1、2第二章生物大分子分離純化技術生化楊質分禽的特辣性：要求：分需方法簡便，選擇性好，效率壽，保持 生化楊質的分子結構和構型，分離方法盡量不影 響生化楊質的生楊活性。由于生化煬質一般都很脆弱，易受化學、場理因 素影響而變性，因而分需過程常要求在低濕.潔 凈、溫和的條件下進行。本章所提到的生物大分子主要是指蛋自質、酶 及核酸。4本章主要的內彖包括:生化及臨床分析樣的預處理。生楊樣品的常規分離純化方法，如透析、微 過濾、冷凍干燥及禽心技術；生場大分子的赴泳分離純化技術；生楊大分子的色譜分需純化技術；2.1生化分析樣品的準備與預處理生化樣品極其復雜，首先應對所關心的待測楊 處于生場體的哪一個部住所荻得原

2、始的樣,并 對賣際分析之前應進行怠樣的處理必須有所了解。62.1樣醃的類型.采集及椽存 樣品的類型生化及臨床分析的樣品對象非常廣泛，分布于 動楊或人體的每一個部住。它們可以是內源性的 化合腸或外嫄性的化合暢。樣芫的基質可以是簡 單的血樣.尿樣，也可以是比較復雜的糞便以至 整個組織。這些基質非常復雜，常常由多相組成, 如血象和血細胞及多種分子量犬小不同的化合場。 彼分析對象的穩走性也變化極丸，有只能穩定存 益幾分鐘.對蛋匂酶極為敘感的肽類，也有幾乎 是完全穩定的藥場的代謝物。樣品的采集對于給定的樣醃。采集處理速度與樣的代謝 活性與它們的化學和生化穩定性密切相關。尿液中各種樣醃的濃度一般認為可穩走

3、幾小肘。 組織樣 般需要快遠冷凍以防止發生變化，采 樣者應該有相應的樣采集及保存的設務。81.血樣成人平均含6L的血液、其中約55%的血漿和45%的細胞。血樣的采集一般采取清晨空販采 血，以避免飲食、運動、情緒等對血液成分的 彩響。動物一般采取禁食1216h后采血，一 般生化檢臉所需的血液標本采取費脈抽血。7血樣有全血、血漿和血清之分。102.組織樣品組織樣通常采自肝、肌由、肺、骨髓或腸。這類組織是代謝活性的，因此采樣后幾費之肉要牲液氮中或其它冷卻和中冷凍O樣品的毎存一般來說，任何生楊樣品釆集后都應立即進行分 析。但由于種種原因，這往往是不可能的。樣也 許需要運送到賣殮室，也許完成一個研克需要

4、所有 的樣品同肘測定。任何在法律上有敗的分析必須注朗保存可期及保存條件等。液氮12生場體液中許多成分保存在室溫或4C下肘，由于 沉淀、蒸發、氧化或細菌的進攻等原因，其濃度會發 生變化。對于血淸樣,若對其中的鈉或血請自蛋勺 進行分析，多樣品保存在-20C對，20天內不會發生 碉顯的變化。有些成分在保存期問確實可以發生朗顯 的變化，如兒黍酚胺,因此必須椽存于-20或-70C下， 必要肘可以加一些抗氧化利或酶抑制劑。讓血漿 或血請與紅血球接觸對，由于酶篙性的改變成彼分析 對象在細胞內外分布的變化會使分析結果發生變化。 所以、一般要快速分禽成單一的相。11樣的初步處理盡管許多化合楊在全血漿中更為穩定，

5、但另一 些，如氨基酸則應保存柱不含妥自質的溶液中。 許多樣分析之前都要求除去妥自質 用于去除 蛋勺質的各種沅淀方法的比較見表：14常用妥匂質沉法方法的比較樣品沉淀制沉淀制與樣品的體枳分數人 Ml 漿（除 99%的蛋白質）三氯乙酸（10% W/V）*0-2二氯乙酸（6% W/W）0.7鶴酸鹽-硫酸0.7硝酸（5% W/V）3.0硫酸鋅-盤麵化頓2.0乙1.3丙酮1.4乙醇3.0甲酵4.()飽和硫酸鐵約 3.0超翦心約除 98%0 匸下加熱 10 mm約除 95 鳴紅細胞提取液（除 97%的蛋口質）三氯乙酸（5% W/V）4.5三氯乙酸（10% W/V）3.X=氯乙酸（1,% W/V）3.3-w表

6、示質童，v農示體積.w/va示質量怵積比。2.1.2礫樣品的準備酶是一種具有催化活性的蛋自質，它的催化活性 是其特征參數。任何分需純化步驟都應考慮酶的生物 活性的保持問題。生理樣品中酶的絕對濃度的測走從原理上講是很簡 單的，分析肘的主要問題是純的酶標樣的荻得。16酶在夭然界中總是存疫于很復雜的混合楊中， 通常一種細胞中可能含有成百上千種酶，為了了解 和分析一個復雜生理拝芫，如亞細胞麥、細胞或整 個組織中的酶，就必須將酶放農一個盡可能簡單的 體糸中進行研克。通過對單一酶的硏克可以獲得酶 對哪些底楊具有特異性、及應的動力學參數及酶作 用方式。所有這些數據對于研丸酶在復雜體糸中的 坊能是非常重要的。

7、在許多匪學及工業應用方 面.是否具有純的酶制劑非當關鍵。15酶活性的夠持要獲得生理樣応酶坊 能研克的可靠 數據 必須對 酶進行純化。雀.整個純化過程中如何保持酶的活 性是最關鍵的，細胞內酶在分需純化過程中能抗 各種環境對酶活性的影響。但當酶從天然的保護環境中釋枚出來后，它對每一步純化步驟都很敘感,細胞膜酶對嫁解尤其做感。18可滾性蛋自質不論是存在于細胞質的還是細胞 彖內的，其蛋匂質濃度從100 mg/ml到高達400 mg/ml（線卷體基質內）。體糸中存在各種天然的還 原和（如谷胱甘肽）使蛋匂質保持高的還原電伐。其 它穩定利也存在，如不同的底楊及產物。在蛋勺 質純化過程中組織彼玻壞，蛋匂質從它

8、們的保護 環境中釋放出來.彼限制在不同部住的蛋勺水解 酶也同時彼釋放出來。所以要對所關心的酶進行 保護，以防止其彼氧化、水解或不可逆變性。通過控制純化過程中的pH、溫度及有機溶劑的 使用可以防止酶的變性。所使用緩沖溶液的pH應 控制在68之間，并保持合適的需子強度使其可以 防止酶變性。檸純化過程的溫度吟低至15-25 C可 以使許多吟解過程減3-5o20酶在稀溶液中由于對甕皿壁或色譜填料的吸 附會引起變性。吸附使酶的四級結構解離而失 去活性，這種變性可以通過加入載體蛋勺來阻 止。比較需用的栽體蛋勺有牛血淸匂妥勺，或 商醃化的結構簡單、分子量已知的合成蛋匂。我體蛋自選擇條件：1.與酶之間無相互作

9、用；2分子量與酶的分子量爰至少12得，以便必要對 可以很方便地用排阻色譜將二者分需。19一些特球的反應令使催化活性部住的 活性喪 失一些。柱純化過程中一些輔助因子的失去會使 酶的活性喪夾，為此可以在純化緩沖液中加入輔 助因子。催 化活性 部住氨 基酸戎 基的共 價化學 修飾很 常見，最易彼修飾的氨基酸為半胱氨酸。R-SH+R-SHR-S-S-R22對蔬基氧化的防止：1. EDTA絡合全屬W子（非全屬酶）2.加入含琥基迖和，如琥基乙醇、2,3二蔬基丙醇. 蔬基葡萄糖酸、谷胱甘肽、半胱氨酸等對蛋自質酶解的防止：蛋勺水解酶來自涪細胞的內部， 哺乳動場將其 包裝在溶酶體中，而在微生楊中.它們則存在于

10、質膜和細胞壁之間。在用細胞勻漿法制備酶提取 物肘會發生蛋勺水解酶的猝放，所以對其活性要 進行抑制。根據蛋勺水鮮酶的類型可以選用不同 的抑制劑O24常用蛋勺酶抑制劑1.氣代確酸二異丙酯(DEP)：可抑制絲氨酸蛋自酶,但在使用上DEP比較危險，因為它具有樣發 性，并能進攻人的乙酰膽喊酯酶而影響人的神經 傳導 C2.笨基甲基磺眺氟(PMSF)：非揮發性絲氣酸酶的 抑制劑，而且不與人的乙I膽喊酶作用。它還可 以抑制一些蔬基蛋匂酶及象酸肽酶。3.胃蛋自酶抑制素和甲(乙)酰-亮亮精三肽是酸 性蛋自水解酶類很強的抑制劑，彼抑制的酶有胃 蛋匂酶、組織蛋匂酶及酵母蛋勺酶A。23由于細胞質 中含有當達10% 15

11、%(W/V)的非 水成分，處在蛋勺質周囲的水分子不能自由流動 而使蛋匂質分子的結構加以穩定。在酶提取楊制 備過程中為了模擬這種情況，通常加入非水的親 水分子：甘油或糖醇如葡萄糖、果糖、乳糖及山 梨糖醇。26在毎步純化之后都要進行酶活性和妥勺質量 的測走。在純化過程中酶的比活性(u/mg)逐漸增 加并最終達到最大。酶的粗提物要用硫酸鏤或聚 乙二醇(PEG)進行分組泥淀加以濃縮，也可以用 色譜哌附，然后再迅速從色譜基質上解壽下來。沉淀的蛋勺質溶解癥小的體積中，這樣可由于濃 度高而JL穩定。離心法(500050000 g)很適合于 亞細胞組分及硫酸鏤和PEG沅淀的酶的分禽。25生理樣品中具有生楊活性

12、礫的制備1酶活性測定過程確定生理樣芫中酶的活性一般都要經過以下幾個 步驟：(1)酶及反應液的制備，反應液通常由一走濃度的 底楊組成，并有確走的溫度、pH及其它催化反應所 需要的輔助因子；(2)檸酶加入反應液或將反應液加入到酶制劑中并 進行溫育以引發反應，隨后的測走都以引發反應的 對間為起A；(3)反應可以用不同的方式終止，最常用的方法是 使酶夾去活性；28(4)檸酶反應產場從酶和底場中分需出來；(5)測走和鑒走在特走的肘間內由酶反應所生成的產 物；(6)在有 些情況下酶的活性可以用反應速度法來測走;數據分析。272.樣品的制備方法對所有的生場樣品(組織、尿液.脳脊髓液及細胞 培養液等)柱分析之

13、蔚都要進行下述準備工作；(1)研兗對象的準備(如動楊)；(2)標本的采集；(3)由標本制備樣;(4)標本或樣的形態；(5)標本或樣品的保存；(6)用于酶法分析樣品的預處理；(7)標本是來自于研克對象的一部分，并作為研克的 代表。30從生理樣芫制備具有生楊涪性的酶肘，主要應考 慮兩種因素：1.選擇什么樣的生場樣芫作為進行純化的起始原料。 如：令有麥骨、組織、生楊液.微生楊細胞及從培 養液或發酵液中獲得的單細胞生楊等；分需開的各 種細胞混合楊，經嫁鮮所猝扳出來的 亞細胞碎片， 它們 包括像線粒體類的 細胞麥及膜組 分或含可溶性 成分。對這類樣品進行處理的第一步是不同細胞彖 的分禽及可溶楊與不溶楊的

14、分需，然后對膜成分進 行溶解，最后將不同種類的分子加以分需。292.樣縣應純化到什么程度。傳統的純化法最終所得到的是均勻的蛋自質溶 液。樣醃純化的主要目的是能夠分析單一的酶活 性而不受其它物質的干擾。但對有些研兗，其它 有活性成分的存在則是有利的或必要的。32(1)從組織或甕官制等樣組織和彖官至少可以分為兩部分，即細胞和細胞 內 成分。所感興趣的成分可能存在于 上述兩個部分 中的任何一個。將整個未損傷的細胞從穩定的小纖 維基質中分離出來要采用細胞篩選技術。通當所使 用的用于基質玻碎的方法(如切、剪、松碎)會迭成 一些細胞的玻碎，而利 用純化的酶可以對基質進行 特辣方式的4如膠原酶可用來玻碎哺乳

15、動楊組 織。使用胰蛋勺酶及其它蛋勺水解酶也取得了 一定 的成功，這拝的方法所得到的是細胞的混合場，細 胞內成分中也包括了一些不溶性的碎片及加入的酶 和試劑。(2)從組織或器官培養液中制務樣品經培養的樣品通?？砂搭愃朴谏厦娴姆椒ㄟM行。 值得注意的是要逹免由于外加的細胞內成分及培 養介質所產生的影響。因為它們中可能含有來自 于介質本身或在樣品培養過程中所產生的具有酶 活性的楊質。34(3)從細胞培養液制備樣品對在培養液中生長的哺乳動楊細胞或細苗等樣 % ,在分析之前要將非細胞成分與細胞成分分開，細胞與培養液.的分禽采用低速禽心就可以賣現，上請液要進行酶活性分析，濾餅留下來用于溶解 和分析 o總之，

16、酶樣応的制備區別于其它的生場丸分子， 其預處理過程相對較復雜，應根據實驗的要求嚴 格進行每步操作。332.2生楊樣醃的常規分富純化方法2.2.1透析(Dialysis)透析是用于生楊大分子分離和純化的一種簡單而古 老的方法， 它是在滲透中既有溶劑流動又有滾質流 動的過程。操作：把待分需或純化的樣芫封入由半透膜組.成的 透析袋內，然后將袋子放入低禽子強度的透析液中 進行透析。根據半透膜規格的不同，只有膜內分子 量小于分子量阻截范囲的分子才可以透過膜進入透 析液中，從而賣現大分子與小分子的分壽或生楊大 分子的純化36操作要點：為了加速透析的進程，一般莊透析的過程 中要進行連續攪拌，同對在透析篆內霧

17、下大約 透析裊總體積10%的空陳，以便使得迓析膜界 面兩側能逐過膜的分子滾度梯度加大。逸析平 衡的肘間一般為46小時，進一步透析需要換 液。考慮到彼透析的生楊分子較壽濕度下易變 性，透析一般在34。（：下進行。35透析膜常用的透析膜材料有犬棉膠、玫病紈以及纖維 素等。膜孔徑的丸小可以有不同的規格，在醫藥 工業中常使用纖維素透析管，其分子量阻帆范囲 為1.0 x103-5.0 x104o38凌析管的選擇：主要考慮分子董阻截范圏其次考慮管的尺寸37透析管的預處理透析管使用之前一般要進行運多的處理，以除 去諸如甘油、重全屬需子、含硫污染楊及可能存 在的蛋匂或核酸水解酶類。40透析液最常用的透析液是水

18、，一定pH和離子強度的緩 沖液或壽分子惰性楊質的濃溶液。柱純的水中透 析一般速度比較快.但有逢成生楊楊質活性喪失 的危險。所以，通常選擇具有一定pH和禽子強度 的緩沖液作為透析液.有肘也可以選擇壽分子惰 性物質的濃嫁液，因為壽分子不會進入膜內而 水分子可以自由出入膜孔。柱這種情況下，除了 正活的透析之外，由于膜內外激透壓差的存在， 膜內JL多的水會逐析到膜外，直到內外滲逐壓達 到平衡為止，因而，也具有濃縮樣芫的功能,39it析的應用透析的主要用途是從生楊丸分子樣中除去鹽類或 其它小分子場質。1.在分需及純化蛋勺質及菌肘經常要加入有機溶 劑 或無機鹽類，如硫酸段或硫酸鈉以沉淀蛋勺質 類生場大分于，由于生楊大分孑征沉淀的同肘會 不可避免地混雜有這些小分子，從而干擾生場大 分子的進一步純化或性質鑒;t。透析法是除去這 些小分子的簡便而有效的方法。42it析的應用2.用來除去與生場大分子結合較弱的小分子或禽子, 如全屬禽子及酶的輔助因子NAD, FAD等