1、包涵體蛋白包被 ELISA 板檢測抗體的流程一、包涵體包被抗原制備：在包涵體蛋白尿素溶解后不能濃縮或者置換溶劑的情況下，可以采取直接使用包涵體尿素溶解液直接作為檢測原包被 ELISA 板。（ 1） 完成包涵體的制備和洗滌流程。（ 2） 按照常規流程溶解使用8M 尿素或者 1%SKL （十二烷基肌氨酸鈉）溶解包涵體。劇烈震動后，室溫靜置 30 分鐘至 2 小時或者 4過夜，使其緩慢溶解。注： 每 100mL 細菌提取的包涵體使用 2mL 含 8M 尿素的 Buffer A 溶解； 或者每 100mL 細菌提取的包涵體使用 2mL 含 1%SKL 的 Buffer A 溶解（使用前混合， ml B

2、uffer A 加入 ml 20 的 SKL 貯存液）。（ 3） 抗原稀釋：使用 碳酸鹽包被緩沖液（ CBS ） 4 倍稀釋包涵體溶解液，分裝凍存-20 冰箱，減少凍融次數。注意必須由少到多逐漸加入CBS,邊加邊震蕩，以免試劑濃度變化造成的蛋白沉淀。DMSO 溶解的用 CBS 稀釋 4 倍。加入 1:2-5 倍 PBS/TE/SW 液體后切膠磨碎，4 度放置 3-7 天，最高轉速4 度離心取上清凍存。二、包涵體包被抗原濃度的確定：1、稀釋抗原：取出包涵體抗原，4c融化。在ELISA板每孔加入100ML CBS將100ML抗原加入ELISA板第一豎排孔中；吹打 4-5次后，吸出100ML加到第二

3、豎排孔中；吹打 4-5次后，吸出100ML加到 第三豎排孔中，一次類推，最后一排吸出的100ML液體棄去。注：每種抗原至少稀釋 3 行，一行陽性血清檢測，一行陰性血清對照，一行使用含 8M 尿素的 Buffer A 做對照。2 、包被：4 過夜或37溫育2 小時。棄去孔內溶液，用 PBST 洗 3 次（洗滌方法：在ELISA 孔中加滿PBST ，室溫靜置 5 分鐘后棄去，反復三次）。拍干！3、封閉：5%脫脂乳300 ML 37c溫育2小時或4c過夜。棄去孔內溶液，用 PBST洗3次，拍干！。封 閉不徹底會導致假陽性！4 、稀釋陽性血清：在本實驗中，傅強的陽性血清和李仕超的陰性血清均做1000

4、倍稀釋。5、加樣：將100 ML稀釋好的血清加入上述已包被之反應孔中，置37c孵育1-2小時。用PBST洗3次，拍干！。6、加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標二抗10037c孵育不超過1小時，PBST洗滌3次，拍干！。7、加底物液顯色：各反應孔中加入100 ML TMB （避光），37 10-30min顯色。注：商品化的 TMB 其實是 TMB 和雙氧水的混合物，長期光照、高溫甚至生產日期超過1 個月都會導致試劑失效。8、終止反應：于各反應孔中加入50 ML 2M濃硫酸。9、結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏

5、色的深淺，以“ ” 、 “ ”號表示。也可測定OD 值：在 ELISA 檢測儀上，于 450nm 處，以空白對照孔調零后測各孔OD 值，若大于規定的陰性對照OD 值的倍，即為陽性。10 、 結果分析： 觀察陰性對照是否也發生反應； 選擇檢測陽性的最高稀釋倍數前3-4 孔的稀釋度作為最佳包被濃度。例如，陽性血清如果前 8 孔為陽性，那么以后檢測時抗原可以做24-5稀釋后包板為宜。三、包涵體包被 ELISA 板檢測未知抗體：1、稀釋抗原：按照前期實驗結果，用 CBS稀釋抗原。每孔加入 100 ML抗原稀釋液。2 、包被：4 過夜或37溫育2 小時。棄去孔內溶液，用 PBST 洗 3 次（洗滌方法：

6、在ELISA 孔中加滿PBST ，室溫靜置 5 分鐘后棄去，反復三次）。拍干！3、封閉：加入300 VL5%脫脂乳，37c溫育2小時或4c過夜。棄去孔內溶液，用 PBST洗3次。拍干！ 封閉不徹底會導致假陽性！4、加樣：將25-100 “L細胞上清或者待檢血清加入上述包被孔中，置 37c孵育1-2小時或4c過夜。用PBST洗3次，拍干。(根據實驗設計，同時做空白孔、陰性對照孔及陽性對照孔)5、加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標二抗100 Vb 37c孵育不超過1小時，PBST洗滌3次。拍干！6、加底物液顯色：各反應孔中加入100 VL TMB (避光)，37 10-30min顯色。注

7、：商品化的TMB其實是TMB和雙氧水的混合物，長期光照、高溫甚至生產日期超過1個月都會導致試劑失效。7、終止反應：于各反應孔中加入 50 VL 2M濃硫酸。8、結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以 午“、號表示。也可測定 OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm處，以空白對照孔調零后測各孔OD值，若大于規定的陰性對照 OD值的倍，即為陽性。計算公式：(待測樣 OD空白OD) / (陰性對照OD空白OD)。大于可判讀為陽性。試劑與耗材(1) SDS 裂解液 200mL成分終濃度用量SDS%Tris pH10mMEDTA1mM100mM 2mL(2)包被緩沖液 (pHM CBS碳酸鹽緩沖液)Na2CO3L59gNaHCO.293 MddH2O至 1000 iiiL(3)洗滌緩沖液(pH , M PBS )KH2PO4020 gNa:HPOr12H?O2.90 gNaCl8.00 gKC1OJO 2van - 200.50 niLdd H2O至 1000 niL(4