1、For personal use only in study and research; not forcommercial use實驗六 小鼠脾細胞培養【實驗目的】1. 了解原代細胞培養的基本方法及操作過程。2. 學習細胞計數、營養液的配制等，初步掌握無菌操作方法。【實驗原理】（ 一 ） 細胞原代培養原代細胞培養是指直接從動物體內獲取的細胞、 組織和器官，經體外培養后， 直到第一次傳代為止。 這種培養， 首先用無菌操作的方法， 從動物體內取出所需 的組織（或器官），經消化，分解成單個游離細胞，在人工培養下，使其不斷的 生長及繁殖。細胞培養是一種操作繁瑣而又要求十分嚴謹的實驗技術。 要使細胞能

2、在體外 長期生長， 必須滿足兩個基本要求： 一是供給細胞存活所必須的條件， 如適量的 水、無機鹽、氨基酸、維生素、 葡萄糖及其有關的生長因子、 氧氣、適宜的溫度， 注意外環境酸堿度與滲透壓的調節。二是嚴格控制無菌條件。（ 二） 細胞死活鑒定死活細胞的鑒定方法有很多種， 常用的有染色法和儀器分析法。 染色法是 常用的細胞死活鑒定方法， 簡便，易于操作。 不同的死活細胞鑒定方法有各自不 同具體的反應機理， 但無論采用何種辦法， 都是利用了死活細胞在生理機能和性 質上的差異。染色法分化學染色法和熒光染色法， 根據染色機理的不同， 染料或使死細胞 著色，或使活細胞著色。死活細胞在生理機能和性質上的差異

3、主要包括：死活細胞細胞膜通透性的差異： 活細胞的細胞膜是一種選擇性膜， 對細胞起 保護和屏障作用，只允許物質選擇性的通過；而細胞死亡之后，細胞膜受損，通 透性增加。常用的以臺盼藍鑒別細胞死活的方法就是利用了這一性質。臺盼藍， 又稱錐藍， 是一種陰離子型染料， 不能透過完整的細胞膜。 所以經臺盼藍染色后 只能使死細胞著色， 而活細胞不被著色。 甲基藍有類似的染色機理。 植物細胞的 質壁分離也可鑒定死活。死活細胞在代謝上的差異： 是采用美藍染料鑒定酵母細胞死活的依據。 美藍 是一種無毒染料， 氧化型為藍色，還原型為無色。由于活細胞中新陳代謝的作用， 使細胞內具有較強的還原能力， 能使美藍從藍色的氧

4、化性變為無色的還原型， 因 此美藍染色后活的酵母細胞無色； 而死細胞或代謝緩慢的老細胞， 則因它們的無 還原能力或還原能力極弱，使美藍處于氧化態，從而被染成藍色或淡藍色。除此之外， 還有一些細胞器的專有染料。 如液泡系的專有染料中性紅。 中性 紅是一種低毒性染料，可以使活細胞液泡著紅色，而細胞質和細胞核不被著色； 死細胞的液泡不被著色或淺染， 染料彌散于整個細胞中， 細胞核和細胞質被染成 紅色。有時侯為了增加染色效果可以將兩種染料結合使用，如甲基藍 - 中性紅混 合染色法。【實驗器材】剪子，棉球， 75%酒精，移液槍，無菌操作臺，正置光學顯微鏡，倒置光學顯微 鏡， 解剖盤，滴管，離心管，離心機

5、，注射器， Eppendorf 管，培養皿，酒精 燈，塑料培養皿，載玻片，蓋玻片，血細胞計數板等。【實驗材料】小鼠1只，細胞培養液（含生長因子）,Trypen Blue染液，PBS緩沖液【實驗步驟】（ 一 ） 細胞的原代培養1. 取材：取小白鼠一只，采用斷頭法處死；清水洗小鼠并浸于 75%酒精中滅菌 3 分 鐘。取出轉入超凈潔凈臺內的解剖盤內，無菌操作打開腹腔。取出脾臟，去除其 周圍的脂肪組織，鑷起脾臟用 PBS液自上而下沖洗1 2次。轉入無菌玻璃培養 皿中，待用。2分離脾細胞：PBS液 30滴，再用“ L”型針頭注*1 mm *lfnm *血球計數板用滴管先向上述無菌玻璃培養皿中滴入 射器在

6、皿中吸取PBS液 0.2ml ,然后將其沿脾 長軸方向注射入脾內（使脾臟膨脹以利于細胞 散開）。用針尖在脾臟上扎眼，并用“ L”針頭 輕刮脾臟表面擠出脾細胞，用滴管吸皿中的 PBS液沖脾臟并吹散刮出的脾細胞，稍傾斜并 靜置12分鐘。吸取上述靜置后的脾細胞懸液上清部分放入 Eppendof管，并使量至1ml, 以3000轉/分離心12分鐘。3 培養脾細胞：超凈潔凈臺中取塑料培養皿一個，用“槍（1ml）”加入細胞培養液2ml, 并在皿蓋上畫上標記，待用。取上述離心后的Eppendof 管,在超凈潔凈臺內開蓋棄去上清液，用“槍 （200卩l ） ”吸取塑料皿中的培養液400ml加入棄去上清液的Epp

7、endof管中， 用槍頭吹勻管底的脾細胞，然后吸取200ml脾細胞懸液接種于上述塑料培養皿中，混勻，然后放入37 C、5%C0培養箱中培養。（二）細胞死活鑒定及計數1. 試劑配制：用生理鹽水配成 5%Tyrpen Blue染液，備用。2. 染色計數：取0.5mL細胞懸濁液放入試管中，加入1-2滴染液。混合。2-5min后將細胞 放在血細胞計數板上觀察死活情況，注意不要有氣泡產生，放大倍數為 10x10。 染色后活細胞不著色，死細胞顯示藍色。注意染色時間不能超過 15mi n，否則染 液將細胞毒殺。3. 計數：在10x10倍的顯微鏡下觀察，計算血細胞計數板的4個4小方格的細胞數量。 包括細胞總數

8、與死細胞數量。壓線者計上不計下，計左不計右。圖1.血細胞計數板示例圖4.根據染色結果計算活細胞率：依據死細胞染成藍色、活細胞不著色的原則計 數死細胞數和細胞總數，以如下公式計算細胞存活率：細胞總數一死細胞蚪活細胞率（W = X 100也細胞總數”【注意事項】1嚴格進行動物消毒，需用75%酉精消毒。2、嚴格進行無菌操作，防止細菌、霉菌、支原體污染，避免化學物質污染。3、吸取液體前，瓶口和吸管硬行火焰消毒；吸取液體時，避免碰撞。4、離心管入臺前，管口、管壁應消毒。5、實驗者離開超凈臺時，要隨時用肘部關閉工作窗。6、器材使用時既要注意用火焰消毒，又要防止燙傷、燙死細胞。【實驗結果】本次試驗中計數所用

9、材料為培養1-2周后的小鼠脾細胞，培養液呈粉紅色, 且未被染菌，說明原代細胞培養過程中小鼠脾細胞得到增殖， 部分營養物質和其 生存所必須的物質被消耗掉。本次試驗采取的是Tyrpen Blue染液，活細胞不會被染色而呈無色，死細胞 會被其染色而呈藍色，在光學顯微鏡下以 10X10的倍數來觀察得細胞總數和活 細胞數，可由公式計算出細胞活力。圖2.細胞培養圖片圖3.細胞染色后圖片(10x10)I頁目卩方卜卩左下衛中間初右上玄右下如活細胞衛11174518*3死細胞衛5M8OP5E*3細胞存活率二(細胞總數TE亡細胞總數)用田胞總數*1。0畑 二活細胞數/細胞總數二(11+17+12+6+18) /(

10、59+49+60+52+52+11-F17+12+6+1S)*100%=64/336*100V=19. 059k每毫升液體中的細胞數目 =(336/5)*25*10000 =1.68*107 (個)分析與討論】本次實驗中我們小組所測細胞活力為 19.05%，并不算高，分析得應有以下 原因可能影響實驗結果(包括誤差) ：a) 若在無菌操作的過程中操作不規范，導致染菌，會極大的影響觀察，導 致實驗失敗；b) 若在離心分離呈單細胞的過程中離心機轉速過快或時間過長很可能會導 致細胞破裂，導致小鼠脾細胞大量死亡；c) 染色時間過長，或觀察時間過長都會導致染色試劑將細胞殺死，使細胞 活力驟降，這是導致細胞活力比較低的重要原因；d) 實驗中的一些操作不正確或不規范的情況、計算帶來的誤差等也會直接 導致實驗誤差。僅供個人用于學習、研究；不得用于商業用途For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen f u r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l ' e tud