1、第四章血液分析儀及其臨床應用第一節概述20世紀50年代初，電子血細胞計數儀開始應用于臨床，隨著電子技術、流式細胞術、激光技術、單克 隆抗體、計算機等高科技在血細胞分析儀上的應用，血液分析儀的研制水平不斷提高，檢測原理不斷完善， 測量參數不斷增多，現代血液分析儀（HQ具有下列特點：1 .自動化程度越來越高。2 .通過條形碼識別、自動運輸裝置、自動混勻、自動進樣、自動檢測、自動報告、自動清洗、自動涂片, 形成了模塊式自動化血液分析流水線。3 .提供參數越來越多： 能提供1840多個參數，如有核紅細胞數、淋巴細胞亞群數等。4 .精度越來越高： 采用定容計量、定時監控、三次平均法計數、延時計數等使精密

2、度大大提高。5 .速度越來越快：每小時可分析 50150份樣本。6 .強大的質控功能：有自動記錄質控結果、可供選擇的質控規則、自動繪制質控圖、失控報警、患者結 果浮動均值和患者結果Delta核查和報警等功能。7 .智能化程度越來越高：提供簡明直觀的直方圖或散點圖、提示異常結果報警信號、備有專家診斷系統 和遠程會診等功能。第二節檢測原理本節要點：（1）電阻抗法血液分析儀檢測原理（2）光散射法血液分析儀檢測原理（一）電阻抗法血液分析儀檢測原理1 .電阻抗法血細胞計數原理（庫爾特原理）將等滲電解質溶液稀釋的細胞懸液置入不導電的容器中，將小孔管（也稱傳感器）插進細胞懸液中。小 孔管內充滿電解質溶液，并

3、有一個內電極，小孔管的外側細胞懸液中有一個外電極。當接通電源后，位于小 孔管兩側電極產生穩定電流，稀釋細胞懸液從小孔管外側通過小孔管壁上寶石小孔（直徑<100 mi厚度約75pm）向小孔管內部流動，使小孔感應區內電阻增高，引起瞬間電壓變化形成脈沖信號，脈沖振幅越高，細 胞體積越大，脈沖數量越多，細胞數量越多，由此得出血液中血細胞數量和體積值。電阻抗原理示意圖2 .白細胞分類計數原理根據電阻抗法原理，經溶血劑處理的、脫水的、不同體積的白細胞通過小孔時，脈沖大小不同，將體積 為35450fl白細胞，分為256個通道，其中，淋巴細胞為單個核細胞、顆粒少、細胞小，位于 3590f1的 小細胞區，

4、粒細胞（中性粒細胞）的核分多葉、顆粒多、胞體大，位于 160fl以上的大細胞區，單核細胞、 嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、原始細胞、幼稚細胞等，位于 90160fl的單個核細胞區，又稱為中間型細 胞。儀器根據各亞群占總體的比例，計算出各亞群細胞的百分率，并同時計算各亞群細胞的絕對值，顯示白 細胞體積分布直方圖。三分類血球分析儀工作原理示意圖3 .血紅蛋白測定原理當稀釋血液中加入溶血劑后，紅細胞溶解并釋放出血紅蛋白，血紅蛋白與溶血劑中的某些成分結合形成一種血紅蛋白衍生物，在特定波長（530550nm下比色，吸光度變化與稀釋液中 Hb含量成正比，最終顯示 Hb濃度。不同類型血液分析儀，溶血劑配方不同

5、，所形成血紅蛋白衍生物不同，吸收光譜不同，如含氟化鉀 的溶血劑，與血紅蛋白作用后形成氟化血紅蛋白，其最大吸收峰接近540nmi（二）光散射法血液分析儀檢測原理1 .光散射法白細胞計數和分類計數原理（1）激光與細胞化學法1）過氧化物酶檢測通道白細胞經過氧化物酶染色后，胞質內顯示細胞化學反應。過氧化物酶活性：嗜酸性粒細胞中性粒細胞,單核細胞，淋巴細胞和嗜堿性粒細胞無過氧化物酶活性，此為血液分析儀白細胞分類的基礎。當激光束照射 到細胞時，產生不同強度的散射光，以吸光率（酶反應強度）為 X軸，光散射（細胞大小）為 Y軸，每個細 胞根據這兩個信號的不同，定位在散點圖上。各類白細胞在散點圖上的位置2）嗜堿

6、性粒細胞/分葉核檢測通道血液與酸性表面活性劑反應，不僅紅細胞溶解，而且除嗜堿性粒細胞外，其他所有白細胞膜均被破壞 胞質溢出，僅剩裸核。當激光束照射到細胞時，產生不同強度的散射光，形成二維細胞圖，其中，嗜堿性粒 細胞呈高狹角散射，定位于細胞圖上部，裸核細胞則位于細胞圖下部。嗜堿性粒細胞和分葉核粒細胞在散點圖上位置（2）容量、電導、光散射（VCS法1）利用電阻抗法原理測量細胞體積（V2）利用電導（C）技術測量細胞內部結構。原理是利用高頻電磁探針測量細胞內部結構，根據細胞核和 細胞質比例、細胞內顆粒大小和密度來識別體積相同、但性質不同的兩類細胞群體，如小淋巴細胞和嗜堿性 粒細胞。3）利用光散射（S）

7、技術測量細胞形態和核結構。原理是利用激光照射進入計數區的每個細胞，根據散 射光角度（10°70° ）的不同，提供每個細胞形態、核結構信息來鑒別中性粒細胞、嗜堿性粒細胞和嗜酸 性粒細胞。五分類血球分析儀原理示意圖V （volume）體積測量采用電阻抗原理；C （conductivity ）電導性是根據細胞壁能產生高頻電流的性能， 采用高頻電磁探針測量細胞內部結構；S （scatter ）光散射是來自激光的單色光束對細胞進行掃描，提供細 胞結構和形態的變化。根據VCS原理，顯示3種細胞散點圖：DF1 （體積和散射光）、DF2（體積和電導）、DF3（體積和電導, 但只顯示嗜堿性粒

8、細胞群）。DF1圖通過體積和散射光顯示不同白細胞位置DF2圖通過體積和電導顯示單核細胞、粒細胞和淋巴細胞位置DF3通過體積和電導顯示嗜堿性粒細胞群、單核細胞和淋巴細胞位置（3）電阻抗與射頻法1）嗜酸性粒細胞檢測系統：血液與嗜酸性粒細胞特異性溶血劑混合，使除嗜酸性粒細胞外的所有細胞溶 解或萎縮，采用電阻抗法計數嗜酸性粒細胞。2）嗜堿性粒細胞檢測系統：血液與嗜堿性粒細胞特異性溶血劑混合，使除嗜堿性粒細胞外的所有細胞溶 解或萎縮，采用電阻抗法計數嗜堿性粒細胞。3）白細胞分類檢測系統：采用電阻抗和射頻（能透入細胞內，測量核大小、顆粒多少）法，以直流電（D。 為橫坐標，以射頻（RF）為縱坐標，根據這兩個

9、信號將細胞定位于二維細胞散射圖上，因淋巴細胞、單核細 胞、粒細胞的大小、胞質量、胞質內顆粒大小和密度、細胞核形態和密度各不相同，從而進行分類。4）幼稚細胞檢測系統：根據幼稚細胞膜上脂質較成熟細胞少的特性進行檢測。在細胞懸液中加入硫化氨 基酸，幼稚細胞的結合量多于較成熟的細胞，而且，幼稚細胞對溶血劑有抵抗作用，當加入溶血劑后，成熟 細胞被溶解，幼稚細胞不被破壞，從而提供幼稚細胞信息（IMI）。顯示幼稚細胞的位置（4）多角度偏振光散射（MAPSS法當激光束照射到單個細胞時，從4個角度測定散射光密度：0° :前角光散射（1°3° ）,可測定細 胞大小；10°:

10、狹角光散射（7°11° ）,可測定細胞內部結構特征；90°:垂直光散射（70°110°）,可測定細胞核分葉情況；-90° :消偏振光散射（70°110° ）,可將嗜酸性粒細胞和其他細胞區分出來。多角度偏振光散射（MAPSS法檢測原理2 .光散射法紅細胞檢測原理以低角度前向光散射和高角度光散射同時測量 1個紅細胞。低角度（23° ）光散射能測量單個紅細 胞體積，高角度（5°15° ）光散射能測量單個紅細胞血紅蛋白濃度，得出 MCV MCH MCHCt,并顯示紅 細胞散射圖、單個紅細胞體積

11、和血紅蛋白含量直方圖。3 .光散射法血小板檢測原理單個球形化血小板通過激光束照射后，高角度（5°15° ）光散射能測量細胞折射指數（RI）,低角度 （2。3° ）光散射能測量細胞大小。在二維散射圖上得出血小板數量和相關參數。4 .網織紅細胞計數原理（1）利用新亞甲藍使網織紅細胞 RNAf色，加入使紅細胞內Hb溢出的試劑，使其成為“影細胞”，然 后采用VCS原理，得出網織紅細胞數和相關參數。（2）利用堿性槐黃。等熒光染料與網織紅細胞內的 RNA吉合，以波長488nmtB（激光束為激光源照射網 織紅細胞，得到前向散射光強度（細胞體積大小）和熒光強度（胞質內RN暇少），

12、形成二維顯示散點圖，得出網織紅細胞數和相關參數。顯示網織紅細胞（不同熒光強度）（左）顯示紅細胞、網織紅細胞和血小板（右） 第三節檢測參數本節要點：（1）檢測參數（2）檢測結果及表達形式（一）檢測參數常見血液分析儀檢測報告的術語和英文縮寫詞見表1-4-2表1-4-2常見血液分析儀檢測報告技術語和英文縮寫詞(二)檢測結果及表達形式常用三分群血液分析儀參考值見表1-4-3 。第四節血細胞直方圖本節考點：(1)白細胞直方圖(2)紅細胞直方圖(3)血小板直方圖左圖是細胞形成的不同大小的脈沖波，右圖是根據脈沖波整理出的細胞直方圖(一)白細胞直方圖血液分析儀在計數細胞數量的同時，還提供細胞體積分布圖形，橫坐

13、標為細胞體積大小，縱坐標為不同 體積細胞的相對頻率，稱為細胞直方圖。白細胞直方圖代表意義正常白細胞直方圖，在35450fl范圍內將白細胞分為3群，左側峰又高又陡為淋巴細胞峰，最右側峰又低又寬為中性粒細胞峰，左右兩峰間的谷區較平坦為單個核細胞峰。異常直方圖意義見表1-4-4。表15白細胞體積三分類急性淋巴細胞白血病時的白細胞直方圖特點急性淋巴細胞白血病時的白細胞直方圖特點急性非淋巴細胞白血病時的白細胞直方圖特點慢性淋巴細胞白血病時的白細胞直方圖特點所以，當發現某患者白細胞直方圖改變為一個單一峰的曲線，務必要對血涂片進行檢查，以排除急性白 血病。千萬不要漏診。單核細胞增多或嗜酸細胞增多癥時的白細胞

14、直方圖特點異常淋巴細胞增多癥時的白細胞直方圖特點慢性粒細胞白血病時的白細胞直方圖特點（二）紅細胞直方圖紅細胞直方圖曲線的峰頂對應的是紅細胞的MCV而曲線基底的寬度基本上反映紅細胞的 RDW正常紅細胞直方圖，在36360fl范圍內分布兩個細胞群體，從 50125fl區域有一個兩側對稱、較狹 窄的曲線，為正常大小的紅細胞，從 125200fl區域有另一個低而寬的曲線，為大紅細胞、網織紅細胞。， 當紅細胞體積大小發生變化時，峰左移或右移，或出現雙峰。（三）血小板直方圖正常血小板直方圖，在230fl范圍內分布，呈左偏態分布，集中分布于 215fl內。當有大血小板或 小紅細胞、聚集血小板時，直方圖顯示異

15、常。血小板直方圖受干擾的異常血小板直方圖（a）大量紅細胞碎片，（b）多數血小板聚集，（c）小紅細胞增多第五節方法學評價本節考點：（1）儀器性能的評價（2）干擾血液分析儀檢測的因素（一）儀器性能評價1989年，ICSH公布了用于評價血液分析儀性能、優點和局限性的含白細胞分類、網織紅細胞計數和細 胞標志檢測的血液分析儀評價指南。儀器性能評價內容見表1-4-5 o1 .樣本要求血液樣本要求在采集后4小時內進行處理，并需要各種類型的樣本，以反映血液中各種成分質和量的變 化（表 1-4-6 ）。2 .性能評價（1）稀釋效應：包括受倍比稀釋影響的參數：用同源乏血小板血漿稀釋壓積細胞，得到各種濃度，如 10

16、0%, 90% 80%,20%10%評價稀釋度與參數之間的線性關系。理想情況下，線性范圍越寬越好、回歸線應通過原點。不受稀釋效應影響的參數：如紅細胞平均指數，不受稀釋度影響，理論上應為一條水平回 歸線。（2）精密度：包括批內、批間精密度和總精密度。批內和批問精密度：是對同一批樣本（批內或重復 精密度）或二至多批樣本（批間精密度）的重復測定，用CV值表示。理論上，精密度研究樣本應覆蓋整個病理范圍，包括高、中、低值，進行重復測定，采用雙因素方差分析進行批內、批間精密度評價。批間精密度 受儀器校準和儀器漂移的影響。總精密度：總重復性由批內、批間精密度和攜帶污染結果得出。實驗時從 一個較大范圍中隨機抽

17、取樣本，并在幾小時內測定，采用單因素方差分析進行評價。若總精密度評價在較長 時間內完成，樣本貯存和穩定性也是重要影響因素。（3）攜帶污染：在運行臨床樣本前，必須對高值和低值樣本的攜帶污染進行評價，保證交叉測量時儀器 結果的穩定性。方法是連續測試高值樣本 3次（il、i2、i3）,隨后立即連續測試低值樣本 3次（jl、j2、j3）,按下列公式計算：（4）相關性：是儀器測定結果與常規方法相比的滿意程度。采用大量的、未經選擇的、覆蓋所有預期范 圍的樣本，用圖形表達方式顯示被評估儀器（Y軸）和常規方法（X軸）測定結果的差異，采用配對t檢驗進 行統計分析。（5）準確度：是“估計值與真值之間的一致性”。真

18、值由決定性方法或參考方法獲得。血細胞計數的參 考方法見表1-4-7 。（6）樣本老化：是采集靜脈血樣本，觀察隨時間增加測定結果的變化量。采集 10份樣本，5份為正常, 5份為異常，樣本分別貯存在室溫和 4C,并在0小時、30分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、 6小時、12小時、24小時、48小時和72小時內測試。以百分比或絕對值-時間作圖，觀察被測參數的變化。（7）樣本異常干擾物和敏感性：在相關性研究中，應測試大量的非選擇性樣本，若有必要，可對異常樣 本或已知干擾物樣本進行特殊研究（表 1-4-8 ）。（二）干擾血液分析儀檢測的因素 見表1 一 4 9。受干擾的白細胞直方圖a.聚集

19、的血小板干擾b.不完全溶解的紅細胞干擾不同干擾情況下的血小板直方圖 a.大血小板直方圖（曲線后半部分增寬和延伸）b.小血小板直方圖（曲線后半部分縮窄）聚集的血小板直方圖（曲線后半部分上揚并延伸、血小板計數假性減低）聚集的血小板直方圖（曲線平坦并延伸、血小板計數假性減低）小紅細胞干擾的血小板直方圖（曲線尾部抬高、延伸、血小板計數假性增高）第六節臨床應用本節考點：（1）部分檢測參數的臨床意義（2）紅細胞直方圖在貧血中的應用（一）部分檢測參數臨床意義（相關專業知識，專業實踐能力）1 .紅細胞血紅蛋白分布寬度（HDWV反映紅細胞內Hb含量異質性的參數，用單個紅細胞Hb含量的標準差表示，正常參考范圍為2

20、434g/L 遺傳性球形紅細胞增多癥時RDW HDWK顯增高，為小細胞不均一性高色素性貧血。2 .血小板平均體積（MPV(1)鑒別血小板減低的病因：MP4曾高，見于外周血血小板破壞過多所致血小板減低。MPM低，見于骨髓病變所致血小板減低。(2)評估骨髓造血功能恢復情況：局部炎癥時，骨髓造血未抑制，MPVE常。敗血癥時，骨髓造血受抑制，MPM低。白血病緩解時，MPW曾高。骨髓造血衰竭，MP麗血小板計數持續減低。骨髓功能恢復時， MPV 先上升，血小板計數隨后上升。(3)與血小板計數之間的關系見表1-4-10 。3 .血小板分布寬度(PDW (相關專業知識)儀器測量一定數量血小板體積后，計算所得外

21、周血血小板體積大小異質性參數。用血小板體積變異系數 來表示(CM。PDW大見于急性白血病化療后、巨幼細胞性貧血、慢性粒細胞白血病、脾切除后、巨大血 小板綜合a征、血栓性疾病、原發性血小板增多癥、再生障礙性貧血。PDWK低見于反應性血小板增多癥。表18血小板參數在不同血液病中鑒別意義血液 病名 稱PLTPCTMPVD免疫 性血 小板 減少 癥再生 障礙 性貧 血巨幼 紅細 胞貧 血骨髓 增生 異常 綜合 癥4 .低熒光率網織紅細胞(LFR和高熒光率網織紅細胞(HFR (專業知識)(1)骨髓移植：網織紅細胞計數是監測骨髓造血恢復的重要參數，通常移植成功后網織紅細胞比白細胞 提前34d增高。HFRt

22、曾高提示有較多未成熟細胞從骨髓進入外周血，故HFR化比網織紅細胞計數變化具有更重要意義。(2)貧血：溶血性貧血時 Ret、LFR HFR明顯增高。腎性貧血時 HFR上升、LFR下降、Ret正常。(3)放療和化療：長期化療導致網織紅細胞亞群發生變化， HFR MFR(平均熒光率網織紅胞)減低早于 LFR骨髓恢復時，HFR MF雙迅速上升。5 .網織紅細胞成熟指數(RMDRMI=(MFR+HFR/LFRX 100,參考值見表l-4-ll 。 RMI增高，見于溶血性貧血、特發性血小板減少性紫 瘢(ITP)、慢性淋巴細胞白血病(CLD、急性白血病、真性紅細胞增多癥、再生障礙性貧血、多發性骨髓 瘤。RM

23、I減低，提示骨髓衰竭和造血無效，見于巨幼細胞性貧血。l-4-ll網絡紅細胞成熟指數參考值6 .未成熟網織紅細胞指數(IRF)指未成熟網織紅細胞與總網織紅細胞百分比。未成熟網織紅細胞體積較大，含RNA勺量多。(1) IRF與網織紅細胞計數關系：見表1-4-12 。不附.如%蜘t瞬邪EETAMLtt口酎曲f蝴國1打演由怪甘腫慟順，皿1喇1蝌皿j&惴胸前(2)監測骨髓移植后恢復情況：骨髓移植后，全血細胞計數、白細胞分類計數、網織紅細胞計數是監測 骨髓恢復造血的早期指標。IRF較中性粒細胞絕對值、網織紅細胞計數更早反映骨髓細胞生成和骨髓移植成 功。IRF比骨髓移植前增高20%寸，表示紅系移植成功。IRF是骨髓移植成功最早、最靈敏的指標。(3)監測腎移植后紅細胞生成情況：腎移植后，IRF增高比網織紅細胞計數早7d,是腎移植成功較早、 較靈敏的指標。7 .單個網織紅細胞血紅蛋白量(CHr)可用于鑒別缺鐵性貧血(減少)和非缺鐵性貧血，