1、心力衰竭發病中的內質網應激機制 北京大學醫學部 生理與病理生理學系 作者：劉秀華 文章號： W031666 心力衰竭是在長期、 慢性神經內分泌和細胞因子系統激活引起心肌重塑的基礎上出現的重要心血 管系統病理過程，是心血管疾病晚期共有的終末器官損害， 療效差，死亡率高，是臨床上亟待解 決的重大問題。 防止和延緩心肌重塑的發展是心力衰竭治療的根本策略。 鈣穩態失衡、 蛋白質合 成改變和細胞凋亡是影響心肌重塑發生、 發展和轉歸的重要因素， 因而也是心力衰竭進展和預后 主要的影響因素。 內質網 (endoplasmic reticulum, ER) 是調控細胞鈣穩態、 蛋白質合成和細胞凋 亡的重要亞細

2、胞器，還調控脂質和膽固醇合成、鈣穩態、細胞凋亡等細胞基本生命活動。內質網 通過啟動并整合細胞核、 線粒體和高爾基體等亞細胞器反應， 決定肥大心肌細胞的轉歸： 恢復自 穩態和修復損傷發揮代償作用，或損傷加重乃至死亡，以致出現心力衰竭。 ERS 常早于、并可進 一步誘導基因轉錄水平上的核反應和代謝水平上的線粒體反應。 適度的內質網應激有利于心肌細 胞代償，持續而嚴重的內質網應激則觸發內質網相關細胞凋亡，造成肥大心肌由代償轉向衰竭， 是心力衰竭發生的重要分子機制。1 心肌細胞的內質網應激反應心肌細胞的內質網系統非常發達，通常被稱為肌漿網(sacoplasmic reticulum, SR)。肌漿網，

3、心肌細胞內肌漿網沿肌原纖維排列，并通過 T 管與心肌細胞膜聯系。心肌細胞的肌漿網主要由包 繞肌絲的網狀縱形小管( longitudinal SR, L-S R )、參與形成三聯管的終末池 (Junctional SR, J- SR)和位于肌節I帶的特化非終末池(specialized non-junctional SR)三部分組成。肌漿網理化環 境改變和肌漿網過負荷等因素均可以導致未折疊 /誤折疊蛋白聚集和鈣穩態失衡等內質網功能紊 亂狀態， 即內質網應激。 其中理化性因素的改變主要是細胞營養物質如氨基酸、 葡萄糖和脂類的 剝奪和高血糖、高同型半胱氨酸血癥、缺血(氧)和毒性物質 (如重金屬 )等

4、。而肌漿網過負荷主要包括未 /誤折疊蛋白質增加和鈣濃度改變，如肌漿網內誤折疊蛋白聚集，或突變蛋白、未組裝蛋 白多肽的表達和正常蛋白質的過表達和肌漿網 Ca2+ 超載或耗竭。 內質網應激反應 (ER stress re sponse)主要包括未折疊蛋白反應(unfolded protein response ， UPR)、內質網過負荷反應 (ER overload response ， EOR)和類固醇調節級聯反應三類。其中EOR發生于過多的膜蛋白通過ER的轉運時，主要見于病毒感染產生大量病毒糖蛋白時，此時ER發岀信號活化轉錄因子NF- kB以誘導免疫與促炎反應基因如干擾素和細胞因子表達。類固醇

5、調節級聯反應主要發生于ER膜上固醇剝奪時，引起類固醇合成基因的轉錄5 。而未折疊蛋白反應是研究最為充分的一類內質網應激反應，與心力衰竭的發病密切相關。UPR 主要表現為蛋白質合成的暫停和肌漿網功能相關蛋白的上調，旨在調節肌漿網蛋白質合成穩態。1.1 UPR 時蛋白質合成暫停及其信號途徑UPR 時細胞首先岀現蛋白合成暫停，其調控發生在蛋白合成起始階段，由PERK(PKR like ER kinase)途徑介導，旨在減少未折疊蛋白/錯誤折疊蛋白在 ER沉積和聚集。PERK屬I型ER跨膜蛋白，具有感受器和效應器兩個功能域，前者位于 ER 腔面的氨基端，可以感受未折疊蛋白 /錯誤 折疊蛋白聚集信息，后

6、者位于ER膜胞漿側的羧基端，具有蛋白激酶活性，也可以由膜上寡聚化而激活7。正常狀態下，與GRP78結合的PERK以無活性復合物存在；ER內聚集未折疊蛋白或誤折疊蛋白與GRP78結合后，暴露PERK，使其寡聚化并活化，進而磷酸化真核細胞翻譯起始因 子 2(eukaryotic initiation factor 2,elF2)，從而減少蛋白合成8。eIF2 蛋白包含 a、B 和 丫等 3 個亞基，生理狀態下，eIF2 a與GTP結合募集起始子蛋氨酰(methionyl)tRNA 到40S小亞基核蛋白體上，形成活性較低的eIF2 a-小亞基核蛋白復合體，后者識別并結合mRNA,再裝配成具有蛋白質合

7、成功能的核蛋白復合體，隨后GTP被降解，形成 GDP結合型eIF2 a,后者經eIF2 B作用重新形成 GTP 結合型 eIF2 蛋白，進入下一輪核蛋白復合體組裝與啟動。內質網應激時，PERK磷酸化eIF2蛋白的第51位絲氨酸，使eIF2無法由GDP型向GTP型轉換，因此eIF2不能再 被重復利用，造成真核細胞蛋白質翻譯啟動和合成降低，新蛋白合成減少。1.2 內質網功能蛋白合成上調及其信號途徑UPR 還誘導內質網與蛋白質合成、折疊和鈣穩態調控有關的蛋白質上調，以恢復內質網功能。這些上調的蛋白質主要有：ER伴侶蛋白，如 GRP78、GRP94、內質網應激蛋白(endoplasmic reticu

8、lum protein Erp)29 和 72、鈣網蛋白 (calreticulin, CRT)、 calnexin 、氧調節蛋白 (oxtge n-regulated protein ， ORP)150 。與 ER 蛋白質加工和鈣穩態相關的酶， 如蛋白二硫鍵異構酶 (p rotein disulfide isomerase,PDI)、肌漿網 Ca2+-ATP 酶(sarco/endoplasmicreticulum Ca2 + -ATPase,SERCA)。其它ER應激相關蛋白，包括血紅素加氧酶-1(hemooxygenase-1,HO-1)、應激相關 ER 蛋白-1(stress-asso

9、ciatedendoplasmic reticulum protein 1,SERP-1)。上述三類蛋白質的上調具有促進 ER內未折疊/誤折疊蛋白質正確折疊、調節ER鈣穩態和抵抗氧化應激等作用，與終止 ERS 反應、恢復細胞功能有關 9 。UPR 時蛋白質合成上調主要由鐵反應元件 1(iron responsible element 1,Ire1) 途徑介導， Ire1 屬于I型ER跨膜蛋白，其 ER腔側的氨基端具有感受未折疊蛋白的功能域，正常狀態下與GRP78 的結合掩蓋其二聚化位點，而羧基端具有 2個功能域， 分別與絲 /蘇氨酸蛋白激酶和病毒感染 激活RNA酶(RNaseL)同源，具有蛋白

10、激酶和核酸內切酶活性。內質網內聚集的未折疊蛋白與GRP78 結合,暴露出 Ire1 的二聚化位點，活化其效應器功能域的蛋白激酶；二聚化的Ire1 發生交叉磷酸化， 激活核酸內切酶， 后者特異性剪接平時活性很低的轉錄因子 Hac1 的 mRNA, 去除其上 一段 252bp 的抑制序列， 然后在 tRNA 連接酶 Rlg 的作用下形成高活性的 Hac1 ，翻譯成 Hac1p。 Hac1p 上調靶基因的表達 ;另外 ATF4 和 ATF6 途徑也具有重要作用。2 致心肌肥大和心力衰竭因素與內質網應激 多種致心肌肥大和心力衰竭的因素，如壓力過負荷、自身免疫性心肌病、缺血缺氧、 糖尿病性心肌病、 血管

11、活性物質異常和慢性酒精中毒致心肌肥大過程中均出現內質網應激反應，提示內質網應激反應可能是影響上述因素致心肌肥大發生、發展和心力衰竭形成的機制之一。2.1 心肌缺血與內質網應激心肌缺血后重塑是心力衰竭最重要的發病學因素之一，缺血/再灌注過程中的氧化應激、缺氧、葡萄糖/營養物質匱乏、ATP耗竭及鈣超載等均可引起ER功能障礙，觸發 ERS反應。缺血可引起 ER 應激分子如 GRP78、 GRP94、 PDI 等表達上調。 培養的乳鼠心肌細胞缺氧復氧模型上證實， 缺氧復氧引起嚴重的內質網應激反應，表現為內質網應激分子鈣網蛋白和GRP78 等上調，內質網應激相關細胞凋亡途徑分子 CHOP(C/EBP h

12、omologous protein) 表達上調和 caspase-12 剪切 活化。在成年大鼠心肌梗死模型上進一步發現，缺血/再灌注誘導內質網應激分子鈣網蛋白表達明顯增多，出現內質網應激反應，其機制涉及 CaN 信號途徑。2.2 酒精攝入與內質網應激以心肌肥大和收縮功能障礙為特征的酒精性心肌病是心力衰竭的原因之一，長期酒精攝入可以造成的酒精性心肌病，乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase ，ADH )轉基因小鼠本身不岀現內質網應激分子的變化，但是該轉基因小鼠在服用酒精12周后內質網應激分子eIF2a、IRE-1a和CHOP 表達上調，與心肌肥大相關的轉錄因子 GATA4,c-j

13、un 表達和 c-jun 磷酸化上調，并岀現心肌肥大和心肌收縮功能障礙，提示酒精性心肌病發生、 發展過程中岀現內質網應激反應。2.3 心臟壓力過負荷與內質網應激小鼠主動脈縮窄(transverse aortic constriction ，TAC)后1周心臟超聲顯示心臟擴大，左室壁 增厚；此時 GRP78 和鈣網蛋白 mRNA 表達上調，免疫組化顯示心肌細胞內內質網蛋白標志序列 KDEL陽性細胞數目增加，提示岀現內質網應激反應。術后4周該小鼠岀現心力衰竭，此時心肌組織鈣網蛋白、GRP78和94蛋白上調，并岀現內質網應激相關凋亡分子CHOP蛋白上調，心肌細胞內TUNEL陽性細胞數目增加，提示壓力

14、負荷升高致心肌肥大過程中存在持續的內質網應激現象，而內質網相關 CHOP 途徑引發的細胞凋亡參與了肥大心肌轉向衰竭的過程。大鼠腹主動 脈狹窄致高血壓心肌肥大后，心肌收縮功能降低，內質網應激分子鈣網蛋白表達上調，與 Zwad lo 等發現人類心肌肥大時內質網應激分子 CRT 編碼基因明顯激活的結果一致。大鼠腹主動脈狹 窄致心肌肥大模型上證實，心臟壓力過負荷可以誘導內質網應激分子 GRP78 表達，并上調 CHO P 和內質網應激誘導的轉錄因子XBP-1 ；提示壓力過負荷可以誘導未折疊蛋白質在肌漿網聚集，擴大的肌漿網和阻塞的 T 管可能干擾細胞鈣穩態，后者損傷心肌收縮功能，受損的收縮功能又 加重壓

15、力過負荷， 持續的壓力負荷升高加重肌漿網未折疊蛋白質的聚集， 誘導細胞凋亡最終導致 擴張型心肌病和心力衰竭。2.4 血管活性物質與內質網應激反應 血管緊張素 II 在心肌肥大和心力衰竭的發生中具有重要作用，心肌局部血管緊張素 II 與心肌肥 大過程中心肌正性肌力反應和過負荷表型改變有關， 主動脈狹窄致小鼠心肌肥大模型上證實， 血 管緊張素II的I型受體拮抗劑 CS-866明顯抑制TAC術后1和4周心肌組織內質網應激分子鈣 網蛋白和 GRP78 的 mRNA 表達，并減少 TUNEL 陽性細胞數和衰竭心肌 caspase-3 活化， 阻止心 力衰竭的發生。 1 0 9mol/L 的血管緊張素 I

16、I 誘導成年大鼠心肌細胞蛋白質合成增加、心肌肥大 和細胞凋亡，并伴有可以識別內質網應激分子GRP78/94的KDEL和CHOP表達，上述變化均被 CS-866 的活性代謝物 RNH-6270 抑制。特別是 TUNEL 和 CHOP 陽性細胞共存， 提示 CHOP 介導的內質網應激凋亡途徑參與了心力衰竭的發病。 精氨酸加壓素引起 H9c2 細胞 肥大和收縮功能下降，細胞內岀現mRNA翻譯速率降低繼而上調，ER分子伴侶GRP78和GRP94 合成增加。2.5 其他 單核細胞趨化蛋白 (monocyte chemoattractant protein-1 ,MCP-1)轉基因小鼠岀現心肌肥大、間質纖

17、維化，6月齡時發展為充血性心力衰竭；基因芯片證實2、4和6月齡轉基因小鼠心肌組織ER應激相關基因表達上調，內質網應激反應相關的ER分子伴侶、蛋白質二硫鍵異構酶家族 mRNA 和蛋白表達均上調，提示內質網應激參與該轉基因小鼠 心肌肥大的發生。過表達 phospholamban 突變體造成小鼠心肌肥大為主要表現的心肌病，心肌 組織蛋白質組分析證實 8， 16 和 24 周使包括內質網應激反應和心力衰竭相關分子標志在內的593 個蛋白質差異表達，與基因芯片檢測的 mRNA 水平變化一致。3 內質網應激反應與心肌肥大和心力衰竭的發生、發展 成年心肌細胞為終末分化細胞， 一般不再具備分裂增殖能力， 心肌

18、細胞收縮相關蛋白質合成增加 是心肌細胞肥大的重要分子基礎， 而損傷因素致心肌細胞凋亡則加重心肌細胞的喪失，觸發肥大心肌由代償轉向失代償， 導致心力衰竭發生。 因此， 由內質網應激調控的蛋白質合成異常和細胞 凋亡是影響心肌細胞肥大發生、發展和轉歸的重要環節。3.1 蛋白質合成與加工異常和心力衰竭 心肌肥大需要心肌細胞蛋白質合成的增加，分泌型蛋白質如ANP 和 BNP 編碼基因的上調是臨床判斷心肌肥大和心力衰竭的分子標志 1 。而心肌細胞肌漿網是細胞內膜性 /分泌性蛋白合成的場 所，新合成的蛋白質在內質網腔內發生折疊和糖基化，質量控制機制保證只有正確折疊的蛋白質才能岀內質網， 誤折疊蛋白質滯留在內

19、質網并被降解。 心肌肥大時長期蛋白質合成增加會引起持 續內質網應激反應， 進而導致心力衰竭。 Maron 等20 證實心肌病患者心肌組織岀現不同程度的 退行性變， 其中肥大的心肌細胞內岀現肌漿網增生， 而中、 重度退行性變心肌細胞岀現廣泛的肌 原纖維溶解和肌漿網管喪失， 提示肌漿網改變與肥大心肌細胞的代償向失代償的轉化有關。內質網駐留分子均包含 Lys-Asp-Glu-Leu(KDEL) 序列，而 KDEL 受體可以協助內質網識別和回收內質 網伴侶分子， 在內質網蛋白質控中發揮作用， 表達突變 KDEL 受體的轉基因小鼠岀現擴張型心肌 病，超微結構分析顯示該基因突變小鼠心肌收縮裝置和線粒體排列

20、均正常，但是肌漿網增生， 肌漿網內觀察到疑似蛋白質聚集的電子致密物質，而野生型小鼠無此變化。 衣霉素處理正常對照組乳鼠心肌細胞顯示肌漿網區彌漫性表達BiP, 但是在 KDEL 受體突變的心肌細胞 BiP 分布不均，提示該心肌細胞易于發生內質網應激。KDEL受體突變成年心臟 BiP表達明顯增加和 CHOP聚集，提示該心臟出現細胞凋亡， 上述結果表明 KDEL 受體突變心臟出現內質網應激， 后者引起心肌病 發生 16 。廣泛存在的蛋白小體( proteasome )是蛋白質合成質控機制的關鍵成員， 30% 的新合成蛋白質 在蛋白小體內降解。 26S 蛋白小體以能量依賴形式識別并降解蛋白質， 其蛋白

21、降解的抑制通過未 折疊蛋白質反應反饋抑制新蛋白質合成，已經證實，抑制26S 蛋白小體通過 eIF2途徑抑制蛋白質合成的起始環節而導致蛋白質合成下調。壓力負荷誘導小鼠心肌肥大過程中出現蛋白小體降解途徑的上調，以 epoxomicin 抑制 26S 蛋白小體可以消除壓力負荷誘導的上述心肌肥大。小鼠主動脈狹窄4 周出現心力衰竭時， eIF2 磷酸化依賴的促凋亡蛋白 CHOP 上調、細胞凋亡增加。推測抑制蛋白小體消除壓力負 荷致心肌肥大可能是心肌細胞蛋白質合成抑制的結果，蛋白小體的抑制可能成為心肌肥大的新防治途徑， 但是由于抑制蛋白小體不僅引起蛋白質合成抑制，同時引起誤折疊蛋白質在內質網的聚集，觸發內

22、質網應激反應， 嚴重的內質網應激將導致細胞凋亡， 因此應該權衡蛋白小體抑制劑在 心肌肥大防治中應用的利弊。3.2 內質網應激相關細胞凋亡與心力衰竭心肌細胞肌漿網的另一個功能是調節細胞凋亡，缺血(氧)、熱休克、基因突變引起的蛋白質合成等因素均可以引起內質網應激，過強和持續的內質網應激可以通過CHOP、應激活化蛋白激酶和capase12 等內質網相關凋亡途徑引起細胞凋亡 3 。多種因素致心肌肥大過程中均出現內質網應 激相關細胞凋亡 ,提示內質網應激相關細胞凋亡是影響心力衰竭發生的重要因素。3.3 CHOP 凋亡途徑與心力衰竭CHOP 又稱生長停滯及 DNA 損傷誘導基因 (growth arres

23、tand DNA damage inducible gene 15 3,GADD153)。內質網應激反應時 Ire1- a和Ire1- B、ATF6及PERK的活化均可誘導 CHOP生成， CHOP通過下調Bcl2表達而促進細胞凋亡 24 oCHOP-/-細胞可抵抗內質網應激誘導的細胞凋亡， 而過表達 CHOP 促進細胞凋亡。培養的乳鼠心肌細胞和骨骼肌細胞缺氧/復氧和內質網應激誘導劑毒胡蘿卜素致內質網應激細胞模型上證實，缺氧/復氧和內質網應激誘導劑誘導上述細胞CHOP 表達上調，出現細胞凋亡；在大鼠腹主動脈結扎致高血壓心肌肥大模型上證實，心肌肥大存在CHOP 表達上調，出現細胞凋亡。長期攝入酒

24、精致乙醇脫氫酶轉基因小鼠出現CHOP 表達上調、心肌肥大和心肌收縮功能障礙。壓力負荷升高致高血壓、心肌肥大小鼠術后4 周出現心力衰竭，心肌組織內質網應激相關凋亡分子CHOP蛋白上調，心肌細胞內TUNEL陽性細胞數目增加，提示壓力負荷升高致心肌肥大過程中存在嚴重內質網應激反應，CHOP凋亡途徑激活可能參與了肥大心肌轉向衰竭的過程。 Hamada 等認為大鼠腹主動脈狹窄致持續的壓力負荷升高加重肌漿網未 折疊蛋白質的聚集，誘導細胞凋亡最終導致擴張型心肌病和心力衰竭。3.4 Caspase 12 與心肌肥大Caspase-12存在于ER膜上，只被內質網應激所活化，Caspase-12-/-小鼠及細胞在內質網應激時細胞死亡明顯較輕，ERS引起Caspase-12活化的因素包括半胱氨酸水解酶m-Calp