1、實驗二 酶聯(lián)免疫吸附測定BSA抗體效價 1.目的要求(1)學(xué)習(xí)酶聯(lián)免疫吸附測定的根本原理。 (2)掌握酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)，抗體的效價測定及酶聯(lián)免疫測定儀的運(yùn)用。 2.2.根本原理根本原理免疫酶技術(shù)免疫酶技術(shù): :酶標(biāo)酶標(biāo)Ab/Ag,Ab/Ag,酶結(jié)合物的酶在免疫反響后，酶結(jié)合物的酶在免疫反響后，作用于厎物后顯色，根據(jù)顏色的有無和深淺，定量測定作用于厎物后顯色，根據(jù)顏色的有無和深淺，定量測定Ab/AgAb/Ag。免疫反響：一次或數(shù)次免疫反響：一次或數(shù)次 具具Ag,AbAg,Ab特異的免疫學(xué)反響特異的免疫學(xué)反響酶促反響：只進(jìn)展一次酶促反響：只進(jìn)展一次 顯示出生物放大作用，靈敏度顯示出生物放大作用

2、，靈敏度ng,pgng,pg 60年代初期，Averameas & Ram等建立了免疫酶技術(shù)(immunoenzymatic techniques) 利用特殊的交聯(lián)劑研制出辣根過氧化物酶-人血潔白蛋白及酸性磷酸酯酶-抗體，統(tǒng)稱為酶標(biāo)志物或酶結(jié)合物，用于抗原或抗體的示蹤、定位或定量測定酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay簡稱為Elisa)-是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatic techniques)的根底上開展起來的一種新型的免疫測定技術(shù)。本法兼有靈敏度高和特異性強(qiáng)兩方面的優(yōu)點(diǎn)。1974年 Voller等用聚苯乙烯微量反響板作為免

3、疫吸附劑吸附抗體(抗原)，再與相應(yīng)的酶標(biāo)志物結(jié)合操作更方便，易反復(fù)靈敏度可高達(dá)ng10-9g至pg(10-12g)，(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)免疫標(biāo)志技術(shù)免疫標(biāo)志技術(shù)運(yùn)用各種液相和固相免疫分析方法，對體液中的半抗原、抗原或抗體進(jìn)展定性和定量測定標(biāo)志抗體或抗原熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學(xué)(或生物)發(fā)光劑鏡檢察看或進(jìn)展自動化測定熒光顯微鏡，射線丈量儀，酶標(biāo)檢測儀，電子顯微鏡和發(fā)光免疫測定儀等直接在細(xì)胞、亞細(xì)胞、超微構(gòu)造及分子程度上,對抗原抗體反響進(jìn)展定性和定位研討酶-性能穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)易得、底物無色、產(chǎn)物顯色，便于檢測常用的酶:堿性磷酸酯酶

4、、辣根過氧化物酶(horserad peroxidase簡稱HRP)、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等。酶標(biāo)技術(shù)酶標(biāo)技術(shù)戊二醛法， 過碘酸氧化法將酶與Ab交聯(lián)在一同Ag-Ab-抗Ab-HRPTMB+H2O2產(chǎn)物黃色，OD450)+H2O圖一直接型圖一直接型Elisa 圖二間接型圖二間接型Elisa圖三圖三 雙抗體夾心型雙抗體夾心型ELISA圖四圖四 固相抗體競爭型固相抗體競爭型ELISA未知抗原量未知抗原量=A1-A2每次反響后都要反復(fù)洗滌？保證反響的定量反響防止重疊反響，引起非特異景象。Partially purified, inactivated HIV antigens antigens pr

5、e-coated onto an ELISA platePatient serum which contains antibodies. If the patient is HIV+, then this serum will contain antibodies to HIV, and those antibodies will bind to the HIV antigens on the plate. Anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme. This is the second antibody, and it binds to h

6、uman antibodies. substrate which changes color when cleaved by the enzyme attached to the second antibody.HIV (human immunodeficiency virus) detectionpositivenegativePositive Control Negative Control Patient A Patient B Patient C Assay Control 1.689 0.153 O.055 0.412 1.999 0.123 Protein protein inte

7、raction-ELISA1. Direct elisa different epitopeCoat with prey proteinIncubate with bait protein Pimary Ab anti bait protein -2petitive elisa same epitopeCoat with bait prIncubate with primary antibody anti bait pr and various concentration prey protein4. 4. 操作方法操作方法4.1 4.1 包被特異性抗原包被特異性抗原: :固體抗原固體抗原(

8、(如蛋白質(zhì)如蛋白質(zhì)) )用包被液稀釋至用包被液稀釋至10Og/ml10Og/ml，每凹孔加，每凹孔加100L100L，加蓋置，加蓋置44過夜過夜(37 2h)(37 2h)【已完成】【已完成】 次日傾去凹孔內(nèi)液體，用滴管取洗滌液在每孔中加滿次日傾去凹孔內(nèi)液體，用滴管取洗滌液在每孔中加滿稀釋稀釋/ /洗滌液洗滌洗滌液洗滌3 3次，初次洗滌靜置次，初次洗滌靜置2min2min后傾去，后兩次后傾去，后兩次靜置靜置1min1min。將反響板扣放在濾紙上，以除凈液體。將反響板扣放在濾紙上，以除凈液體。4.2 4.2 封鎖封鎖: : 每孔中加滿封鎖液約每孔中加滿封鎖液約300ul300ul多，加蓋或用封多

9、，加蓋或用封口膜封板，置口膜封板，置3737恒溫箱恒溫箱60min60min，傾去孔內(nèi)液體，按上法洗，傾去孔內(nèi)液體，按上法洗滌滌3 3次。次。4.3 4.3 加待測血清加待測血清( (內(nèi)含抗體內(nèi)含抗體) )、陰性血、陰性血清清( (無抗體無抗體) )及稀釋液及稀釋液(PBS/Tween):(PBS/Tween):待測血清按倍比法用稀釋液稀釋待測血清按倍比法用稀釋液稀釋(1:100(1:100、1:2001:200等等) )，陰性血清也稀釋，陰性血清也稀釋成成1:1001:100，取不同稀釋度的待測血清，取不同稀釋度的待測血清，陰性血清及稀釋液陰性血清及稀釋液(PBS/Tween)(PBS/Tw

10、een)各各1OOL1OOL加至相應(yīng)的凹孔中，加蓋或封加至相應(yīng)的凹孔中，加蓋或封板，置板，置3737恒溫箱恒溫箱1h1h，使抗體與固相，使抗體與固相抗原進(jìn)展特異性結(jié)合，反復(fù)洗滌抗原進(jìn)展特異性結(jié)合，反復(fù)洗滌3 3次。次。12345678PBS/Tween1:100陰性血清1:1,0001:5,0001:10,0001:50,0001:100,0001:500,000陽性血清4.4 4.4 加酶標(biāo)抗體加酶標(biāo)抗體: :參與參與HRP-HRP-抗體抗體( (抗抗體，本實驗中曾經(jīng)根聽闡明書抗抗體，本實驗中曾經(jīng)根聽闡明書稀釋一千倍稀釋一千倍) )，每孔加，每孔加l00Ll00L，封板后置，封板后置3737

11、溫育溫育lhlh，按上法至，按上法至少洗滌少洗滌5 5次，最后用蒸餾水洗滌次，最后用蒸餾水洗滌2 2次，扣在濾紙上吸干水分。次，扣在濾紙上吸干水分。4.5 4.5 顯色顯色: : 首先按每首先按每10mLOPD10mLOPD運(yùn)用液參與運(yùn)用液參與0.15mLH2O20.15mLH2O2處置。每孔參處置。每孔參與與OPDOPD運(yùn)用液運(yùn)用液1OOuL1OOuL、反響板置室溫暗處、反響板置室溫暗處5 530min30min。當(dāng)顯示明顯。當(dāng)顯示明顯黃色時應(yīng)及時終止反響。黃色時應(yīng)及時終止反響。4.6 4.6 終止反響終止反響: :每孔參與每孔參與10OL 2mol/L H2SO410OL 2mol/L H

12、2SO4。由黃色變?yōu)槌壬?。由黃色變?yōu)槌壬?。穩(wěn)定穩(wěn)定3 35min5min即可比色測定。即可比色測定。4.7 4.7 檢測檢測: : 用酶聯(lián)免疫測定儀，以用酶聯(lián)免疫測定儀，以PBS/TweenPBS/Tween孔為對照、測波長為孔為對照、測波長為49Onm49Onm時各孔光吸收時各孔光吸收A A。計算陽性血清與陰性血清計算陽性血清與陰性血清A A值之比值之比(Positive/negative(Positive/negative，P/N)P/N)，當(dāng)，當(dāng)P/N2.1P/N2.1時為陽性，時為陽性，P/N2.1P/N2.1而而1.51.5為可疑，為可疑，P/N1.5P/N1.5為陰性。為陰性。用目

13、測法那么以較陰性對照深色的最高稀釋度作為抗體效價。用目測法那么以較陰性對照深色的最高稀釋度作為抗體效價。用用“表示，超越規(guī)定吸收值表示，超越規(guī)定吸收值0.20.20.40.4的標(biāo)本均屬陽性。的標(biāo)本均屬陽性。 本卷須知本卷須知 (1) (1)聚苯乙烯微量反響板應(yīng)選擇高質(zhì)量、非特異性吸附小聚苯乙烯微量反響板應(yīng)選擇高質(zhì)量、非特異性吸附小的產(chǎn)品。包被物應(yīng)具有較高的純度，其濃度普通在的產(chǎn)品。包被物應(yīng)具有較高的純度，其濃度普通在1 1100g100g之間，在偏堿條件下易吸附于反響板的凹孔中，之間，在偏堿條件下易吸附于反響板的凹孔中，44放置過夜放置過夜較理想，假設(shè)暫時不用，可參與終濃度為較理想，假設(shè)暫時不

14、用，可參與終濃度為0.02% NaN30.02% NaN3，44儲儲存，也可傾去包被液，枯燥后置硅膠枯燥器中，室溫存放存，也可傾去包被液，枯燥后置硅膠枯燥器中，室溫存放3 3個個月以上不影響測定效果。月以上不影響測定效果。 (2) (2)反響各步均應(yīng)充分洗滌，以除去殘留物，減少非特異反響各步均應(yīng)充分洗滌，以除去殘留物，減少非特異性吸附。為使結(jié)果反復(fù)應(yīng)固定洗滌次數(shù)及放置時間，切忌相互性吸附。為使結(jié)果反復(fù)應(yīng)固定洗滌次數(shù)及放置時間，切忌相互污染。污染。 (3) (3)為使顯色反響便于比較，顯色后置室溫暗處的時間應(yīng)為使顯色反響便于比較，顯色后置室溫暗處的時間應(yīng)一致，終止反響一致，終止反響3 35min

15、5min后應(yīng)立刻比色。必要時可設(shè)陽性對照，后應(yīng)立刻比色。必要時可設(shè)陽性對照，以固定顯色及終止時間。以固定顯色及終止時間。 (4) (4)待測抗體或抗原與酶標(biāo)抗體應(yīng)具有一樣的免疫特異性，待測抗體或抗原與酶標(biāo)抗體應(yīng)具有一樣的免疫特異性，否那么無法結(jié)合。否那么無法結(jié)合。自動酶標(biāo)儀自動酶標(biāo)儀Elx800UVElx800UV運(yùn)用程序運(yùn)用程序1 1 開機(jī)，進(jìn)展開機(jī)，進(jìn)展System self-testSystem self-test2 2 按按“DEFINEDEFINE鍵，進(jìn)入鍵，進(jìn)入“SELECT ASSAY NUMBERSELECT ASSAY NUMBER， 用用“NUMERICNUMERIC或或“

16、OPTIONOPTION鍵輸入測試號注：鍵輸入測試號注：assay 01 assay 01 為為quick readquick read，最大測試號為，最大測試號為5555；按；按“ENTERENTER鍵修正測試鍵修正測試的的“NAMENAME；再按；再按“ENTERENTER鍵進(jìn)入以下菜單：鍵進(jìn)入以下菜單：按按“METHODMETHOD鍵選擇測試的波長類型鍵選擇測試的波長類型SingleSingle或或DualDual、波長大小波長大小(340(340、405405、450450、490490或或630nm)630nm)、微孔板類型、微孔板類型(96(96孔、孔、4848孔或孔或2424孔孔) )。按按“MAPMAP鍵選擇閱讀方式鍵選擇閱讀方式(Auto(Auto或或Manual) Manual) 、閱讀方向、閱讀方向DownDown或或AcrossAcross、反復(fù)方向、反復(fù)方向DownDown或或AcrossAcross、閱讀起、閱讀起始位置輸入編號、空白始位置輸入編號、空白MapMapAirAir、FullFull、ConstConst、ColumnColumn、P-DownP-Down、P-AcrossP-Acr