1、從土壤中分離和篩選產淀粉酶活性的芽抱桿菌及部分鑒定試驗一、實驗目的1、通過本實驗的學習，學習掌握從環境中分離產淀粉酶菌株以及菌株初步鑒定的方法；2、鞏固微生物分離純化.細菌生理生化鑒定，對所學習過的微生物學實驗方法進行綜合技能訓練;3、培養綜合利用微生物學、生物化學等相關知識，自行設計、實施并判斷實驗結果的能力。4根據所學知識自主設計實驗方案，在實驗方案通過審核后組織實施，最終要求獲得產淀粉酶的 菌株。二、實驗原理1、土壤中含有各種微生物，其中產淀粉酶的芽抱桿菌含量在不同土壤中含量也不同，因此實驗前 進行融1工作廠能便王壤申產淀粉II畫確創氈壇加。待實驗前取樣即可。2在只用淀粉充當碳源的選擇培

2、養基中，只有能產生淀粉酶利用淀粉的菌體能成為優勢菌種。在 淀粉選擇培養基中，產淀粉酶的菌種可以得到富集及分離。3. 80-90C溫度下殺死菌體，可使芽匏得到富集。4. 芽抱桿菌屬的共同特征是：革蘭氏陽性；接觸酶陽性；水解淀粉；VP試驗陽性；不產生呵喙； 苯甲氨酸不脫氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不產生二輕丙酮；營養體的最高生長溫度大約從259 到75C以上；最低生長溫度大約59到45-C；生長最低pH值，從一8到2左右；耐鹽范圍從低于 2%的N&C1到25%NaCl；營養明膠(22C) 7天內液化1厘米或1厘米以上。枯草芽鞄桿菌和地衣 芽抱桿菌在糖發酵試驗用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄

3、糖可產酸；作為營養生長的最低限培 養基是無維生素的，但含有葡萄糖、檸檬酸鹽和一個氨態鹽作為唯一的碳源和氮源。5. 在含有淀粉的鑒別培養基的平板上，具有產淀粉酶能力的芽鞄桿菌，水解淀粉生成小分子糊精 和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周圍出現水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈藍 色，水解圈無色。二、實驗材料1 土壤樣品2、實驗前三天在距土壤表層5-8厘米左右處填埋饅頭，實驗前一天用塑料袋在預埋處取樣 藥品3>(1)可溶性淀粉.蛋白際Nacl.配制稀碘液：原碘液：稱取碘和碘化鉀，用少量水使碘完全溶解，定容至500ml,貯存于棕色瓶中。稀碘液：吸取原碘液，加入碘化鉀用水溶解定容至500m

4、l,貯存于棕色瓶中。(2) 可溶性淀粉溶涮：稱取2. 00g可溶性淀粉于燒杯中，用少量水調成漿糊狀，邊攪拌邊緩慢加 入70ml沸水中，然后用水沖洗裝淀粉的燒杯.洗液倒入其中，攪拌加熱至完全透明，冷卻 定容至100ml o (溶液現配現用)(3)磷酸緩沖液(pH=)：稱取45. 23g磷酸氫二鈉和&07g檸檬酸，用水溶解并定容到1000ml,用pH計校正后使用(4)鹽酸溶液：c(HCL)=Lo4、培養基淀粉培養基：可溶性淀粉蛋白腺1%、牛肉膏敝瓊脂粉%(2) 發酵培養基:可溶性淀粉1浪 蛋白腺1氷%>牛肉膏(3) 葡萄糖蛋白淼培養基(VP和MR試驗用)(%):葡萄糖 蛋白淼K2HP

5、04 校正pH5.移液管、試管、噴壺6、其他設備及儀器pH三、實驗步驟1、樣本采集在預埋處釆取土樣用塑料袋裝好，不要損壞土壤的內部結構。2、目的菌株的富集 取10g 土壤加入三角瓶中，再加入90ml無菌水制成土壤混懸液。在三角瓶中加入2g的可溶 性淀粉，蛋白J® 0.625g, Nacl 0.625g,調節pH值為。在37攝氏度搖床培養箱中培養兩天，使菌 體富集且產生大量芽砲。 在85°C-90°C水浴鍋中加熱10分鐘，殺滅菌體，使芽抱得到富集。3、稀釋涂布法將菌液上清分別稀釋成10= 10*10_ 10巴分別取菌液均勻涂布在含的淀粉培養基上(一個濃度涂布兩個)，

6、在379培養箱培養2天，平板培養基表面便形成了若干分散的單菌 落。4、接種、從對照的培養基中菌落中選擇菌落周圍透明圈和菌落直徑之比值較大的菌落，進行接種，并在 培養皿上依次對菌落進行標記，接種到對應標記好的試管里(一個菌落接種兩支試管),將劃線 分離后的試管放入37 9培養箱中培養24 ho5、初篩用噴壺將盧戈氏碘液均勻噴灑在培養基上，根據淀粉遇碘變藍的原理，有明顯淀粉透明水解 圈則說明產酶活力強，藍色越深說明產酶活力越弱，進而挑選出產酶活力較高的幾株菌落。將這 幾株菌落接種到淀粉液體培養基，250r/s> 36°C振蕩培養36-48h。7. 復篩酶活力測試(1) 吸取lml上

7、述可溶性淀粉溶液于試管中，加入24ml磷酸緩沖液，搖勻后，置于60°C恒溫 水浴中預熱8mino取5ml培養好的酶液到離心管，6000r/s常溫離心5min,取lml上層清液到試 管中，搖勻5mino(2) 立即用移液器吸取lml反應液，加入到預先盛有(1)和5ml稀碘液的試管中，搖勻，并以 (1)和5ml稀碘液為空白，于660nm波長下，用比色皿迅速測定其吸光度(A)。根據吸光度査表，求得測試酶活力的濃度。(3) 計算耐高溫的淀粉酶制劑的酶活力計算：X=c*n*X樣品酶活力c測試酶樣的濃度n樣品的稀釋倍數根據酶活力定義計算的換算系數（所得結果表示至于整數）根據所得結果篩選出酶活力最

8、高的菌種。&獲得產淀粉酶芽桿菌純種：上述劃線接種后的菌落中各挑取形態特征不一致的點接于倒好的淀粉牛肉膏培養基中，一個土 樣取8個平板兩兩標記同一位置同序號標記，一平板分5個區域，點接重復兩次，在37C培養箱 中培養24ho上述點接后的平板中取出一組四個分好區域的淀粉牛肉膏培養基平板于實驗室，其他置于無菌 室。實驗室里，四個平板均加入碘液，立即觀察記錄陽性和陰性菌落所在位置，并可同時記錄透 明圈的大小。根據所記錄的陽性菌的編號，利用另一組中的營養瓊脂平板上其對應的菌落繼續劃 線接種，培養后將出現的形態特征不一致的菌落進行編號，然后挑取部分出來進行革蘭氏染色鏡 檢，若發現視野內出現形態、大

9、小、顏色一致且為桿菌的菌體，則將其對應的菌種劃線接種到新 的營養瓊脂平板上，標記，379下培養24h。否則繼續進行劃線分離，培養后再經革蘭氏染色鏡檢 直至得到純種桿菌后進行芽抱染色。篩選出芽鞄純種后進行斜面接種。革蘭氏染色涂片：屋手持菌液試管，右手持接種環，用接種環從試管培養液中取一環菌，從酒精燈外焰穿過, 于載玻片中央涂成薄層（事先在背面做好標記圓圈）即可，或先滴一小滴無菌水于載玻片中央， 用接種環從斜面上挑出少許，與載玻片上的水滴混合均勻，涂成一薄層。拔或塞試管塞時，應將試管口通過火焰略加燒灼，最后將接種環在火焰上燒灼滅菌。 干燥：涂片后在室溫下自然干燥，也可在酒精燈上略加溫，使之迅速干燥

10、 固定：常用高溫進行固定。即手持載玻片一端，標本面朝上，在燈的火焰外側快速來回移動34 次，共約34秒。要求玻片溫度不超過60C,以玻片背面觸及手背皮膚不覺過燙為宜，放置待冷 后染色。染色：（1）初染：？加草酸釵結晶紫一滴，約一分鐘，水洗。（2）媒染：？滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約一分鐘，水洗。（3）脫色：？將載玻片上的水甩凈，并襯以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現紫色時 為止，約20-30秒，立即用水沖凈酒精。（4）復染：？用番紅液染1一2分鐘，水洗。鏡檢：？干燥后，置油鏡觀察。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。8、菌種的鑒定（1）乙酰甲基甲醇試驗（VP試驗）標記試管:取裝有葡萄糖蛋白腺培養液的試管，編號。接種培養以無菌操作分別接種少量菌苔至以上相應試管中，空白對照管不接菌，置37C恒溫箱中，培養24h。 觀察記錄取出以上試管，充分振蕩加in。每管分別加入40%Na0H溶液1020滴，并加等量a-奈酚，振蕩 試管，以使空氣中的氧溶入，置37°C恒溫箱中保溫1530min后，若培養液呈紅色，記錄為試驗 陽性反應（用“十”表示）；若不呈紅色，記錄為試驗陰性反應（用表示）。（2）甲基紅實驗（MR實驗）除去吸取2ml培養液用于VP實驗，在剩余的培養液中各加2-3滴甲基紅試劑，混勻