癌和神經內分泌腫瘤等。 SynaptophysiSynaptophysin n 測定測定SynaptophysiSynaptophysin n所有腫瘤細所有腫瘤細胞中都顯示出胞中都顯示出較強的陽性表較強的陽性表達，而在腫瘤達，而在腫瘤細胞中包繞的細胞中包繞的腸腺體呈陰性腸腺體呈陰性診斷診斷: :神經內神經內分泌癌分泌癌 Ki-67 Ki-67 測定測定: :Ki-67 Ki-67 在腫瘤細胞呈現非常低的表達，在

30、腫瘤細胞呈現非常低的表達，Ki-67 Ki-67 染色同樣證實為腫染色同樣證實為腫瘤細胞增殖率低，腸腺上皮中瘤細胞增殖率低，腸腺上皮中Ki-67 Ki-67 高表達，可能是胃小凹腺體，與高細胞增殖高表達，可能是胃小凹腺體，與高細胞增殖率的腺上皮相比率的腺上皮相比Ki-67Ki-67在腫瘤細胞中缺少胞核表達。這些在腫瘤細胞中缺少胞核表達。這些Ki-67 Ki-67 標記陰性的腫瘤標記陰性的腫瘤細胞是低分級的神經內分泌癌細胞，細胞是低分級的神經內分泌癌細胞，第二節第二節 免疫組織化學染色前免疫組織化學染色前的基本技術的基本技術( (一一) ) 樣樣品的取材品的取材 組織標本組織標本包括石蠟切片（病

31、理切片和包括石蠟切片（病理切片和組織芯片）和冰凍切片。組織芯片）和冰凍切片。細胞標本細胞標本后者包括組織印片和細胞涂片。后者包括組織印片和細胞涂片。n 其中石蠟切片是制作組織標本最常其中石蠟切片是制作組織標本最常用、最基本的方法，對于組織形態保存用、最基本的方法，對于組織形態保存好，且能作連續切片，有利于各種染色好，且能作連續切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究究. . 樣品制備的第一步就是取材，取材的好樣品制備的第一步就是取材，取材的好壞關系到實驗的結果。所以必須做好準備工壞關系到實驗的結果。所以必須做好準備工作。作。 現將現將組織取材的

32、原則和具體要求組織取材的原則和具體要求分述如下：分述如下： 1 1 刀刀剪銳利、潔凈。剪銳利、潔凈。 2 2 快快速、準確、盡量保持生活狀態，速、準確、盡量保持生活狀態， 力爭力爭1 1分鐘之內放入固定液，最遲不能超分鐘之內放入固定液，最遲不能超 過過3 3分鐘。分鐘。 3 3 一一刀切取，切取應在蠟版或濾紙上進刀切取，切取應在蠟版或濾紙上進 行，避免拉鋸、牽拉或擠壓等動作。行，避免拉鋸、牽拉或擠壓等動作。4 4 低低溫操作，防止自溶現象，通常以溫操作，防止自溶現象，通常以 0-40-4的低溫條件下操作為佳。的低溫條件下操作為佳。5 5、樣品大小適當，光鏡樣品一般在、樣品大小適當，光鏡樣品一般

33、在1.0cm1.0cm以內，以內，免疫組織化學樣品大約在：免疫組織化學樣品大約在：2cm2cm1.5cm1.5cm0.3cm0.3cm 厚度控制在厚度控制在0.3cm0.3cm 。電鏡樣品規格要求切成。電鏡樣品規格要求切成0.5-1.0cm0.5-1.0cm共共3 3小塊。小塊。 對對病理組織病理組織取材還應做到以下幾點：取材還應做到以下幾點： 取材部位必須是主要病變區；取材部位必須是主要病變區； 必須取病灶與正常組織的交界區；必須取病灶與正常組織的交界區； 必要時取遠離病灶的正常組織做對照。必要時取遠離病灶的正常組織做對照。 細胞標本的取材細胞標本的取材印片法印片法: :常用于活檢標本常用于

34、活檢標本沉淀法沉淀法: :主要用于胸水、腹水、尿液等主要用于胸水、腹水、尿液等穿刺抽吸法：常用于淋巴結、軟組織、穿刺抽吸法：常用于淋巴結、軟組織、 腎、肝、肺等組織。腎、肝、肺等組織。注意事項：注意事項：細胞經離心后細胞粘附性較差，標記過細胞經離心后細胞粘附性較差，標記過程中容易脫片，載玻片應涂粘附劑程中容易脫片，載玻片應涂粘附劑細胞總數應以細胞總數應以10105 5個為宜，并集中在直個為宜，并集中在直徑徑0.6-1.0cm0.6-1.0cm的圓圈內。的圓圈內。富于粘液的標本，未經處理不宜作免疫富于粘液的標本，未經處理不宜作免疫組化標記。組化標記。（二）、組織固定（二）、組織固定 2 2、免疫

35、組化標本固定時，好的固定劑應、免疫組化標本固定時，好的固定劑應 滿足哪些要求？滿足哪些要求？ 1 1、目的、目的: :固有形態和結構、抗原完整性固有形態和結構、抗原完整性能快速固定抗原；能快速固定抗原；防止抗原物質擴散；防止抗原物質擴散；固定后的抗原能被抗體識別，固定后的抗原能被抗體識別， 不影響抗原抗體反應。不影響抗原抗體反應。甲醛固定液：分類較多，最常用的甲醛固定液：分類較多，最常用的4%4%多多聚甲醛固定液，對于冰凍切片，甲醛固聚甲醛固定液，對于冰凍切片，甲醛固定有時比冰凍丙酮好；定有時比冰凍丙酮好；n主要特點：主要特點：組織穿透性好，收縮性小組織穿透性好，收縮性小n但對于不同的組織和抗

36、原，可選用不同但對于不同的組織和抗原，可選用不同的固定液。有時候商品化的抗體會有比的固定液。有時候商品化的抗體會有比較適合而推薦的固定液，請于購置前注較適合而推薦的固定液，請于購置前注意說明書。意說明書。3 3、各種固定液：、各種固定液： BouinBouin, ,S S固定液：飽和苦味酸固定液：飽和苦味酸750ml750ml，甲醛甲醛250ml250ml，冰醋酸，冰醋酸50ml50ml，其對組織的，其對組織的穿透力較強穿透力較強，固定較好，結構完整，固定較好，結構完整，但因偏酸，對抗原有一定損害，且組但因偏酸，對抗原有一定損害，且組織收縮明顯，不適于組織標本的長期織收縮明顯，不適于組織標本的

37、長期保存。保存。 PLPPLP液：即高碘酸鈉液：即高碘酸鈉- -賴氨酸賴氨酸- -多聚多聚甲醛，適于固定石蠟切片。甲醛，適于固定石蠟切片。適于富含適于富含糖類組織，對超微結構及許多抗原的糖類組織，對超微結構及許多抗原的抗原性保存較好。抗原性保存較好。（三）、組織脫水浸蠟及包埋（三）、組織脫水浸蠟及包埋脫水透明等過程需在脫水透明等過程需在4 4或室溫或室溫下進行，避免下進行，避免組織抗原的損失；組織抗原的損失；為使組織充分脫水、透明和浸蠟，組織塊的厚為使組織充分脫水、透明和浸蠟，組織塊的厚度以度以1.0-1.5mm1.0-1.5mm為宜為宜; ;浸蠟及包埋過程中浸蠟及包埋過程中, ,石蠟溫度應保

38、持在石蠟溫度應保持在6060或或6060以下以下, ,用熔點低的石蠟包埋用熔點低的石蠟包埋; ;制備蠟塊在較低的溫度進行制備蠟塊在較低的溫度進行, ,故試劑處理時應故試劑處理時應適當延長適當延長, ,否則會給切片帶來困難否則會給切片帶來困難常用的包埋法常用的包埋法石蠟包埋石蠟包埋冰凍干燥包埋冰凍干燥包埋塑料包埋塑料包埋（四）組織切片中載玻片的處理（四）組織切片中載玻片的處理n 抗原修復過程中，由于高溫、高壓、輻射抗原修復過程中，由于高溫、高壓、輻射n等諸多因素的影響，極易造成脫片。為保證等諸多因素的影響，極易造成脫片。為保證n試驗的正常進行，可選用試驗的正常進行，可選用Poly-L-Lysin

39、e Poly-L-Lysine 、nZLI-9001 APESZLI-9003 HistogripTMZLI-9001 APESZLI-9003 HistogripTM或或nZLI-9005 ZLI-9005 等幾種試劑，對已常規清洗的載等幾種試劑，對已常規清洗的載n玻片進行處理。具體方法如下：玻片進行處理。具體方法如下： Poly-L-LysinePoly-L-Lysine：將洗凈、干燥的：將洗凈、干燥的載玻片放入以載玻片放入以1:101:10比例去離子水稀比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡5 5分分鐘，鐘，6060o oC C烤箱烘烤一小時或室溫過烤箱烘烤一

40、小時或室溫過夜干燥。裝盒備用。試驗中使用的夜干燥。裝盒備用。試驗中使用的器具均為非玻璃制品。器具均為非玻璃制品。 （五）抗原修復（五）抗原修復n 抗原修復是指石蠟、冰凍、火抗原修復是指石蠟、冰凍、火棉膠、塑料切片免疫組織化學（棉膠、塑料切片免疫組織化學（IHCIHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性劑、前用胰蛋白酶、尿素、表面活性劑、微波緩沖液和金屬鹽等，使被掩蓋微波緩沖液和金屬鹽等，使被掩蓋的抗原決定簇或變性的抗原重新暴的抗原決定簇或變性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢復過露或抗原性得到一定程度的恢復過程。程。 石蠟切片為什么要做抗原修復？有那些方法石蠟切片為什么要做抗原修復？有那些方法

41、？ 石蠟切片標本均用甲醛固定，使得細胞內石蠟切片標本均用甲醛固定，使得細胞內抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇定簇, ,同時蛋白之間發生交聯而使抗原決定簇同時蛋白之間發生交聯而使抗原決定簇隱蔽隱蔽. .所以要求在進行所以要求在進行IHCIHC染色時染色時, ,需要先進行需要先進行抗原修復或暴露抗原修復或暴露, ,即將固定時分子之間所形成即將固定時分子之間所形成的交聯破壞，而恢復抗原的原有空間形態。的交聯破壞，而恢復抗原的原有空間形態。 常用的抗原修復方法有常用的抗原修復方法有微波修復法，微波修復法，高壓加熱法，酶消化法，水煮加熱高壓加熱法，酶消

42、化法，水煮加熱法法等，常用的修復液是等，常用的修復液是pH6.0pH6.0的的0.01mol/L0.01mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。的檸檬酸鹽緩沖液。抗原修復方法抗原修復方法一、熱修復一、熱修復 n1 1、微波爐加熱法、微波爐加熱法 將玻片分別插入抗原修復盒中，以保證各將玻片分別插入抗原修復盒中，以保證各部位的玻片受熱均勻。部位的玻片受熱均勻。 n在抗原修復盒中加入抗原修復液，蓋上帶有在抗原修復盒中加入抗原修復液，蓋上帶有小孔的蓋子。小孔的蓋子。 n將塑料盒置于微波爐中央，加熱將塑料盒置于微波爐中央，加熱 2x5min 2x5min 。兩次加熱之間，加入兩次加熱之間，加入 50ml 50ml

43、蒸餾水。蒸餾水。 加熱加熱過程中，組織標本不可干燥。過程中，組織標本不可干燥。 第二次處理后，將微波爐中的修復盒移至第二次處理后，將微波爐中的修復盒移至室溫冷卻室溫冷卻 15-20 15-20 分鐘。分鐘。 不要打開蓋子！不要打開蓋子！ 蒸餾水沖洗。蒸餾水沖洗。 阻斷內源性過氧化物酶并置于蒸餾水中。阻斷內源性過氧化物酶并置于蒸餾水中。 用用 TBS TBS 或或 PBS PBS 液沖洗。液沖洗。 進行免疫組化染色。進行免疫組化染色。 在壓力鍋中放入在壓力鍋中放入 1500-3000ml 1500-3000ml 抗原修抗原修復緩沖液加熱到沸騰，不加閥，玻片插入復緩沖液加熱到沸騰，不加閥，玻片插入

44、切片架并放入沸騰的修復緩沖液中。后加切片架并放入沸騰的修復緩沖液中。后加閥，使之加壓閥，使之加壓2 2分鐘。后將壓力鍋置于流分鐘。后將壓力鍋置于流水槽或繼續冷卻水槽或繼續冷卻 20 20 分鐘（減壓）。取出分鐘（減壓）。取出切片，蒸餾水沖洗，移至切片，蒸餾水沖洗，移至 TBS TBS 或或 PBS PBS 液液中，以避免組織干燥。中，以避免組織干燥。 以下同微波爐修復法以下同微波爐修復法 。 2、壓力鍋法、壓力鍋法n 抗原修復的方法選擇，關系到組織抗原修復的方法選擇，關系到組織抗原能否暴露充分，這對免疫組化染色抗原能否暴露充分，這對免疫組化染色效果有很大影響。因此應當根據不同的效果有很大影響。

45、因此應當根據不同的抗原特點，采用不同的修復方法。對某抗原特點，采用不同的修復方法。對某些細胞內抗原（如些細胞內抗原（如FasFas、BaxBax、FF等）和等）和細胞間質抗原（如細胞間質抗原（如LamininLaminin、CoIVCoIV等）則等）則需要用酶消化法處理切片。需要用酶消化法處理切片。 二、酶消化方法二、酶消化方法n1 1、胰蛋白酶處理：、胰蛋白酶處理： nA A 滴加一滴胰蛋白酶工作液于組織上。滴加一滴胰蛋白酶工作液于組織上。 nB B 室溫室溫 37 37 孵育孵育 20-40 20-40 分鐘，孵育時間分鐘，孵育時間的長短依福爾馬林固定時間及所測抗原情況的長短依福爾馬林固定

46、時間及所測抗原情況而定。而定。 nC C 蒸餾水沖洗，終止反應。蒸餾水沖洗，終止反應。 nD D 阻斷內源性過氧化物酶。阻斷內源性過氧化物酶。 nE E 免疫組化染色。免疫組化染色。 n2 2、胃蛋白酶處理、胃蛋白酶處理 nA A 滴加胃蛋白酶工作液于組織上。滴加胃蛋白酶工作液于組織上。 nB B 最佳消化時間取決于福爾馬林的固定最佳消化時間取決于福爾馬林的固定時間，時間， 37 37 預熱。一般消化預熱。一般消化 10 10 分鐘，分鐘，長至長至 30 30 分鐘。分鐘。 nC C 以下同胰蛋白酶處理方法以下同胰蛋白酶處理方法 3 ,4,5 3 ,4,5 。 n注：過度消化將導致組織結構的丟

47、失，注：過度消化將導致組織結構的丟失，并引起組織脫片并引起組織脫片三、綜合方法三、綜合方法 n微波爐加胰酶修復法：微波爐加胰酶修復法： n將組織切片置于盛有將組織切片置于盛有 50ml 50ml 修復液的塑料盒中，封修復液的塑料盒中，封口膜封口后加熱口膜封口后加熱 5 5 分鐘。分鐘。 n冷卻后打開，將切片置于冷卻后打開，將切片置于 37 37 預熱的蒸餾水中，預熱的蒸餾水中，胰蛋白酶消化。胰蛋白酶消化。 n室溫胰蛋白酶處理室溫胰蛋白酶處理 30 30 秒鐘。秒鐘。 n蒸餾水沖洗。蒸餾水沖洗。 n阻斷內源性過氧化物酶，置蒸餾水中。阻斷內源性過氧化物酶，置蒸餾水中。 n免疫組化染色。免疫組化染色

48、。操作中還應注意如下問題：操作中還應注意如下問題：n1 1、熱處理后應注意自然冷卻。、熱處理后應注意自然冷卻。2 2、熱處理時要防止切片干燥。、熱處理時要防止切片干燥。3 3、應根據不同的抗體選擇合適的抗原修、應根據不同的抗體選擇合適的抗原修復方法。復方法。4 4、一批抗原的檢測其溫度和時間一定保、一批抗原的檢測其溫度和時間一定保持一致。持一致。n5 5、注意形態學結構的改變、注意形態學結構的改變( (一般經高溫修復后一般經高溫修復后胞漿會無明顯的破壞，而對細胞核的影響較大，胞漿會無明顯的破壞，而對細胞核的影響較大，會出現核破裂，蘇木素淡染等現象，而經酶水會出現核破裂，蘇木素淡染等現象，而經酶水解的切片，其細胞漿破壞視消化時間而異，但解的切片，其細胞漿破壞視消化時間而異，但核破壞較輕核破壞較輕) )。6 6、如果在常用的緩沖液中無法實現