1、高級動物生化試題問答題：1.簡述非編碼 RNA(non-coding RNA )的種類、結構特點及其主要功能。非編碼 RNA 的種類結構和功能1tRNA 轉運 RNA(transferRNA，tRNA)結構特征之一是含有較多的修飾成分，核酸中大部分修飾成分是在tRNA 中發現的。修飾成分在 tRNA 分子中的分布是有規律的，但其功能不清楚。5末端具有 G (大部分)或 Co 3末端都以 ACC 勺順序終結。有一個富有鳥嘌呤的環。 有一個反密碼子環， 在這一環的頂端有三個暴露的堿基， 稱為反 密碼子(anticodon ).反密碼子可以與 mRN 鏈上互補的密碼子配對。有一 個胸腺嘧啶環。tRN

2、A 具有三葉草型二級結構以及“ L”型三級結構，tRNA 的不同種類及數量可對蛋白質合成效率進行調節。tRNA 負責特異性讀取mRNA 中包含的遺傳信息，并將信息轉化成相應氨基酸后連接到多肽鏈中。tRNA 為每個密碼子翻譯成氨基酸提供了結合體，同時還準確地將所需氨基 酸運送到核糖體上。鑒于 tRNA 在蛋白質合成中的關鍵作用，又把 tRNA 稱作 第二遺傳密碼。 tRNA 還具有其他一些特異功能，例如，在沒有核糖體或其 他核酸分子參與下， 攜帶氨基酸轉移至專一的受體分子， 以合成細胞膜或細 胞壁組分；作為反轉錄酶引物參與 DNA 合成；作為某些酶的抑制劑等。有的 氨酰-tRNA 還能調節氨基酸

3、的生物合成。2rRNA 核糖體 RNA( ribosomal RNA, rRNA)核糖體 RNA 是細胞中最為豐富的 RNA 在活躍分裂的細菌細胞中占 80%以上他們是核糖體的組分，并直接參與核糖體中蛋白質的合成。核糖體是 rRNA 提供了一個核糖體內部的“腳手架” ，蛋白質可附著在上面。這種解釋很直 接很形象，但是低估了 rRNA 在蛋白質合成中的主動作用。較后續的研究表 明，rRNA 并非僅僅起到物理支架作用，多種多樣的 rRNA 可起到識別、選擇 tRNA 以及催化肽鍵形成等多種主動作用。例如：核糖體的功能就是，按照mRNA 勺指令將氨基酸合成多肽鏈。而這主要依靠核糖體識別tRNA 并催

4、化肽鍵形成而實現。 可以說核糖體是一個大的核酶 （ ribozyme） 。而核糖體的 催化功能主要是由 rRNA 來完成的,蛋白質并沒有直接參與。3tmRNA tmRNA 主要包括 12 個螺旋結構和 4 個“假結”結構，同時還包括一 個可譯框架序列的單鏈 RNA 吉構。tmRNA 中 H1 由 5端和 3端兩個末端形 成，與tRNA的氨基酸受體臂相似。 H1和H2的5部分之間有一個由10-13nt 形成的環，類似 tRNA 中的二氫尿嘧啶環，稱為“ D環。H3 和 H4, H6 和 H7, H8 和 H9, H10和 H11 之間分別形成 Pk1, pK2, pK3, pK4。H4 和 H5

5、 之 間則由一段包含編碼標記肽 ORF 的單鏈 RNA 連接。 H12 由 5 個堿基對和 7nt 形成的環組成， 類似 tRNA中的 TWC 臂和 TWC 環，稱為“T”環。tmRNA結構按照功能進行劃分可分為 tRNA 類似域（TLD 和 mRN 類似域（MLD, TLD 主要包括 H1,H2,H12, “D環和“T”環，MDL 則包括 ORF 和 H5,這兩 部分分別具有類似 tRNA 和 mRNA 勺功能。tmRNA 是一類普遍存在于各種細菌 及細胞器（如葉綠體，線粒體）中的穩定小分子RNA 它具有 mRNA 分子和tRNA 分子的雙重功能，它在一種特殊的翻譯模式反式翻譯模式中發揮 重

6、要作用。同時，它與基因的表達調控以及細胞周期的調控等生命過程密 切相關，是細菌體內蛋白質合成中起“質量控制”的重要分子之一。識別 翻譯或讀碼有誤的核糖體，也識別那些延遲停轉的核糖體，介導這些有問題的核糖體的崩解。4核仁小 RNA(snoRNA) 絕大多數 snoRNA 可歸為兩類 boxC/D snoRNA 和 boxH/ACA snoRNA 均具有保守的特征二級結構，boxC/D snoRNA 類能 形成“發夾-鉸鏈-發夾-尾部”狀二級結構。boxC/D snoRNA 其分子兩端的 box C,boxD 以及末端配對序列能形成保守的“莖-內環-莖”狀二級結構， 稱為“ K-turn ”結構。

7、大多數 boxC/D snoRNA 和 box H/ACA snoRNA 分 別具有指導 rRNA snRNA 或tRNA 前體中特定核苷 2 -O-核糖甲基化修飾與 假尿嘧啶化修飾的功能；少部分snoRNA 參與 rRNA 前體的加工剪切，與 rRNA 的正確折疊和組裝相關。5微 RNAmicroRNAsmiRNA 小分子 RNA它是一類長度為 2125 nt 的單鏈 RNA 分子片段，有一個很有趣的共同特點，就是它的序列存在于莖環 結構中的莖上。這種莖環結構通常是由 70 多個核苷酸組成的不完全的發 夾結構，上面有一些凸起和環狀結構。莖部形成雙鏈 RNA ，但不是嚴格互 補，可存在錯配和

8、GU 擺動配對。據其作用模式的不同可以分為三類：第一 類如 lin4，與 mRN不完全互補，當 miRNA 與靶 mRN 不完全配對結合時， 主要影響其翻譯過程而對 mRNA 的穩定性無影響。第二類如 miR39 和 miR171,與其靶 mRN 完全互補，當其與 mRN 完全配對結合后， 分裂切割靶 mRNA 第三類作用模式如 let7，當其與靶 RNA 完全互補配對時， 直接靶向切割 mRN，A 而不完全互補配對時起調節基因表達的作用。6小干擾 RNA(Small interferingRNA； siRNA)siRNA 是長度 20 到 25個核苷酸的雙股 RNA 在生物學上有許多不同的用

9、途。目前已知 siRNA 主要 參與RNA 干擾(RNA)現象，以帶有專一性的方式調節基因的表達。此外，也參與一些與 RNAi 相關的反應途徑，例如抗病毒機制或是染色質結構的改變。其生理意義在于，生物的抗御機制，調控細胞分化與胚胎發育，維持 基因組的穩定以及 RNA 水平上的調控機制。7snRNA (小核 RNA)： 它是真核生物轉錄后加工過程中 RNA 剪接體(spilceosome )的主要成分，參與 mRN 前體的加工過程。另外，還有端體酶 RNA(telomerase RNA)， 它與染色體末端的復制有關；以及反義RNA(antisense RNA,它參與基因表達的調控。還參與 RNA

10、 剪接和 RNA 修 飾。8eRNA eRNA 從內含子或 DNA 非編碼區轉錄的 RNA 分子，精細調控基因的轉錄和翻譯效率。9SNP RNA 信號識別顆粒 RNA 細胞質中與含信號肽 mRN 識別，決定分泌的RNA 功能分子，它是一種核糖核酸蛋白復合體。能夠識別并結合剛從游離核 糖體上合成出來的信號肽，暫時中止新生肽的合成，又能與其在內質網上 的受體(即停靠蛋白質 )結合而將新生肽轉移入內質網腔，防止蛋白水解酶 對其損害另外，還有端體酶 RNA(telomerase RNA),它與染色體末端的復制有關；以及反義 RNA(antisense RNA，它參與基因表達的調控。還參與 RNA 剪接

11、 禾口RNA 修飾。10 gRNA 又稱引導 RNA真核生物中參與 RNA 編輯的具有與 mRN 互補序列的RNA ,具有 3寡聚 U 的尾巴，中間有一段與被編輯 mRN 精確互補的序列,5 端是一個錨定序列，它同非編輯的 mRNA 序列互補。在編輯時，形成一個編輯 體(editosome),以 gRNAs 內部的序列作為模板進行轉錄物的校正，同時產 生編輯的mRNAgRNA3 端的 oligo(U)尾可作為被添加的 U 的供體。piRNA 主要存在于哺乳動物的生殖細胞和干細胞中，通過與 Piwi 亞家族蛋白結合形成 piRNA 復合物(piRC)來調控基因沉默途徑。 對 Piwi 亞家族蛋白

12、的11 piRNA遺傳分析以及 piRNA 積累的時間特性研究發現，piRC 在配子發 生過程中起著十分重要的作用。 還能維持生殖系和干細胞功能和調節翻譯和 mRNA 勺穩定性。12 atRNA (反義 RNA 是指與 mRN 互補的 RNA 分子，由于核糖體不能翻譯 雙鏈的RNA 所以反義 RNA 與 mRNA 特異性的互補結合，即抑制了該 mRNA 勺 翻譯。通過反義 RNA 控制 mRNA 勺翻譯是原核生物基因表達調控的一種方式， 反義 RNA也參與了入和 P22 噬菌體的溶菌/溶源狀態的控制。2.請以發育生物學(developmentalbiology )、表觀遺傳學(epigenet

13、ics)、體細胞重編程技術(somatic cell reprogramming)、體細胞克隆(somatic cellcloning)、細胞凋亡(apoptosis) 或誘導干細胞(iPS)、干細胞(stem cell)為關 鍵詞，閱讀至少一篇 2010 年以后的外文文獻，闡述相關方面研究進展，或有關 技術在動物生殖細胞(卵母細胞、精子)發生、卵泡發育、早期胚胎發育過程 中的應用研究(不少于 2000字，并附上所閱讀文獻全文)。注意不能抄襲有關 中文文獻。動物生化實驗技術試題1、 試述分子雜交技術(核酸和蛋白質)的種類、適用范圍及特點。核酸分子雜交技術是利用 DNA 變性與復性的原理，在某種

14、理化因素作用下 DNA 雙 鏈分子解鏈變性后，在 DNA 復性重新形成雙螺旋結構時，把不同的 DNA 單鏈分子 或者DN 與 RNA 勺混合物放在同一溶液中，只要在 DNA 或 RNA 單鏈分子之間存在一 定的堿基互補配對關系，就可以在 DN 之間或 DNA 與 RNA 之間形成雜化的雙鏈。蛋 白質分子雜交是一種借助特異性抗體鑒定抗原的有效方法。面重點介紹三種常用的分子雜交技術。(1)Southern 雜交-DNA 和 DNA 分子之間的雜交southern 雜交主要用來研究 DN 分子中某一基因位置、某一專一序列在待檢樣品 中存在與否及兩種核酸分子之間的相似性。1、用于對基因組中特定基因的定

15、位 及檢測。2、用于從基因文庫中找到所需要的基因。(2)Northern 雜交 DNA 口 RNA 分子之間的雜交。目前主要用于檢測某一組織或細胞中已知的特異性mRN 的表達水平或比較不同組織或細胞中同一基因的表達情況，如在基囚工程中是檢測目的基因是否轉錄 出 mRN的方法。如果 RNA 分子在大小和含量上與正常情況不同，可以考慮是否有 調控區的突變或剪接部分的突變。(3)western 雜交蛋白質分子 (抗原一抗體 )之間的雜交。 可用于檢測樣品中特異蛋白質是否存在、細胞中特異蛋白質的半定量分析以及 蛋白質分子的相互作用研究等。如檢測目的基因在受細胞中有沒有翻譯出相應 的蛋白質，檢測病人血液

16、中是否有某種抗體從而檢測是否感染過某種抗原， 單 克隆抗體技術中用于篩選出能產生特定抗體的雜交瘤細胞等。2. 簡述核酸和蛋白質濃度分析方法。(1)紫外分光光度法紫外分光光度法基于 DNA 鏈上堿基的苯環結構在紫光區具有較強吸收，DNA/RNA 在260nm 處有最大的吸收峰，蛋白質在 280nm 處有最大的吸收峰，鹽和小分子 則集中在 230nm 處。因此，可以用 260nm 波長進行分光測定核酸濃度，OD 直為1 相當于大約 50 卩 g/ml 雙鏈 DNA 單鏈 DNA 濃度約為 33 / ml, RNA 勺為 40卩g/ml，寡核苷酸約為 35 g/ml。如用 1cm 光徑，用 H2O

17、稀釋 DNA/RNA 羊品 n 倍并以 H2O 為空白對照，根據此時讀出的 OD260 直即可計算出樣品稀釋前的濃 度：DNA(mg/ml) =50XOD260 讀數X稀釋倍數 /1000 RNA( mg/ml) =40 xOD260 讀 數x稀釋倍數/1000。A280nm 是蛋白和酚類物質最高吸收峰的吸收波長，比值可進行核酸樣品純度評 估：純DNA 的 A260/A280 比值為 1.8，純 RNA 為 2.0。假如比值低，表示受到蛋 白(芳香族)或分類物質的污染，需要純化樣品。比值 =1.5 相當于 50%蛋白質 /DNA 溶液。A230nm 是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長，比值可進行

18、核酸樣品純度評估：純 DNA 和 RNA 的 A260/A230 比值為 2.5。若比值小于 2.0 標明樣品被碳水化合物 (糖類)、鹽類或有機溶劑污染，需要純化樣品。A320nm 或 A340nm 為檢測溶液樣品的濁度，該值應該接近 0.0。假如不足，標明 溶液中有懸浮物，需要純化樣品。( 2)定糖定磷法 定糖定磷法是通過測定核酸中戊糖和無機磷含量實現對核酸含量的測定。該法 無需特殊儀器，只需要將地衣酚、二苯胺及鉬酸銨等與核酸樣品反應，再通過分光光度計測定光吸收值即可定量核酸。但此法準確度差、靈敏度低、干擾物 多、操作繁瑣，在現今的研究中已較少采用。比如二苯胺法是利用脫氧核糖核酸中的a脫氧核

19、糖在酸性環境中變成3羥基一丫酮基戊醛與二苯胺試劑一 起加熱產生藍色化合物，在 595nm 處有最大的吸收，在每毫升含 DNA20-400 微 克范圍內，光密度與 DNA 的濃度成正比，在反應液中加入少量乙醛，可以提高 反應的靈敏度。除DNA 外，脫氧木糖、阿拉伯糖也有同樣的反應。 少采用。比如二苯胺法是利用脫氧核糖核酸中的a脫氧核糖在酸性環境中變 成3羥基一丫酮基戊醛與二苯胺試劑一起加熱產生藍色化合物，在595nm 處有最大的吸收，在每毫升含 DNA20-400 微克范圍內，光密度與 DNA 的濃度成正 比，在反應液中加入少量乙醛，可以提高反應的靈敏度。除DNA 外，脫氧木糖、阿拉伯糖也有同樣

20、的反應。1、DNA 標準曲線的制作取 8 支試管，編號，以一定的梯度依次加入不同濃度的 DNA 溶液和二苯胺試劑 試劑。加畢， 搖勻， 于60C恒溫水浴中保溫1小時，（或于沸水中煮沸15分鐘， 冷卻測0.D595nm值）。以光密度為縱坐標，DNA 含量（ug/ml ）為橫坐標，繪制 標準曲線。2、樣品的測定 取 2 支試管，各加 0.2-0.5 毫升的待測液（內含 DNA 應在標準 曲線可測范圍之內）加蒸餾水稀釋至 2 毫升，再加 4 毫升二苯胺試劑，搖勻， 其操作步驟與標準曲線的制作相同。根據測得的光密度值，從標準曲線上查出 相當該光密度 DNA 勺含量，按下式計算出樣品中 DNA 勺百分含

21、量。DNA 含量/毫升待測液二標準曲線查得值X稀釋倍數注意事項。1、二茉胺法測定 DNA 含量靈敏度不高，待測樣品中 DNA 含量低于 50mg/L 即難 以測定。乙醛可增加二苯胺法測定 DNA 的發色量，又可減少脫氧木糖和阿拉伯 糖的干擾，能顯著提高測定的靈敏度。2、樣品中含有少量 RNA 并不影響測定，但因蛋白質、多種糖類及其衍生物、芳 香醛、羥基醛等能與二苯胺反應形成有色化合物，故能干擾DNA 定理。（3）酶催化法 基于酶催化的核酸定值方法是一種相對核酸定量法。其原理是染料能 同時與酶和核酸結合，通過檢測酶的催化活性即可實現對核酸的定量。此法的 優點在于不需要通過核酸擴增，操作方便，使用

22、的儀器簡單。但該法實驗中，酶的催化活性受多方面影響，難以達到最佳狀態，會使定量結果出現偏差。（ 3）熒光染料法熒光染料法是通過檢測熒光試劑與 DNA 結合后的熒光強度變化而實現對核酸的 定量。某些熒光探針試劑本身熒光強度不大， 但與 DNA 結合后熒光強度大大增 強，如：溴化乙錠在水溶液中的熒光量子產率很低，但它與DNA 結合后，產生很強的熒光，激發波長顯著紅移；又如 Hoechst33258 是一種雙苯并咪唑熒光染 料,可高度特異地與雙鏈 DNA 非嵌入性結合，結合后其熒光率由 0.01 增至 0.6。 熒光染料法適用于樣品中 DNA 或 RNA 含量較低或含有較多雜質的樣品，絕對靈 敏度很

23、高 . 如利用 Hoechst33258 可測定納克級水平的DNA。 PicoGreen 及SYBR GreenI的檢測靈敏度較 EB 和 Hoechst33258 更高，PicoGreen 可檢測低 至0.25-0.5ng 的 DNA 羊品。前已有許多商品化核酸定量熒光染料，如Invitrogen 公司用于測定雙鏈 DNA 的PicoGreen、用于測定單鏈 DNA 的 OliGreen 及用于測定 RNA 含量的 RiboGreen 等。含這些染料的核酸定量試劑盒被認為是目前對微量核酸定量較準確的方 法。 與紫外分光光度法相比，熒光染料法的應用尚不廣泛它存在以下缺陷：（ 1）某些熒光染料（

24、如 EB 等）具有極強的毒性和致誘變性； （2）熒光分析對 環境因素極為敏感，易受溫度、光度、酸度、溶解氧及污染物等干擾； （3）該 法需制作標準曲線，操作較復雜； （ 4）需專業的定量試劑盒，價格昂貴； （ 5） 精確定量需依賴已知濃度的標準物質，而目前缺乏經過精確定值的標準物質，且少數現今采用標準物質（入 DNA 的定量方法為紫外分光光度法，這就產生潛 在的偏差并使測量結果無法溯源到國際單位制。在水溶液中的熒光量子產率很低，但它與 DNA 結合后，產生很強的熒光，激發 波長顯著紅移；又如 Hoechst33258 是一種雙苯并咪唑熒光染料，可高度特異地 與雙鏈 DNA非嵌入性結合，結合后其

25、熒光率由 0.01 增至 0.6。熒光染料法適用于樣品中 DNA 或 RNA 含量較低或含有較多雜質的樣品，絕對靈 敏度很高 . 如利用 Hoechst33258 可測定納克級水平的 DNA。 PicoGreen 及 SYBR GreenI的檢測靈敏度較 EB 和 Hoechst33258 更高，PicoGreen 可檢測低 至 0.25-0.5ng 的DNA 樣品。目前已有許多商品化核酸定量熒光染料，如 Invitrogen 公司用于測定雙鏈 DNA 的PicoGreen、用于測定單鏈 DNA 勺 OliGreen 及用于測定 RNA 含量的 RiboGreen 等。含這些染料的核酸定量試劑

26、盒被認為是目前對微量核酸定量較準確的方 法。與紫外分光光度法相比，熒光染料法的應用尚不廣泛它存在以下缺陷：（ 1）某些熒光染料（如 EB 等）具有極強的毒性和致誘變性；（2）熒光分析對環境因 素極為敏感，易受溫度、光度、酸度、溶解氧及污染物等干擾；（ 3）該法需制作標準曲線，操作較復雜； （ 4）需專業的定量試劑盒，價格昂貴； （5）精確定量需依賴已知濃度的標準物質，而目前缺乏經過精確定值的標準物質，且少數 現今采用標準物質（入 DNA 的定量方法為紫外分光光度法，這就產生潛在的偏 差并使測量結果無法溯源到國際單位制。（4）雜交定量法雜交定量法主要包括： Southern 雜交、 Northe

27、rn 雜交、基因芯片、支鏈信號放大技術及 Rnase 保護技術。Southern 雜交特異性強，但操作復雜，靈敏度低。與 Southern 雜交類似的是用 于檢測 RNA 的 Northern 雜交技術，可用于基因表達量的比較研究。生物芯片是 一種高通量的雜交定量技術。 該技術以核酸雜交為基礎， 將短的寡核苷酸或 cDNA 序列高密度地固定在固相支持物的表面，然后加入已標記的目的序列進行雜交， 之后檢測熒光信號。由于熒光信號的強度與目標分子的數目成比例，從而實現 核酸定量檢測。支鏈信號放大技術采用了一種人工合成的、結構如同樹枝的DNA 信號放大探針分支鏈 DNA 其優點是：（1）只需將釋放的核

28、酸變性，樣品處理簡單；（2） 不經過指數增長的擴增過程，避免了擴增產物污染及PCR 抑制因素的影響；（3）可高通量檢測病原體。但該方法成本較高，且當放大倍數低時，敏感性較差，檢測范圍窄，不適用于 RNA 的低濃度檢測。RNase 保護技術由 Zinn 于 1983 年首 次提出，此法的靈敏度高于 Northern 雜交，但成本比較高、放射性同位素有致 癌作用，且所轉錄成的 RNA 易降解，增加了實驗誤差。蛋白質濃度分析方法一、蛋白濃度的直接測定（UV 法）這種方法是在 280nm 波長，直接測試蛋白。選擇 Warburg 公式，光度計可以直 接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光

29、值轉換為樣品濃度。蛋白質測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質。從而顯得結果很不穩定。蛋白質直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白 質。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質的干擾，如 DNA 的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。 二紫外吸收法測定蛋白質含量：大多數蛋白質分子結構中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）殘基，使蛋白質在280nm 的紫外光區產生最大吸收，并且這一波長范圍內的吸收值與蛋白質濃度的成正比， 利用這一特性可定量測定蛋 白質的含量。紫外吸收法可測定 0.1-0.5mg/ml 的蛋白質溶液，此操作簡便，測定迅速，不消

30、 耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。 因此， 此法在蛋白質的制備中廣泛應用。三 雙縮脲法 （ Biuret法）雙縮脲（N H3CONHCONH3 兩 個分子脲經 180C左右加熱，放出一個分子氨 后得到的產物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuS04 形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。 凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵， 或能過一個中間碳原子相 連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應。紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度 成正比，而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。測 定范圍為 110mg 蛋白質。干擾這一測定的物質主要有：硫酸銨、Tris 緩沖液和某些氨基酸等。四.BCA 方法測定蛋白

31、質含量BCA 僉測法是 Lowry 測定法的一種改進方法。與 Lowry 方法相比，BCA 法的操作 更簡單，試劑更加穩定，幾乎沒有干擾物質的影響，靈敏度更高（微量檢測可 達到 0.5卩g/ml）,應用更加靈活。蛋白質分子中的肽鍵在堿性條件下能與 Cu2+ 絡合生成絡合物，同時將 Cu2+ 還原成Cu+。二喹啉甲酸及其鈉鹽是一種溶于水的化合物，在堿性條件下，可以和 Cu+ 結合生成深紫色的化合物，這種穩定的化合物在562nm 處具有強吸收值，并且化合物顏色的深淺與蛋白質的濃度成正比。故可用比色的方法確定蛋白質的含量。五凱氏定氮法：凱氏定氮法用于測定有機物的含氮量 , 若蛋白質的含氮量已知 時，

32、則可用此法測定樣品中蛋白質的含量。當蛋白質與濃硫酸共熱時，其中的碳、氫兩元素被氧化成二氧化碳和 水，而氮則轉變成氨，并進一步與硫酸作用生成硫酸銨。此過程通常稱為“消 化”。但是，這個反應進行得比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反 應液的沸點，并加入硫酸銅作為催化劑，以促進反應的進行。消化完成后，在 凱氏定氮儀中加入濃堿，可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借助水蒸汽 蒸餾法，將產生的氨蒸餾到一定量、一定濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨與溶液中氫離子結合，使溶液中的氫離子濃度降低，指示劑顏色改變，然后 用標準無機鹽酸滴定，直至恢復溶液中原來的氫離子濃度為止。根據所用標準 鹽酸的量可計算

33、出待測物中的總氮量。蛋白質的含氮量為 16%，即 1 克蛋白質中的氮相當于 6.25 克蛋白質，用凱氏定 氮法測出的含氮量乘以 6.25, 即得樣品中蛋白質的含量。3.預對某個基因的表達（RNA 和蛋白質水平）進行 定性和定量分析，試述可采 用的技術路線和主要實驗方法。答：通過 mRNAl 達水平的檢測： Northern blot 、real time PCR、原位雜交 等。通過蛋白表達水平的檢測：（1）定量檢測分析： western bloting（2）蛋白質功能分析：免疫熒光技術、酵母雙雜交、ChIP、熒光共振能量轉移等。可采用的技術路線和主要實驗方法有：（1）mRN 表達水平的檢測No

34、rthern Blot:基本步驟：蛋白質樣品的制備SDS-PAGES行分離蛋白質轉膜特異抗體是一種基于 RNA-DNA 雜交原理建立的一種 RNA 分析技術。將 RNA 變性及電泳分 離后，轉移到固相支持物上，用雜交反應來鑒定其中特定 mRNA子的含量及其 大小。基本步驟：完整 mRNA 勺分離根據 RNA 的大小通過瓊脂糖凝膠電泳對 RNA 進 行分離將 RNA 轉移到固相支持物（尼龍膜）上，在轉移的過程中，要保持 RNA 在凝膠中的相對分布將 RNA 固定在支持物上（UV 交聯）固相 RNA 與探針分 子（DNA或 RNA 雜交除去非特異性結合到固相支持物上的探針分子對特異 性結合的探針分子的圖像進行檢測、捕獲和分析。real time PCR又稱實時定量熒光 PCR 是指在 PCF