1、地中海貧血的產(chǎn)前診斷 地中海貧血(地貧)是人類遺傳性血紅蛋白(Hb)病的一種類型,該病是由于人類珠蛋白基因的先天性缺陷而導(dǎo)致相應(yīng)的珠蛋白鏈合成缺乏或完全缺如,形成Hb的鏈與非鏈比例失衡,從而使患者產(chǎn)生中度或嚴(yán)重的溶血性貧血表現(xiàn)。由于早期報(bào)道的病例幾乎都是來(lái)自于地中海地區(qū)的移民,該病遂被命名為地中海貧血,后來(lái)發(fā)現(xiàn)地貧并非一種而是一組疾病,且在全球熱帶和亞熱帶廣為流行的遺傳性溶血性疾病。根據(jù)珠蛋白肽鏈合成受到抑制的類型,地貧可以分為地貧、地貧、地貧、地貧、地貧和地貧等。和地貧是人群中最常見(jiàn)的地貧類型。目前,全世界至少有億人攜帶地貧的致病基因,全球地貧基因攜帶者頻率高達(dá)%,包括中國(guó)南方在內(nèi)的東南亞地

2、區(qū)、印度次大陸、地中海地區(qū)、中東、北非和太平洋地區(qū)都是該病的高發(fā)地區(qū)。 20世紀(jì)70年代中期,分子遺傳學(xué)的興起使和地貧成為世界上最早被說(shuō)明分子水平根底的人類單基因病之一;70年代末期,對(duì)和珠蛋白基因簇的結(jié)構(gòu)鑒定和染色體定位的研究成果,奠定了開展地貧產(chǎn)前診斷的基石。在前人說(shuō)明珠蛋白基因結(jié)構(gòu)和基因缺失類型的根底上,1976年,美國(guó)華裔科學(xué)家簡(jiǎn)悅威(Kan Yuetwai)應(yīng)用液相雜交技術(shù),對(duì)珠蛋白基因cDNA進(jìn)行定量檢測(cè),并檢測(cè)其與胎兒DNA(培養(yǎng)的羊水細(xì)胞)的雜交率,實(shí)現(xiàn)了對(duì)珠蛋白基因缺失拷貝數(shù)的檢測(cè),結(jié)果顯示,被測(cè)胎兒DNA的雜交率(65%)明顯高于其雙親(攜帶者)的雜交率(57%)因此判定該

3、胎兒為健康胎兒。這一研究工作是世界上第一次采用分子診斷技術(shù)完成的人類單基因遺傳病的臨床實(shí)踐,也是人類單基因病產(chǎn)前診斷的第一個(gè)成功案例,開創(chuàng)了人類遺傳性疾病分子診斷的先河。 一、產(chǎn)前診斷地貧的歷史回憶 由于地貧的治療代價(jià)昂貴且難以治愈,通過(guò)產(chǎn)前診斷阻止重型地貧患兒出生是目前公認(rèn)的首選預(yù)防措施。探索地貧產(chǎn)前診斷的研究工作最早始于20世紀(jì)60年代末,研究發(fā)現(xiàn),地貧患兒臍帶血中珠蛋白鏈的合成明顯低于健康新生兒,隨后的研究工作證實(shí),從孕中期臍血中也可以檢測(cè)出孕婦Hb的水平。這些研究促進(jìn)了在20世紀(jì)70年代中、末期采用胎盤穿刺取樣進(jìn)行胎兒血的地貧產(chǎn)前診斷的臨床實(shí)踐。由于受分析技術(shù)的限制和相關(guān)根底研究的欠缺

4、,當(dāng)時(shí)的地貧產(chǎn)前診斷只是一些零星的個(gè)案報(bào)道。 地貧產(chǎn)前診斷在臨床上的廣泛開展得益于相關(guān)分子遺傳學(xué)根底的深入研究和DNA檢測(cè)技術(shù)的開展。如前所述,1976年由簡(jiǎn)悅威(Kan YuctWai)博士首次報(bào)道的針對(duì)地貧的產(chǎn)前分子診斷的臨床實(shí)踐,對(duì)推動(dòng)地貧乃至人類遺傳病的產(chǎn)前診斷是一個(gè)劃時(shí)代的事件。隨后,于20世紀(jì)70年代末開始,以英國(guó)和美國(guó)為首的科學(xué)家對(duì)人類和地貧的分子機(jī)制進(jìn)行了廣泛的深入研究,詳細(xì)說(shuō)明了和珠蛋白基因的結(jié)構(gòu)和功能,以及導(dǎo)致地貧的基因缺失類型及其與臨床表型的關(guān)系;同時(shí),地貧作為歷史上最先被說(shuō)明的人類單基因遺傳病,又是最早采用PCR技術(shù)應(yīng)用于臨床產(chǎn)前診斷的遺傳性疾病。概括起來(lái)講,該領(lǐng)域30

5、多年的研究成果,為我們開展地貧產(chǎn)前診斷提供了以下幾個(gè)方面的相關(guān)研究根底:(1)基因定位、基因調(diào)控和分子病理學(xué)根底研究:研究說(shuō)明了導(dǎo)致和地貧的和珠蛋白基因的染色體定位、基因突變及其功能異常與發(fā)病的關(guān)系;以及血液學(xué)和臨床表型的變化規(guī)律及其與基因型的關(guān)系。(2)遺傳流行病學(xué)和基因突變譜鑒定:研究說(shuō)明了地貧的地域分布特征、人群中基因突變譜的種族差異,以及不同高發(fā)區(qū)的人群基因頻率和遺傳負(fù)荷。(3)分子診斷技術(shù)的建立和開展:建立了和地貧等的基因缺失和點(diǎn)突變的DNA診斷技術(shù),使DNA診斷技術(shù)成為產(chǎn)前診斷的主流技術(shù)。此外,其他一些根據(jù)遺傳表型進(jìn)行疾病診斷的技術(shù),如胎兒臍帶血分析和胎兒心胸比值超聲檢測(cè)也被應(yīng)用于

6、地貧Hb Ba胎兒水腫綜合征的產(chǎn)前診斷中。 我國(guó)在該領(lǐng)域的相關(guān)根底研究和臨床產(chǎn)前診斷起步于20世紀(jì)70年代后期,在80年代中期完成了全國(guó)20個(gè)省市(自治區(qū))的萬(wàn)人的大規(guī)模Hb病的調(diào)查及其局部基因缺陷的分析,得出了中國(guó)南方是地貧高發(fā)區(qū)的結(jié)論。曾溢滔、吳冠蕓和張基增等最早說(shuō)明了中國(guó)人和地貧的基因突變譜,并于1984年和1986年先后成功地完成了我國(guó)和地貧高風(fēng)險(xiǎn)患兒的產(chǎn)前基因診斷。對(duì)和地貧的產(chǎn)前基因成功診斷代表了我國(guó)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最早采用現(xiàn)代遺傳學(xué)技術(shù)的應(yīng)用成果之一。自20世紀(jì)9O年代以來(lái),我國(guó)在該領(lǐng)域的研究主要集中在我國(guó)南方高發(fā)區(qū)人群的分子流行病學(xué)、中間型地貧及導(dǎo)致該病少見(jiàn)類型突變基因的鑒定、分子診斷新

7、技術(shù)的研發(fā)及其在人群預(yù)防中的應(yīng)用,這些研究對(duì)推動(dòng)我國(guó)南方高發(fā)區(qū)地貧的臨床診斷和人群預(yù)防奠定了堅(jiān)實(shí)的根底。 二、產(chǎn)前診斷地貧技術(shù)的應(yīng)用及其現(xiàn)狀 如前所述,地貧分子根底和人群特異性基因突變譜確實(shí)定,為地貧的臨床病例確診和產(chǎn)前診斷奠定了理論根底。用于臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病例確診和產(chǎn)前診斷所需要的分子診斷技術(shù)隨后應(yīng)運(yùn)而生,從1976年至今,針對(duì)絨毛和羊水細(xì)胞中DNA分子診斷技術(shù)應(yīng)用于地貧的產(chǎn)前診斷已經(jīng)積累了35年的經(jīng)驗(yàn),期間分子診斷技術(shù)不斷開展和變化。目前,應(yīng)用的主流技術(shù)都是基于PCR技術(shù)根底上的基因突變分析技術(shù),可以說(shuō)現(xiàn)代分子診斷技術(shù)廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前診斷,完全受益于簡(jiǎn)便、快速和經(jīng)濟(jì)的PCR技術(shù)的普及。目前,

8、用于地貧產(chǎn)前診斷的代表性技術(shù)大體可分為以下兩類:檢測(cè)基因缺失突變的單管多重跨越斷裂點(diǎn)PCR技術(shù)和多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA);檢測(cè)基因點(diǎn)突變的反向點(diǎn)雜交技術(shù)(RDB)、變性高效液相色譜技術(shù)(dHPLC)和DNA序列分析技術(shù)等。此外,最近開展的基于實(shí)時(shí)熒光PCR平臺(tái)的新技術(shù),如用于地貧缺失拷貝數(shù)定量的實(shí)時(shí)熒光PCR直接檢測(cè)技術(shù)、以及用于檢測(cè)地貧點(diǎn)突變的基于探針熔解曲線的基因分型技術(shù)(PMCA),可能是下一步更新?lián)Q代的技術(shù)選擇。上述胛p PCR、RDB和MLPA等為地貧檢測(cè)的主流技術(shù),目前,國(guó)內(nèi)外已有和地貧分子診斷商品化的檢測(cè)試劑盒問(wèn)世。 上述分子診斷技術(shù)主要用于臨床病例確診,以及以預(yù)防為目的

9、的分子水平的篩查和高風(fēng)險(xiǎn)胎兒的產(chǎn)前診斷。DNA突變分析是包括診斷地貧在內(nèi)的單基因遺傳性疾病的“權(quán)威性信息,通過(guò)對(duì)患者DNA的和珠蛋白基因的突變及其基因型進(jìn)行分析,可以完成絕大多數(shù)和地貧患者的臨床確診,并可根據(jù)基因型檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行臨床分類、準(zhǔn)確預(yù)測(cè)其病程和預(yù)后G但由于局部中間型地貧的基因缺陷比擬復(fù)雜,尚不能根據(jù)基因型檢測(cè)結(jié)果預(yù)測(cè)其臨床表現(xiàn)和病程開展。在地貧的產(chǎn)前診斷實(shí)際工作中,分子篩查的應(yīng)用是近年來(lái)不可無(wú)視的重要方面,其主要應(yīng)用對(duì)象是靜止型地貧,由于傳統(tǒng)的血液學(xué)篩查不能發(fā)現(xiàn)靜止型地貧的陽(yáng)性表型,故應(yīng)用分子診斷技術(shù)直接檢測(cè)這類基因攜帶者是不可替代的技術(shù)選擇。以廣西為例,通過(guò)分子診斷技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)人群中

10、7.%的靜止型地貧基因攜帶者,這對(duì)于當(dāng)?shù)厝巳焊唢L(fēng)險(xiǎn)家庭的遺傳負(fù)荷評(píng)估十分必要。在產(chǎn)前診斷的醫(yī)學(xué)實(shí)踐中,目前有兩種應(yīng)用對(duì)象,一是回憶性產(chǎn)前診斷,即針對(duì)已經(jīng)生育過(guò)重型地貧患兒的家庭,再次妊娠時(shí)進(jìn)行產(chǎn)前診斷,這是目前欠興旺國(guó)家和地區(qū)的主要操作方式,我國(guó)的情況也大致如此;二是前瞻性產(chǎn)前診斷,即通過(guò)對(duì)高發(fā)區(qū)人群的大規(guī)模篩查主動(dòng)發(fā)現(xiàn)地貧高風(fēng)險(xiǎn)家庭,進(jìn)一步通過(guò)遺傳咨詢開展產(chǎn)前診斷,從而到達(dá)降低重型地貧患兒出生的目的。由于同型地貧攜帶者婚配的下一代有的時(shí)機(jī)罹患中間型或重型地貧,因而地貧患兒的出生是嚴(yán)重影響高發(fā)區(qū)人口質(zhì)量的公共健康問(wèn)題。從20世紀(jì)70年代末至今,以降低人群重型地貧患兒出生率為目標(biāo)的大規(guī)模人群篩查

11、和產(chǎn)前診斷方案,已在地中海地區(qū)等一些國(guó)家進(jìn)行了成功的實(shí)踐,取得了世人矚目的疾病預(yù)防效果。我國(guó)從1993年開始,一些醫(yī)院開展了前瞻性的地貧預(yù)防模式研究,并于1998年開始,在珠海等地區(qū)探索了在社區(qū)根底上的大規(guī)模人群預(yù)防方案實(shí)施的試點(diǎn),積累了一些珍貴的經(jīng)驗(yàn)。在國(guó)家衛(wèi)生部推動(dòng)下,我國(guó)地貧發(fā)病率最高的廣西壯族自治區(qū),已經(jīng)于2021年開始啟動(dòng)了大規(guī)模人群預(yù)防方案,其目標(biāo)是通過(guò)5年的努力使全區(qū)的重型地貧患兒出生率大幅度下降。這一方案以及在廣東省一些地區(qū)開展的類似方案,是今后我國(guó)地貧等遺傳病產(chǎn)前診斷領(lǐng)域的開展方向。 三、對(duì)地貧研究的展望 地貧是世界上最早被說(shuō)明分子根底水平,又是最先應(yīng)用分子診斷技術(shù)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)前診

12、斷的人類遺傳性疾病,由于通過(guò)產(chǎn)前診斷可以到達(dá)阻止患兒出生的目的,地貧也是WHO優(yōu)先推薦在開展中國(guó)家實(shí)施預(yù)防的遺傳性疾病。通過(guò)絨毛、羊水和臍帶血的創(chuàng)傷性取樣技術(shù)與DNA診斷的結(jié)合,進(jìn)行產(chǎn)前診斷已成為包括中國(guó)在內(nèi)的許多開展中國(guó)家的常規(guī)實(shí)驗(yàn)室遺傳效勞工程。盡管如此,為克服創(chuàng)傷性診斷給孕婦帶來(lái)的流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)和穿刺引起的負(fù)面心理影響,無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷和植入前遺傳診斷(PGD)是國(guó)內(nèi)外近20多年以來(lái)一直致力于開展的研究領(lǐng)域261,在這些研究中,地貧又成為重要的研究和臨床應(yīng)用對(duì)象,其中一些通過(guò)對(duì)孕婦血漿中胎兒DNA進(jìn)行或地貧的無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)已經(jīng)出現(xiàn),特別是該領(lǐng)域最近引入的新一代測(cè)序技術(shù)(NGs)和單分子PCR

13、定量檢測(cè)技術(shù),將對(duì)解決和地貧這類單基因病的無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的技術(shù)難題起關(guān)鍵作用,可能是未來(lái)10年最值得期待的臨床應(yīng)用技術(shù)方案。目前,PGD技術(shù)已成功應(yīng)用于包括和地貧在內(nèi)的單基因遺傳性疾病的胚胎遺傳診斷3032,我國(guó)學(xué)者也開展了類似的研究工作L3334J?？傮w上看,針對(duì)地貧的PGD技術(shù)較孕婦血漿中胎兒DNA檢測(cè)的無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷更為成熟一些,經(jīng)過(guò)技術(shù)改良和提高,地貧的PGD成為臨床常規(guī)檢測(cè)工程將有廣闊的應(yīng)用前景。 我國(guó)南方地區(qū)是全球地貧高發(fā)區(qū)之一,由于我國(guó)地貧高發(fā)區(qū)涉及的人口多、地域廣,因此,這一疾病防治對(duì)于提高我國(guó)南方地貧高發(fā)區(qū)人民的健康水平和人口質(zhì)量具有重要意義。我國(guó)在該領(lǐng)域的研究以及臨床和預(yù)防

14、醫(yī)學(xué)實(shí)踐中,還有以下一些重要問(wèn)題需要面對(duì)和解決:(1)一些主要高發(fā)區(qū),如福建、云南、海南、貴州、四川等省仍然缺乏詳實(shí)、準(zhǔn)確的遺傳流行病學(xué)調(diào)查資料,通過(guò)整體設(shè)計(jì)、應(yīng)用新技術(shù)開展包括這些地區(qū)在內(nèi)的中國(guó)南方地貧高發(fā)區(qū)的疾病譜的調(diào)查十分必要,也是當(dāng)前首先需要實(shí)施的研究任務(wù)。這一重要遺傳病在世界各種族人群中的基因頻率和突變譜調(diào)查,仍然是該領(lǐng)域面臨的重要課題:(2)中國(guó)人群在地貧分子水平的根底研究尚需加強(qiáng),特別是中間型地貧的遺傳異質(zhì)性和相關(guān)遺傳修飾基因的研究,需緊跟國(guó)際前沿,利用本民族的地貧資料開展發(fā)病機(jī)制的原創(chuàng)性研究,其中胎兒Hb調(diào)節(jié)機(jī)制在地貧發(fā)病中的作用,是值得關(guān)注的重要研究靶點(diǎn),這一課題研究有賴于聯(lián)合高發(fā)區(qū)多家醫(yī)院大樣本、多中心合作才能完成。(3)繼續(xù)開展適合我國(guó)人群的分子診斷新技術(shù)的研發(fā),特別是開展可滿足大規(guī)模人群篩查所需要的簡(jiǎn)單、快速、高通量的分子診斷技術(shù)尤為重要,這類技術(shù)的應(yīng)用可為提升我國(guó)地貧的整體防治水平提供技術(shù)支撐。同時(shí),分子診斷技術(shù)也是制定適合我國(guó)國(guó)情的地貧分型和診治標(biāo)準(zhǔn)的根底。(4)推動(dòng)以降低重癥地貧患兒出