1、實驗二十五 基因重組實驗重組體的篩選與鑒定 原理 限制性內切核酸酶酶切鑒定：具體原理見實驗二十一。 PCR反響鑒定：具體原理見實驗十八。 試劑 1、DNA模板 2、引物 3、Taq DNA聚合酶 4、dNTPsdATP、dGTP、dCTP、dTTP 5、10×PCR 反響緩沖液：100mmol/L Tris-HCl pH 8.3，500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2，0.1%明膠 6、礦物油 1、 超純水 8、EcoR I酶解反響液10×: 1mol/L pH7.5 Tris-HCl , 0.5mol/L NaCl , 0.1mol/L MgCl2 。

2、9、Hind III酶解反響液10×：1mol/L pH7.4 Tris-HCl , 1mol/L NaCl , 0.07mol/L MgCl2 。 3.50×TAE 電泳緩沖液：稱取242克Tris，參加57.1ml冰乙酸，100ml 0.5mol/L EDTA，調節pH至8.0，加蒸餾水至1000ml。 10、.凝膠加樣緩沖液：0.25%溴酚藍、0.25%二甲苯青FF、40%蔗糖水溶液w/v。 11、1%1.5%瓊脂糖凝膠：1×TAE 100ml含1g1.5g瓊脂糖。 器材 1、DNA擴增儀 2、電泳儀、電泳槽 3、微量移液器 4、紫外投射儀 5、0.5ml塑

3、料離心管 6、樣品槽模板梳子 7、錐型瓶100ml或50ml 8、一次性塑料手套 9、凝膠成像系統 操作步驟 1. 酶切反響體系的建立20l反響體系 按下表要求配制酶切反響體系 質粒DNA 6l 10×Buffer 2l HindIII 1l H2O 10l EcoR I 1l 混勻后置37水浴3h。 2. PCR反響體系的制備（25l反響體系） 按下表要求配制酶切反響體系 DNA 2l 10×Buffer 2.5l dNTP 0.1l H2O 17.2l Primer-1 0.1l TaqE 1l Primer-2 0.1l 50%甘油 2l 混勻后，2000rpm離心3

4、0sec，然后按 94 5min 94 40sec 55 40sec 35cycles 72 90sec 72 3min 3. 電泳：1%瓊脂糖凝膠酶切和1.5%瓊脂糖凝膠PCR反響 將20l酶切和PCR產物進行電泳，觀察結果。 Vocabulary in Biochemical technology A Absorbance 吸光度 Absorbent 吸附劑 Absorption chromatography 吸附層析 Absorption spectrum 吸收光譜 Acrylamide, Aa/Acr 丙烯酰胺單體 Adenine, A 腺嘌呤 Affinity chromatogra

5、phy 親和層析 Agarose 瓊脂糖 Agarose gel electrophoresis，AGE 瓊脂糖凝膠電泳 Allele specific oligonucleotide, ASO 等位基因特異性寡核苷酸雜交 Ammonium persulfate, AP 過硫酸胺 Angle rotor 角式轉頭 Anion exchange chromatography 陰離子交換層析 C Carrier ampholyte 載體兩性電解質 Cation exchange chromatography 陽離子交換層析 Cellulose acetate membrane electro -p

6、horesis，CAME 醋酸纖維薄膜電泳 Cellulose ion-exchangers 纖維素離子交換劑 Centrifuge 離心機 Centrifugal force 離心力 Centrifugal technique 離心技術 Coenzyme 輔酶 Column chromatography 柱層析 Cytosine, C 胞嘧啶 D Denature gradient gel eletro -phoresis , DGGE 變性梯度凝膠電泳 Deoxyribonucleic acid, DNA 脫氧核糖核酸 Dialysis 透析 Differential centrifuga

7、tion 差速離心 Discontinuous PAGE 不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳 E Eletro-osmosis 電滲 Emission spectrum 發射光譜 Exclusion chromatography 排阻層析 G Gel chromatography 凝膠層析 Gel filtration 凝膠過濾 Guanine，G 鳥嘌呤 H Homogenizer 勻漿器 Holozymase 全酶 I Ion-exchange chromatography 離子交換層析 Ion-exchange gel 離子交換凝膠 Ion-exchange resin 離子交換樹脂 Isoele

8、ctric focusing, IEF 等電點聚焦 Isoenzyme 同工酶 L Ligand 配基 M Melting temperature, Tm 溶解溫度 Matrix 載體 Mobile phase 流動相 Molecular sieve filtration 分子篩過濾 N N,N,N,N-methylenc Bisacrylamide , Bis N,N,N,N-四亞甲基 雙丙烯酰胺 N,N,N,N-tetramethylethylenedi -amine, TEMED 四甲基乙二胺 O Osmosis 滲透 P Paper chromatography 紙層析 Partiti

9、on chromatography 分配層析 Partition coefficient 分配系數 Photoelectric colorimetry 光電比色法 Plasmid 質粒 Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE 聚丙烯酰胺凝膠 Polymerase chain reaction, PCR 聚合酶鏈反響 Primer 引物 R Relative centrifugal force, RCF 相對離心力 Restriction endonuclease ，RE 限制性內切酶 Restriction fragment length polymo

10、rphism, RFLP 限制性片段長度多態性 Rate zonal centrifugation 速率區離心法 Reverse osmosis 反向滲透 Revolution per minute ,rpm 每分鐘轉速 Ribonucleic acid, RNA 核糖核酸 Rotor 轉頭 S Salting in 鹽溶 Salting out 鹽析 Saphadex 葡聚糖凝膠 SDS-PAGE SDS-聚丙烯酰胺凝膠 Sedimentation coefficient 沉降系數 Sedimentation velocity 沉降速率 Sedimentation time,ST 沉降時間 Sepharose 瓊脂糖凝膠 Sequencing 測序 Single strand conformative polymorphism, SSCP 單鏈構象多態性 Sodium dodecyl sulfate, SDS 十二烷基硫酸鈉 Spectrophotometer 分光光度計 Spectrophotometery 分光光度法 Stationary phase 固定相 Swing-out rotor 水平式轉頭 T Thin-layer chromatography, TLC 薄層層析 Transmittance 透光率 Thymine, T 胸