1、本科生畢業設計（論文）開題報告 畢業設計（論文）題目： 青蒿素的提取分離及鑒定 學生姓名： 喬瑩瑩 學號： 2011810735 分 院： 理工分院 班級： 應化1101 指導教師： 王磊 職稱： 講師 填表日期： 2015 年 1 月 2 日 杭州師范大學錢江學院教學部制一、 選題的背景和意義青蒿為菊科植物黃花蒿（Artemisia annua L.)的干燥地上部分1，青蒿素（Artemisinin C15H22O5）是從青蒿中提取分離得到的一種無色結晶。青蒿素是繼氯喹、乙氨嘧啶、伯喹和磺胺后最熱門的抗瘧疾特效藥，尤其對腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾具有速效和低毒的特點，已成為世界衛生組織推薦的藥品。

2、青蒿素在原植物青蒿中含量很低，一般只有7%左右。青蒿素作為抗痕疾骨干藥“奎寧”的替代藥物,市場潛力巨大。因此,對青蒿素的提取和應用技術引起了國內外許多研究者的極大關注2。目前,提取青蒿素的工藝基本成熟,已經工業化生產,但提取效率低,青蒿原料浪費嚴重,成本偏高3。同時已有多種測定青嵩素的方法見于文獻,但都存在著一定的缺點,如分析速度慢,成本高,過程復雜等，為了使青蒿素能夠快速、高效的擴散到提取介質中,得到較高的提取效率,為了找到一種迅速、簡便、靈敏度高的青蒿素測定方法,故本實驗采用正交試驗研究了超聲時間、超聲功率、超聲溫度和提取溶劑量對提取的影響，確定了最佳提取條件，提取所得濾液經減壓濃縮，除去

3、雜質，重結晶，干燥精制后的青蒿素純品。1青蒿及青蒿素1.1青蒿青蒿（Artemisia annua L.)又稱黃花蒿，為常用的中草藥之一。青蒿素（artemisinin ,QHS)是中國科學工作者從青蒿中提取、分離、鑒定的一種新型抗瘧藥，因其結構特殊，療效高，而毒性很低，引起國內外的重視4-5。青蒿廣泛分布于中國南北各地，資源十分豐富。由于青蒿品種、種植條件、種植技術等的差異，從而導致青蒿中青蒿素含量的不同6。一般南方地區的青蒿素含量高于北方，以南嶺山脈、武夷山脈以南為高含量區，尤其是以廣西、廣東以及海南北部最高。其最早出現于馬王堆三號漢墓出土的帛書五十二病方,而后在大觀本草、神農本草經、本草

4、綱目均有收錄，主要用于治療消暑、瀉熱、止汗等。黃花蒿的化學成分可分為揮發性和非揮發性成分。揮發性成分主要為揮發油,是一種淡黃色澄明的油狀液體。經過研究發現,揮發油中主要含蒿酮、蒲烯、桉油精、左旋樟腦、異蒿酮、丁香稀等16種化學成分。非揮發性成分中主要含有有青蒿素、青蒿甲素、乙素、丙素、青萬酸、香豆素、黃酮、豆留醇、谷留醇等7。1.2 青蒿素青蒿素為無色針狀結晶，易溶于丙酮、乙酸乙酯，在乙醇、乙醚中溶解，微溶于冷石油醚，幾乎不溶于水8。對熱不穩定，易受潮、熱和還原性質的影響而分解9。青嵩素(Artemisinin)是繼乙氨啼唆、氣喳、伯喹之后最熱的抗培特效藥,尤其是對于腦型拒疾和抗氯喹培疾,青蒿

5、素具有速效和低毒的特點,曾被世界衛生組織稱做是“世界上唯一有效的拒疾治療藥物”。它是一種含有過氧基的新型倍半蔽內酷化合物,分子式C15H22O510。1.3青蒿素的作用青蒿素的主要作用有抗瘧疾、抗腫瘤、抗真菌和其他藥理作用。青蒿素的抗癥疾作用機理主要在于在治療拒疾的過程通過青蒿素活化產生自由基,自由基與癥原蛋白結合,作用于痕原蟲的膜系結構,使其泡膜、核膜以及質膜均遭到破壞,線粒體腫脹,內外膜脫落,從而對癥原蟲的細胞結構及其功能造成破壞,且細胞核內的染色質也受到一定的影響11;青蒿素能夠致使乳腺癌細胞、肝癌細胞、宮頸癌細胞等多種癌細胞的調亡,對癌細胞的生長具有顯著的抑制作用，青蒿素及其衍生物的抗

6、腫瘤作用主要是依靠誘導細胞的調亡而實現的；青蒿素的査粉劑和水煎劑對炭疽桿菌、表皮葡萄球菌、白喉桿菌均有較強的抑菌作用,對結核桿菌、金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌等也具有一定的抑菌作用。目前青蒿素聯合治療已成為世界衛生組織推薦的治療瘧疾的首選方法12。2 實驗運用技術2.1 超聲波提取法超聲提取法是利用超聲波的空化作用、機械效應和熱效應等加速胞內有效物質的釋放、擴散和溶解，顯著提高提取效率的提取方法。主要理論依據是超聲的空化效應、熱效應和機械作用。當大能量的超聲波作用于介質時，介質被撕裂成許多小空穴，這些小空穴瞬時閉合，并產生高達幾千個大氣壓的瞬間壓力，即空化現象。超聲空化中微小氣泡的爆裂會產生極大的

7、壓力，使植物細胞壁及整個生物體的破裂在瞬間完成，縮短了破碎時間，同時超聲波產生的振動作用加強了胞內物質的釋放、擴散和溶解，從而顯著提高提取效率。超聲波提取法用于青蒿素的提取有以下優點13：無需加熱，耗能低，提取時間短，溶劑用量少，溶劑消耗低，提取物的結構沒破壞，效果好，操作簡單、快捷、方便。但此方法的缺點是噪聲大,實驗過程中產生大量的熱能,有效能源利用率低。2.2 硅膠薄層色譜法薄層色譜法是以涂布于支持板上的支持物作為固定相，以合適的溶劑為流動相，對混合樣品進行分離、鑒定和定量的一種層析分離技術。這是一種快速分離諸如脂肪酸、類固醇、氨基酸、核苷酸、生物堿及其他多種物質的特別有效的層析方法。利用

8、青蒿素化學性質中的顯色反應，對青蒿素進行檢測。硅膠薄層色譜法用硅膠作支持劑，其主要原理是吸附力與分配系數的不同，使混合物得以分離。當溶劑沿著吸附劑移動時，帶著樣品中的各組分一起移動，同時發生連續吸附與吸作用以及反復分配作用。由于各組分在溶劑中的溶解度不同，以及吸附劑對它們的吸附能力的差異，最終將混合物分離成一系列斑點。如作為標準的化合物在層析薄板上一起展開，則可以根據這些已知化合物的Rf值對各斑點的組分進行鑒定，同時也可以進一步采用某些方法加以定量。2.3 紫外分光光度法可見光、紫外線照射某些物質，主要是由于物質分子中價電子能級躍遷對輻射的吸收，而產生化合物的可見紫外吸收光譜。基于物質對光的選

9、擇性吸收的特性而建立分光光度法或稱吸收光譜法的分析方法。它是以朗伯比耳定律為基礎。 青蒿素由于沒有熒光發色基團,.其在波長205nm處有末端吸收,但是不能直接采用紫外分光光度法檢測,需經過前處理形成穩定的,有可見紫外吸收的新化合物以進行檢測。中國.藥典2010版二部的相關項下通過進行堿處理后在波長292nm處有明顯的紫外吸收,用紫外分光光度法測定Q292,達到對青蒿素進行含量測定的目的。張海榮14等用濃度為0.2%的NaOH溶液對不同產地青蒿中提取的青蒿素甲醇溶液進行處理,在50的水浴中反應30min,生產的Q292化合物在波長292nm處有明顯的紫外吸收,并對青蒿素的含量進行了測定。 3 實

10、驗條件選擇3.1 實驗條件的選擇本實驗對超聲時間、超聲功率、超聲溫度、提取溶劑用量這四個因素設計正交實驗,確定各個因素對青蒿素提取率的影響。3.2 溶劑選擇不同溶液對青蒿中青蒿素以及其它成分的溶解度不同，分別以60mL乙醚、氯仿、正己烷、石油醚(30 60 )為溶劑，在50 水浴下攪拌提取2h，結果發現氯仿和乙醚的吸光度均較高；石油醚、正己烷的吸光度則較小。其中氯仿提取產物中雜質峰最強，乙醚次之，此兩種溶劑的雜質峰遠遠大于石油醚。正己烷雖然雜質峰較弱，但提取率較石油醚低。所以4種溶劑中石油醚為較適宜的溶劑。 3.3 原料粒度的影響據研究認為青蒿素主要存在于植物細胞的腺體中 ，屬于胞內次級代謝產

11、物。提取介質首先從原料顆粒外部擴散進入顆粒內部和細胞內溶解青蒿素，由于內外青蒿素濃度差異，青蒿素再擴散進入主體溶液，因而原料顆粒大小對提取效率存在影響。結果發現粒度超過60目以后，粒度影響逐漸不明顯。因為過細的原料不僅增加原料預處理成本，而且還會給后續的液-固分離帶來困難，實驗操作過程中選60目為宜。二、 研究目標與主要內容（含論文提綱）研究目標：研究運用青蒿素提取分離及鑒定的實驗條件的影響因素，通過數據分析，確定最佳的提取條件，提高提取率。 主要內容：本實驗通過對超聲時間、超聲功率、超聲溫度、提取溶劑用量這四個因素設計正交實驗，對各種因素進行優化，得出青蒿素的最佳提取條件。 將提取出的青蒿素

12、粗品用丙酮溶解后，硅膠拌樣，干法上柱，用洗脫劑洗脫硅膠柱，收集各流分，經硅膠薄層色譜檢查，合并有效成分，濃縮至少量體積后靜置結晶。 青蒿素由于沒有突光發色基團,其在波長205nm處有末端吸收,但是不能直接采用紫外分光光度法檢測,需經過前處理可以形成穩定的,有可見紫外吸收的新化合物以進行檢測。本實驗依據青蒿素在堿性條件下生成青蒿素衍生物,生成的化合物Q292在波長292mn處有較為強烈的紫外吸收,通過其吸光度對青蒿素的含量進行測定。提綱： 1 引言1.1青蒿簡介1.2青蒿素簡介1.3青蒿素的作用2 實驗運用技術2.1超聲波提取法2.2硅膠薄層色譜法2.3紫外分光光度法3 青蒿素的測定方法3.1定

13、性分析3.2定量分析 4 總結及分析三、 擬采取的研究方法、研究手段及技術路線、實驗方案等本實驗以干枯的青蒿葉為原料，將青蒿葉搗碎，進行超聲提取。將提取出的青蒿素粗品用丙酮溶解后，硅膠拌樣，干法上柱，用洗脫劑洗脫硅膠柱，收集各流分，經硅膠薄層色譜檢查，合并有效成分，濃縮至少量體積后靜置結晶。根據青蒿素在堿性條件下生成青蒿素衍生物,生成的化合物Q292在波長292mn處有較為強烈的紫外吸收,用紫外分光光度計對青蒿素的含量進行測定。本實驗主要分為7步： 1.搗碎青蒿葉 2.超聲提取 3.減壓濃縮 4.硅膠純化 5.定性分析 6.定量分析 7.數據分析研究方法和手段文獻法：是根據一定的研究目的或課題

14、，通過調查文獻來獲得資料，從而全面地、正確地了解掌握所要研究問題的一種方法。文獻研究法被子廣泛用于各種學科研究中。實驗法：通過主支變革、控制研究對象來發現與確認事物間的因果聯系的一種科研方法。主動操縱實驗條件，人為地改變對象的存在方式、變化過程，使它服從于科學認識的需要。實驗方案1.提取將50克干燥青蒿葉搗碎后置1000ml分液漏斗中，依次用400,300,200ml丙酮分別超聲提取，抽濾，濾液合并后與3540中減壓濃縮，得油狀青蒿素粗品提取物。將95%乙醇45ml加入到100ml燒杯中，與50水浴中溶解青蒿素粗品提取物，冷藏過夜；過濾，濾渣用少量冷乙醇洗滌一次，合并濾液，減壓濃縮，得青蒿素粗

15、品。2.純化稱取硅膠（200-300目）20克裝柱，青蒿素粗品用丙酮溶解后，硅膠拌樣，干法上柱，分別用300ml石油醚和950ml石油醚-乙酸乙酯（98:2)作為洗脫劑快速洗脫硅膠柱，收集各流分（30ml/流分）。經硅膠薄層色譜（TLC）檢驗，石油醚-乙酸乙酯（85:15)為展開劑，5%香草醛-濃硫酸作為顯色劑，電吹風加熱呈藍紫色斑點，合并有效成分，濃縮至少量體積后靜置結晶。過濾，濾渣以少量石油醚洗滌至白色，干燥得青蒿素純品。3.顯色反應鑒定 樣品溶液：自制青蒿素少量，以適量三氯甲烷溶解。 展開劑：石油醚-乙酸乙酯（85：15）。 用毛細管吸取樣品溶液適量，點于硅膠薄層后，用上述展開劑展開。展

16、開劑吹干后，噴灑5%香草醛-濃硫酸，可觀察到黃色斑點，加熱后變成藍紫色斑點。4.標準品溶液的制備 精密稱取青蒿素標準品10mg于100ml容量瓶中，用乙醇定容。分別吸取0、2、4、6、8、10ml于50ml容量瓶中，加入乙醇至10ml，用質量分數為0.2%的氫氧化鈉溶液定容，置于50水浴中反應30min，冷卻至室溫后，用紫外分光光度計測定波長在292nm處的吸光度。5.樣品溶液的制備提取方法提取所得的青蒿提取液取出過濾。用旋轉蒸發儀減壓蒸干濾液，用乙醇溶解后轉移至10ml的容量瓶中，并用乙醇定容。精密吸取2.5ml提取液于50ml容量瓶中，加入乙醇至10ml，用質量分數為0.2%的氫氧化鈉溶液

17、定容，置于50水浴中反應30min,冷卻至室溫后，用紫外分光光度計測定波長在292nm處的吸光度。6.數據處理（1）根據標準曲線方程，帶入樣品中的吸光度，求得樣品濃度，根據體積求得青蒿素含量。（2）比較不同的提取條件，哪一種條件下提取的青蒿素的含量最高。（3）再獲得最佳提取條件下青蒿素的含量，取得最終的最佳提取條件。四、中外文參考文獻目錄（理工科專業應在10篇以上，文科類專業應在15篇以上，其中外文文獻至少2篇。）1 中華人民共和國藥典委員會. 中國藥典(一部)M. 北京:化學工業出版 社,2005,137-138.2 李偉,石崇榮.青蒿素研究進展J.中國藥房,2003,14(2):11811

18、9.3 周濃, 段意梅, 陳強. 青蒿素含量測定方法改進及黃花蒿植物質量評價J. 時珍國醫國藥,2008,19(4):911.4 Tu Youyou.The discovery of artemisinin(qinghaosu) and gifts from Chinese medicineJ. Nature Medicine,2011,10(17):1217-1220.5 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(二部)S. 中國醫藥科技出版社,2010,420:1156.6 向文, 李琳, 劉吉華等. UPLC-UV法測定不同產地青蒿中青蒿素的含量J. 中國野生植物資源,2012,31(4):

19、28-31.7 楊云, 張晶, 陳玉婷等.天然產物化學成分提取分離手冊M. 北京:中國中醫藥出版社,2003,4.8 中華人民共和國藥典委員會. 中國藥典(二部)M. 北京:化學工業出版社,2005,309-310.9 王宗德, 孫芳華. 青蒿素理化性質及其測定方法的研究進展J. 江西農業大學學報,1999,21(4):606-611. 10 韋記青, 蔣運生, 唐輝等. 黃花蒿葉礦質元素含量的研究J. 安徽農業科學,2008, 36(22) : 9597- 9598.11 鄭全芳, 楊志剛, 孫紅祥. 青蒿素及其衍生物藥理作用的研究進展J. 中國獸藥雜志,2006,40(1):40-44.12 GRAHAM IA, BESSER K, BLUMER S.Loci affecting yield of the antimalarial drug J. Science,2010,2(327):328-330.13 葛發歡, 陳列等. 黃花蒿中青蒿素的超臨界二氧化碳流體提取工藝研究J. 中國醫藥工業雜志,2000,31(6):250-253.14 王玉春, 吳江, 閉靜秀等. 青蒿素提取條件研究J. 中草藥,2000,31(6):4