1、八味中藥對綿羊卵巢顆粒細胞的增殖與保護作用趙生軍1，貢繼尚1,郭憲2,馬友記3，張勇1,趙興緒1（1.甘肅農業大學動物醫學院,甘肅蘭州，730070;2.中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州，730000；3.甘肅農業大學動物科學技術學院，甘肅蘭州，730070）摘要 本試驗研究了八味不同性味歸經補虛中藥對綿羊卵巢顆粒細胞增殖影響，檢測了氯丙嗪、H2O2對卵巢顆粒細胞抑制及凋亡基因表達的影響，以及八味中藥保護氯丙嗪、H2O2致gc細胞的損傷作用，最后探討了補虛藥對生殖細胞增殖損傷保護機制。將0、1×10-3、1×10-2、1g/L中藥水醇提取物分別加入培養基，采用M

2、TT法檢測細胞增殖狀況；（0、0.1、10、15、100 um/l）氯丙嗪、（1×103、2.5×102、2×102、1.5×102、1×102、1×101um/l）H2O2至損傷gc細胞,用MTT檢測細胞增值情況，以半定量PCR、RealtimePCR檢測Bax、Bcl-2表達水平；分別以篩選的濃度加入培養基培養gc細胞，2h后分別加入氯丙嗪、H2O2.24h后MTT檢測細胞增殖水平。結果，七味藥與對照組比較差異顯著（P<0.05）,熟地黃組差異不顯著（P>0.05）；氯丙嗪IC50為1.1×10-4mol/L

3、，有濃度組對卵巢顆粒細胞作用極顯著（P0.01），H2O2 IC50為5.5×10-4mol/L，150umol/L1 000 umol/L作用極顯著(P0.01)，隨氯丙嗪、H2O2濃度增大，凋亡基因表達量增大；八味中藥部分濃度對氯丙嗪、H2O2致損傷保護作用顯著（P<0.01）或極顯著（P<0.01）。關鍵詞：中藥；顆粒細胞；增殖；細胞凋亡；保護作用Effect of eight kind of traditonal chinese medicine on proliferation and protective of sheep granulosa cellsZHA

4、O Sheng-jun1,Gong Ji-shang1,GUO Xian2,Ma you-ji3,Zhang Yong1,ZHAO Xing-xu1（1.College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University LanZhou 730070 ,china;2.Lanzhou Institute Of Husbandry And Gharmaceutical Science Of Caas,730000, china;3. College of Animal Science and Technology, Gansu Agricu

5、ltural University, LanZhou 730070, china）Abstract Studies of flavor to eight different tonic herbs on sheep granule cell proliferation,and explore chlorpromazine, H2O2 on proliferation and apoptosis of granulosa cell gene express- ion ,We studied eight medicine inhibit demage of cell by chlorpromazi

6、ne and H2O2,discussion tonic for germ cell proliferation and damage protection mechanisms.The 0,1×10-3,1×10-2,1g / L Herbal Extracts were added to the culture medium, the cell proliferation was measured by MTT assay conditions; (0,0.1,10,15,100 um / l) chlorpromazine, (1×103 , 2.5

7、5;102,2×102,1.5×102,1×102, 1×101um / l) H2O2 toxicity gc cells, cell proliferation by MTT assay, the semi-quantitative PCR, RealtimePCR detect Bax, Bcl-2 expression levels; were added to the culture at a concentration of screening gc-based cell culture were added after 2h chlorpr

8、omazine, H2O2.24h level cell prolifera -tion after the MTT assay. As a result, the seven drugs compared with control group were signify- cantly different (P <0.05), Rehmannia group difference was not significant (P> 0.05); chlorpro- mazine IC50 is 1.1×10-4mol / L, the concentration of cel

9、ls have a significant effect on the particle (P <0.01), H2O2IC50 is 5.5×10-4mol / L, 150umol / L 1 000 umol / L effect was significant (P < 0.01), with chlorpromazine, H2O2concentration increases, increasing the amount of apoptotic gene expression ; part of the concentration of eight herb

10、s on chlorpromazine, H2O2-induced injury was significantly (P <0.01) or highly significant (P <0.01).Key words: TCM ;Granulosa cells; proliferation; Apoptosis ;protective顆粒細胞對卵母細胞的生長、成熟分裂起重要調控作用，進而影響卵泡的啟動、發育、成熟及閉鎖的全過程1。卵母細胞、卵泡的生長狀況及發育潛能影響著動物受精率、胚胎質量、妊娠結局，并影響IVF等人類輔助生殖技術的成功率2,因此抑制顆粒細胞生長，促進顆粒細胞凋

11、亡最終有可能會導致動物不孕，或流產，所以促進顆粒細胞的增殖對治療動物不孕或流產，有重大意義。中藥在民族繁衍和治病、保健方面發揮不可替代的作用3，相比西藥，中藥副作用小，傷害小，尤其在保健康復方面。促進顆粒細胞增殖的中藥方劑主要以補腎為治療大法，輔以調理沖任，滋陰調肝，活血養血等法擬定合方4。氯丙嗪是一種經典的治療神經疾病的藥物，用于麻醉動物和治療疾病，也用于育肥，效果顯著。其拮抗中樞神經系統多巴胺受體和a-腎上腺素受體，還可拮抗外周-腎上腺素受體直接抑制嘔吐中樞延腦催吐化學敏感區的多巴胺受體，并調控體溫調節中樞。但有研究指出女性病人用氯丙嗪后，血清催乳素( PRL) 顯著升高5, 6，進而引起

12、閉經、乳房增大、溢乳、性欲減退、不育癥等，中醫治療常以調補肝腎，益氣補血類藥物7。 以往研究表明顆粒細胞凋亡與氧化應激密切相關，ROS（活性氧）能夠通過以線粒體途徑和受體途徑導致顆粒細胞凋亡8。最終導致卵巢機能異常是由于卵泡閉，氧化應激導致顆粒細胞凋亡，推動卵母細胞衰老凋亡等原因9。從而引起排卵障礙，生殖功能異常，常以補腎調經疏肝作為治療方劑10治療生殖系統氧化損傷。本實驗選用調補肝腎常用的8種單味中藥，通過體外實驗研究了離體環境下其對卵巢顆粒細胞的增殖影響，以及對氯丙嗪、H2O2分別致卵巢顆粒細胞損傷的保護作用，為分析各種單味藥對卵巢顆粒細胞增殖、保護作用提供基礎數據。1 材料與方法1.1

13、材料和儀器 DMEM培養基（Gibco）、MTT(Sigma)、血清（四季青）、DMSO (Sigma)、96細胞培養板 (Costar) 中藥采購于蘭州黃河藥材市場（經中獸醫實驗室教授鑒定）、天根公司熒光定量（FP202-01）、PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time) TaKaRa、takara公司RNAiso Plus、引物合成由生工完成。旋轉蒸發儀（RE-52AA）、微孔振蕩器(QB-9001)、磁力攪拌器(79-1)、酶標儀(Multiskan FC thermo)1.2 細胞準備卵巢采自蘭州市小西湖屠宰場，四小時內運回實驗室。吸出卵泡

14、液離心收集細胞培養，條件：37，5%CO2，傳代，凍存。1.3中藥提取 補氣藥（黃芪、刺五加）；補血藥（熟地、龍眼肉）；滋陰藥（枸杞子、女貞子）；補陽藥（蛤蚧、菟絲子）。中藥100g加1L，震蕩，先文火后大火煎煮兩次。合并煎液，過濾。在旋轉蒸發儀上濃縮至 100mL，使其最終濃度大約為 1g/mL。高壓滅菌后4保存11。用時再以0.22um孔濾紙過濾。1.4 中藥對綿羊卵巢顆粒細胞增殖影響 綿羊卵巢顆粒細胞培養、傳代純化，培養至對數期，臺酚藍染色計數，存活率在90%以上，稀釋成1×106個/mL的細胞懸液，96孔板每孔接種100L細胞懸液，分別設置空白對照組（不加細胞和中藥）、對照組

15、（不加中藥）、實驗組，每組5個重復孔。待貼細胞壁，融合率達到80%以后，棄去培養液，加入稀釋好的中藥（1、1×10-1、1×10-2、1×10-3g/L），每孔100ul。24h后棄上清液，加入MTT（5mg/ml、20ul），培養4h后加150ulDMSO,微孔震蕩器震蕩混勻，酶標儀測OD570nm值。1.5 H2O2和氯丙嗪最佳損傷濃度篩選 選用存活率達到80%以上的貼細胞，棄去培養液，加入H2O2，參考范建東、文金隆的研究方法12,13終濃度梯度設置為1×10-61×10-1mol/L,每孔100uL,設6重復孔;參考鄔靜等人的研究方法1

16、4，設立濃度范圍，氯丙嗪(終濃度梯度1×10-9mol/L1×10-4mol/L)，每孔100uL，6重復孔。并設置空白對照，24h后棄上清液加入MTT（5mg/ml、20ul），4h后加入150ulDMSO，微孔震蕩混勻，用酶標儀測OD570nm值，用Excel做曲線或利用公式計算IC50。實驗重復兩次。在IC50基礎上由低到高，氯丙嗪設置5個濃度， H2O2設置6個濃度，利用MTT法檢測，方法同上。1.6 綿羊卵巢顆粒細胞凋亡相關基因半定量PCR、Realtime PCR檢測用低、中、高濃度氯丙嗪至損傷細胞，并設空白對照組（不加氯丙嗪）。用RNAiso Plus提取RN

17、A。電泳檢測質量，Nanodrop檢測濃度。將不同組別細胞RNA用DEPC水稀釋統一濃度。用PrimeScript RT Master Mix反轉錄成cDNA。以GADPH作為內參基因，用熒光定量PCR檢測基因Bax、Bcl-2在氯丙嗪致損傷綿羊卵巢顆粒細胞后相對表達量。GAPDH基因（XM_005911895），Bax基因（NM_173894.1）、Bcl-2 (NM_001166486.1)引物如表1，半定量PCR采用25ul體系：cDNA1ul、Forward primer 1ul(10uM)、Reverse primer 1ul(10uM)、Taq Plus PCR MasterMix

18、 12.5ul、ddH2O 9.5ul。半定量PCR程序：945min，9430S,5530s，721min,35循環，725min。Realtime PCR采用10ul體系，cDNA模板0.6ul,ddH2O 4ul，Forward primer 0.2ul(10uM)，Reverse primer 0.2ul(10uM), RealMaster Mix(SYBR Green)5ul。程序為95.0for 0:30，95.0 for 0:05，55 for 0:30 Plate Read， GOTO 2, 40 more times， Melt Curve 65 to 95 : Increm

19、ent 0.5for 0:05。RT-PCR、Realtime PCR產物用1%瓊脂糖凝電泳30min。半定量RT-PCR結果用灰度分析軟件分析差異，realtime PCR結果用內參基因GADPHCt推算目的基因mRNA相對表達量。表1熒光定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences used in Real-time PCR引物名稱序列（5'-3'）PCR產物長度/bpPrimerPrimers sequencesSize of PCR productsGAPDHF:CCACGAGAAGTATAACAACACCR：TCCCTCCACGATGCCAAA112

20、BaxF: GACATTGGACTTCCTTCGR: AGCCACAAAGATGGTCAC118Bcl-2F: GATGACCGAGTACCTGAACCGR: GACAGCCAGGAGAAATCAAACA1201.7 中藥對H2O2和氯丙嗪致綿羊卵巢顆粒細胞損傷保護細胞接種如前。待貼細胞壁，融合率達到80%以后，加入中藥(終濃度1×10-1g/L、1×10-2g/L、1×10-3g/L),2h后加入損傷藥物H2O2終濃度為200um/L,氯丙嗪終濃度為20um/L。24h后棄上清液，加入MTT檢測（方法如上）。實驗重復多次。1.8 統計學分析 數據采用珋±

21、;S及采用SPSS19軟件進行統計學處理，多組間比較采用單因素方差分析。2結果2.1 八味補益粗提取物對卵巢綿羊卵巢顆粒細胞增殖影響表2示，蛤蚧（1×10-1g/L）、龍眼肉（1×10-1 g/L、1×10-2g/L）、刺五加(1×10-2g/L)、黃芪(1×10-2g/L)作用顯著（P0.05）。蛤蚧（1g/L、1×10-3g/L）、菟絲子（1×10-2 g/L、1×10-3g/L）、女貞子（1g/L、1×10-1g/L、1×10-2g/L、1×10-3g/L）、枸杞子（1×

22、;10-2g/L、1×10-3g/L）、黃芪（1×10-3g/L）作用極顯著（P0.01）。表2 八味中藥粗提物對綿羊卵巢顆粒細胞細胞增殖影響（±s）Table2 The proliferative effect of eight kinds of traditional Chinese medicine on ovrarian granulosa cells in sheep （±s）濃度（g/l）±S (A570nm)n123467n58150.85±0.07c0.64±0.05a0.77±0.07a0.86&

23、#177;0.06a0.85±0.07a0.73±0.03a60.78±0.02 c0.55±0.03a0.150.72±0.02b0.61±0.06a0.77±0.13a0.93±0.05 b0.88±0.08a0.97±0.14a60.90±0.02 c0.64±0.03a0.0150.51±0.09 a1.04±0.05 c0.82±0.24a0.93±0.06 b1.09±0.07 c1.07±0.06 b6

24、0.82±0.05 c0.66±0.04 b0.00150.83±0.06c1.09±0.08 c0.69±0.08a0.83±0.09a1.13±0.07 c0.86±0.07a60.78±0.04 c0.71±0.04 c050.49±0.09a0.49±0.09a0.49±0.09a0.65±0.11a0.71±0.14a0.72±0.14a60.56±0.04a0.56±0.04a空白50.19±0

25、.030.19±0.030.19±0.030.22±0.010.22±0.010.22±0.0160.26±0.020.26±0.02與對照組相比，a：P0.05，b：P0.05，c：P0.01；1：蛤蚧，2:菟絲子，3：熟地，4：龍眼肉，5：女貞子，6：枸杞子，7：刺五加，8：黃芪。Compared with the control group, a: P> 0.05, b: P <0.05, c: P <0.01;1: Gecko, 2: Dodder, 3: foxglove, 4: longan,

26、5: Ligustrum, 6: medlar, 7: Acanthopanax, 8: Astragalus2.2 氯丙嗪、H2O2染毒濃度篩選經計算得出，氯丙嗪作用綿羊綿羊卵巢顆粒細胞的IC50為1.1×10-4mol/L,由低到高設置的所有濃度組對綿羊卵巢顆粒細胞作用極顯著（P0.01）（表3）H2O2的IC50為5.5×10-4mol/L，設置的6個濃度組中，100umol/L作用顯著(P0.05),150umol/L1 000 umol/L作用極顯著(P0.01)（表4）。實驗選擇氯丙嗪染毒濃度為10umol/L，H2O2染毒濃度為100umol/L。表3 不同濃

27、度氯丙嗪對細胞損傷Table3 different concentrations of chlorpromazine on cell injury濃度梯度 umol/Ln±S (A570nm)050.243 000±0.002 20180.150.189 920±0.002 1329 c 150.186 000±0.002 2018 c1050.170 060±0.009 0088 c1550.168 600±0.004 2857 c10050.150 720±0.011 7673 c與對照組相比，a：P0.05，b：P0.

28、05，c：P0.01Compared with the control group, a: P> 0.05, b: P <0.05, c: P <0.01表4 不同濃度H2O2對細胞損傷Table 4 Different concentrations of H2O2 on cell damage濃度梯度 umol/Ln±S (A570nm)050.461 460±0.041 53181050.351 200±0.044 322910050.296 825±0.062 4216 b15050.265 750±0.044 8200

29、 c20050.265 700±0.013 5913 c 25050.222 260±0.061 7992 c 1 00050.182 040±0.006 9020 c與對照組相比，a：P0.05，b：P0.05，c：P0.01Compared with the control group, a: P> 0.05, b: P <0.05, c: P <0.012.3 半定量PCR、 Realtime PCR檢測氯丙嗪、H2O2對凋亡基因mRNA表達量的影響1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR產物，結果如圖1，隨氯丙嗪濃度由高到低（100-1），如圖

30、2，隨H2O2濃度由高到低，Bax、Bcl-2基因電泳條帶由強到弱，GADPH電泳條帶保持不變。圖1 半定量PCR檢測氯丙嗪影響凋亡基因表達水平Fig1. RT-PCR detection of apoptotic gene expression levels濃度：由高到低為100umol/L、10umol/L、1umol/l、0umol/L。Concentration: high to low 100umol/L、10umol/L、1umol/L、0umol/L.圖2半定量PCR檢測H2O2影響凋亡基因表達水平Fig2. RT-PCR detection of apoptotic gene

31、expression levels濃度：由高到低為1000umol/L、100umol/L、10umol/L、0umol/L。Concentration: high to low 1000umol/L、100umol/L、10umol/L、0umol/L.Realtime PCR檢測不同濃度氯丙嗪作用于綿羊卵巢顆粒細胞凋亡基因相對表達水平，結果顯示1 umol/L、10 umol/L、100 umol/L組Bax mRNA相對表達量與對照組（0 umol/L）比較，差異極顯著（P<0.01）。1 umol/L組Bcl-2 mRNA相對表達量與對照組比較，差異不顯著。10 umol/L、1

32、00 umol/L組Bcl-2 mRNA相對表達量與對照組比較，差異極顯著（P<0.01），如圖3。H2O2作用細胞后，Realtime PCR檢測。Bax mRNA相對表達量與對照組比較，10 umol/L差異顯著（P<0.05）、100 umol/L、1000 umol/L組差異極顯著（P<0.01）。Bcl-2 mRNA相對表達量與對照組比較，10 umol/L差異顯著（P<0.05）、100 umol/L、1000 umol/L組差異極顯著（P<0.01），如圖4。圖3 Bax、Bcl-2mRNA在不同濃度氯丙嗪損傷后差異性表達Fig3.Bax、Bcl-2

33、mRNA expression after effect of different concentrations of chlorpromazinea:P<0.05 b:P<0.01 圖4 Bax、Bcl-2mRNA在不同濃度H2O2損傷后差異性表達Fig4.Bax、Bcl-2mRNA expression after effect of different concentrations of H2O2 a:P<0.05 b:P<0.012.4、八味補益藥對氯丙嗪誘導損傷的保護作用八味藥對氯丙嗪致卵巢顆粒細胞的損傷有保護作用，菟絲子(1×10-3 g/L 1&

34、#215;10-1g/L)、熟地(1×10-1g/L)、龍眼肉(1×10-2g/L）、枸杞子(1×10-1g/L)、刺五加(1×10-3 g/L、1×10-1g/L)、黃芪(1×10-2g/L）保護作用顯著（P0.05）。蛤蚧(1×10-2 g/L、1×10-1g/L）、龍眼肉(1×10-3 g/L)、女貞子(1×10-3 g/L 1×10-1g/L)、枸杞子(1×10-3、1×10-2g/L)、刺五加(1×10-2g/L）、黃芪(1×10-1g

35、/L)保護性極顯著(P0.01)（表5）。表5 八味藥對氯丙嗪致細胞損傷的影響Table5 Eight Chinese medicine induced cell injury of chlorpromazine濃度(g/L)±S (A570nm)n12345678040.20±0.050.20±0.050.20±0.050.20±0.050.16±0.010.16±0.010.16±0.010.16±0.010.00140.35±0.03a0.41±0.04b0.24±0.

36、03a0.49±0.05c0.30±0.03c0.26±0.03c0.25±0.01b0.21±0.01a0.0140.44±0.05c0.35±0.05b0.34±0.02a0.37±0.07b0.28±0.02c0.25±0.01c0.30±0.04c0.23±0.01b0.140.53±0.06c0.36±0.05b0.38±0.08b0.27±0.01a0.25±0.01c0.23±0.02b0.2

37、6±0.03b0.26±0.03c與對照組相比，a：P0.05，b：P0.05，c：P0.01；1：蛤蚧，2:菟絲子，3：熟地，4：龍眼肉，5：女貞子，6：枸杞子，7：刺五加，8：黃芪。Compared with the control group, a: P> 0.05, b: P <0.05, c: P <0.01;1: Gecko, 2: Dodder, 3: foxglove, 4: longan, 5: Ligustrum, 6: medlar, 7: Acanthopanax, 8: Astragalus 2.5、八味補益藥對H2O2誘導損傷的

38、保護作用蛤蚧 (1×10-3 g/L、1×10-2g/L)、熟地 (1×10-3 g/L、1×10-1g/L)、龍眼肉(1×10-1g/L)、女貞子(1×10-3g/L)、枸杞子(1×10-3g/L、1×10-2g/L)、刺五加(1×10-1g/L)、黃芪(1×10-1g/L)保護作用顯著（P0.05）。蛤蚧(0.1g/L)、菟絲子(1×10-31×10-1g/L)、熟地 (1×10-2 g/L )、龍眼肉 (1×10-3 g/L、1×10-2

39、g/L)、女貞子(1×10-2 g/L、1×10-1 g/L)、刺五加(1×10-3 g/L、1×10-2 g/L) 、黃芪(1×10-3 g/L)保護作用極顯著(P0.01)（表6）。表6 八味中藥粗提物對細胞H2O2損傷保護的影響Table6 Eight Chinese medicine crude extracts of cells H2O2 damage protection濃度(g/L)±S (A570nm)n12345678040.15±0.010.15±0.010.16±0.010.15&#

40、177;0.010.16±0.020.16±0.010.16±0.020.16±0.020.00140.31±0.05b0.36±0.03c0.25±0.02b0.34±0.03c0.29±0.01b0.33±0.05b0.35±0.04c0.34±0.02c0.0140.34±0.04b0.29±0.01c0.29±0.03c0.33±0.03c0.32±0.04c0.30±0.06b0.45±0.06c

41、0.21±0.03a0.140.37±0.06c0.30±0.03c0.24±0.02b0.24±0.02b0.38±0.04c0.26±0.01a0.28±0.02b0.25±0.02b與對照組相比，a：P0.05，b：P0.05，c：P0.01；1：蛤蚧，2:菟絲子，3：熟地，4：龍眼肉，5：女貞子，6：枸杞子，7：刺五加，8：黃芪。Compared with the control group, a: P> 0.05, b: P <0.05, c: P <0.01;1: Gecko

42、, 2: Dodder, 3: foxglove, 4: longan, 5: Ligustrum, 6: medlar, 7: Acanthopanax, 8: Astragalus3 討論中醫學認為，腎主生殖，主發育，主生長。腎氣盛，天癸至，沖任通盛，則月經如期，孕育正常。腎失攝納、肝失藏血、脾失統攝會導致沖任蓄藏功能失司；肝氣疏泄、腎氣精氣不足均會導致沖任輸送功能障礙15，導致胞宮失司。黃芪和刺五加是補氣藥都歸肺、脾經；熟地和龍眼肉為補血藥，前者歸肝、腎經，后者歸心、脾經；枸杞子和女貞子為滋陰藥 歸肝、腎經；蛤蚧和菟絲子是補陽藥歸肺、腎經。都能調補肝腎，滋養胞宮。因此此類藥可補腎疏肝，促

43、進綿羊卵巢顆粒細胞增殖，符合中醫學理論。現代醫學研究中藥是從內分泌體系、免疫系統、神經系統、和卵巢局部調控等方面調節卵巢功能。本實驗選擇八味補益中藥作用于離體環境下的卵丘復合物中的綿羊卵巢顆粒細胞，排除了下丘腦-垂體-生殖腺軸系調節綿羊卵巢顆粒細胞等因素，結果發現黃芪、刺五加、枸杞、女貞子、蛤蚧、菟絲子可以促進綿羊卵巢顆粒細胞生長，說明中藥不僅通過內分泌軸系調控生殖腺生長，還通過對局部組織器官調節，從而發揮作用，補腎方劑中單味藥對生殖細胞也有促進增值作用。中醫辨證將抗精神病藥物所致高血清催乳素血癥的病因病機歸納為肝腎不足、氣血虧虛、氣滯血瘀等，治療予以滋肝養血，調補肝腎; 益氣補血，健脾和胃7

44、。氧化損傷引起的卵巢功能機能下降病因歸結主要為腎虛、肝郁等虛證。本實驗選用的8種中藥具有補腎疏肝、益氣補血等作用。現代藥理研究氯丙嗪對生殖系統損傷是主要通過引起機體高催乳素血癥，進而導致生殖系統損傷。卵泡顆粒細胞的氧化應激水平與其凋亡率密切相關8。機體在利用氧元素進行氧化反應時，氧元素自身也發生還原反應，生成氧自由基(OFR)或活性氧簇(ROS)。正常狀態機體產生少量ROS參與正常代謝，但同時，機體內存在與產生自由基相互制衡的體系，來抑制或消除自由基，如果平衡被打破，過多的自由基會損傷細胞組織，從而損害機體。氧化應激的產生就是由于自由基產生增多和抗氧化防御功能損害。活性氧如果過多積聚，對脂類和

45、細胞膜的破壞而導致細胞死亡。卵泡內微環境對顆粒細胞增殖分化、調亡起著極其重要的作用。ROS作為卵泡內微環境中成員之一，在顆粒細胞增殖分化、調亡中充當著重要角色。因此顆粒細胞調亡與氧化應激密切相關，顆粒細胞的凋亡可引起卵泡發育不良1。BCL-2家族蛋白具有調控細胞凋亡的功能。這個基因家族蛋白相互協同促進或抑制細胞凋亡，此過程是通過線粒體途徑完成的。這個途徑影響正常的胚胎發育、癌癥發生等。在細胞凋亡中，Bcl-2家族成員的構成比例是凋亡調控的關鍵因素, Bax和Bcl-2通過形成同源或異源二聚體來調節細胞凋亡:當Bax形成同源二聚體時誘導細胞凋亡16。本實驗選用氯丙嗪、H2O2作為致損傷藥物，在離

46、體環境下誘導綿羊卵巢顆粒細胞損傷，RT-PCR、Realtime PCR檢測凋亡相關基因表達量，結果顯示Bax、Bcl-2 mRNA隨著氯丙嗪、H2O2誘導濃度增大，表達量上調。說明抗精神病藥物引起的肝腎不足、氣血虧虛、氣滯血瘀，氧化劑引起的腎虛等最終可能導致卵巢功能的下降，暗示抗精神病藥物和氧化劑致卵巢功能下降亦或與凋亡基因調控生殖細胞凋亡過程有著一定的聯系。現代醫學研究，黃芪、刺五加、龍眼肉、枸杞子、女貞子、菟絲子主要成分為多糖類、黃酮類、萜類、皂苷類，以及一些氨基酸和微量元素。這些物質具有抗癌、抗衰老、抗氧化和免疫調節等功能17,18。微量元素中包括被認為中醫“腎”的物質基礎Zn，這些成

47、分具有增強免疫力、性激素樣作用、消炎作用19。本試驗從在排除其他器官組織影響因素的情況下，從分子水平闡述了氯丙嗪、H2O2對綿羊卵巢顆粒細胞凋亡基因表達的影響。從細胞水平研究了八味補益藥促進綿羊卵巢顆粒細胞與對損傷的保護作用。本研究只是做了基礎性實驗分析，后續可以做補益中藥、以及其單一成分對生殖細胞增殖、損傷保護分子機制和信號傳導方面的研究。繼而做到更具體、更系統地闡釋中藥的作用機理。參考文獻1金艷梅, 顆粒細胞對卵泡發育的影響J. 中國畜牧獸醫, 2010. 08: p. 69-72.2劉景, 李艷萍, 顆粒細胞氧化應激及凋亡對IVF-ET結局的影響J. 中南大學學報(醫學版), 2010.

48、 09: p. 990-994.3Shang, H., et al., Qi-shen-yi-qi dripping pills for the secondary prevention of myocardial infarction: a randomised clinical triaJ.l. Evid Based Complement Alternat Med, 2013. 2013: p. 738-391.4王健宏, 中藥干預對卵巢顆粒細胞分泌功能及相關因子表達影響的研究進展J. 中國中西醫結合雜志, 2013. 04: p. 573-576.5Hanssens, L., et al.,