1、常州市武進(jìn)區(qū)環(huán)境監(jiān)測(cè)站作業(yè)指導(dǎo)書文件編號(hào)： wjes/qz-0017-2003名稱：水質(zhì)細(xì)菌總數(shù)測(cè)定作業(yè)指導(dǎo)書第 1 頁(yè)共 5 頁(yè)1 水質(zhì) 細(xì)菌總數(shù)測(cè)定作業(yè)指導(dǎo)書1含義及執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)1.1含義細(xì)菌總數(shù)是指1ml 水樣在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，于37培養(yǎng) 24 小時(shí)后，所生長(zhǎng)細(xì)菌菌落的總數(shù)。1.2方法原理平板計(jì)數(shù)法是測(cè)定水中需氧菌、兼性厭氧菌和異養(yǎng)菌密度的方法。因?yàn)榧?xì)菌在水中能以單獨(dú)個(gè)體、成雙成對(duì)、鏈狀、成簇等形式存在，而且沒有任何單獨(dú)一種培養(yǎng)基或一套物理、化學(xué)條件能滿足一個(gè)水樣中所有細(xì)菌的生理要求。所以，由此法所得的菌落數(shù)可能要低于真正存在的活細(xì)菌的總數(shù)。1.3水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)表 1-1 細(xì)菌總數(shù)地下水質(zhì)

2、量分類指標(biāo)（gb/t 14848-93 ）類 別類類類類類標(biāo)準(zhǔn)值（個(gè) /ml）100 100 100 1000 1000 表 1-2 細(xì)菌總數(shù)生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（gb 5749-2006 ）類 別飲用水農(nóng)村小型集中式供水和分散式供水標(biāo)準(zhǔn)值（個(gè) /ml）100 500 2分析方法2.1方法名稱、方法來(lái)源和適用范圍方法名稱：平板計(jì)數(shù)法方法來(lái)源：水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法(第四版 )國(guó)家環(huán)保總局2002 年第五篇第二章 四方法適用范圍：此法主要作為判定飲用水、水源水、地表水等污染程度的標(biāo)志。2.2儀器高壓蒸汽滅菌器電熱干燥箱恒溫培養(yǎng)箱冰箱解剖鏡。采樣瓶、三角燒瓶、試管、平皿（直徑9cm） 、刻度吸管等器皿

3、121（ 20min）高壓常州市武進(jìn)區(qū)環(huán)境監(jiān)測(cè)站作業(yè)指導(dǎo)書文件編號(hào)： wjes/qz-0017-2003名稱：水質(zhì)細(xì)菌總數(shù)測(cè)定作業(yè)指導(dǎo)書第 2 頁(yè)共 5 頁(yè)2 蒸汽滅菌后于電熱干燥箱中烘干。2.3培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：市售營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，按說(shuō)明配制，裝于三角燒瓶中，經(jīng)121高壓蒸汽滅菌15min ，經(jīng)無(wú)菌性檢驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)菌株檢驗(yàn)后，貯存于暗處備用。2.4分析步驟2.4.1 選擇稀釋度稀釋度要選擇適宜，以期在平皿上的菌落總數(shù)介于30300 之間。大多數(shù)飲用水水樣，未經(jīng)稀釋直接接種1ml，所得的菌落總數(shù)可適于計(jì)數(shù)。2.4.2 水樣的稀釋方法將水樣用力振搖2025 次，使可能存在的細(xì)菌凝團(tuán)成分散狀。以無(wú)

4、菌操作方法吸取1ml 充分混勻的水樣，注入盛有9ml 滅菌水的試管中，混勻成 1：100 稀釋液。按同法依次稀釋成1：1000、1：10000 稀釋液（稀釋倍數(shù)按水樣污濁程度而定）。注意：吸取不同濃度的稀釋液時(shí)，必須更換吸管。2.4.3 操作方法以無(wú)菌操作方法用1ml 滅菌吸管吸取充分混勻的水樣或23 個(gè)適宜濃度的稀釋水樣 1ml，注入滅菌平皿中，傾注約15ml 已融化并冷卻到45左右的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并立即旋搖平皿，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻。每個(gè)水樣應(yīng)傾注兩個(gè)平皿。待瓊脂冷卻凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，使底面向上，置于37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。2.4.4 菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)之后，立即進(jìn)行平皿菌落計(jì)

5、數(shù)。如果計(jì)數(shù)必須暫緩進(jìn)行，平皿需存放于510冰箱內(nèi)，且不得超過24h。但是不可以使這種做法成為常規(guī)的操作方式。作平皿菌落計(jì)數(shù)時(shí)，可用解剖鏡檢查，以防遺漏，在記下各平皿的菌落數(shù)后，應(yīng)求出同稀釋度的平均菌落數(shù)。在求同稀釋度的平均數(shù)時(shí)，如果其中一個(gè)平皿有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用， 而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平皿作為該稀釋度的菌落數(shù)。若片狀菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，則可將此半皿計(jì)數(shù)后乘以2 代表全皿菌落數(shù)，然后再求該稀釋度的平均菌落數(shù)。如果由于稀釋等過程中有雜菌污染，或者對(duì)照平皿顯示出培養(yǎng)基或其他材料染有雜菌，以致平皿無(wú)法計(jì)數(shù)，則應(yīng)報(bào)告“實(shí)驗(yàn)事故”。對(duì)那些看來(lái)相似，距離相近但

6、是卻不相觸的菌落，只要它們之間的距離不小于最小菌落的直徑，便應(yīng)一一予以計(jì)數(shù)。那些緊密接觸而外觀（例如形態(tài)或顏色）相異的菌落，也應(yīng)該一一予以計(jì)數(shù)。2.4.5 計(jì)算細(xì)菌總數(shù)是以每個(gè)平皿菌落的總數(shù)或平均數(shù)（例如同一稀釋度兩個(gè)重復(fù)平皿的平均數(shù)）乘以稀釋倍數(shù)而得來(lái)的。各種不同情況的計(jì)算方法如下：常州市武進(jìn)區(qū)環(huán)境監(jiān)測(cè)站作業(yè)指導(dǎo)書文件編號(hào)： wjes/qz-0017-2003名稱：水質(zhì)細(xì)菌總數(shù)測(cè)定作業(yè)指導(dǎo)書第 3 頁(yè)共 5 頁(yè)3 首先選擇平均菌落在30300 之間者進(jìn)行計(jì)算，當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，即以該平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)報(bào)告（見表3 例 1） 。若有兩個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)均在303

7、00 之間，則應(yīng)該按二者之比值來(lái)決定。若其比值小于2 應(yīng)報(bào)告兩者的平均數(shù)，若大于 2 則報(bào)告其中較小的數(shù)值（見表 3 例 2、 例 3） 。若所有的稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋倍數(shù)最大的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告（見表3 例 4） 。若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋倍數(shù)最小的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告（見表3 例 5） 。若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30300 之間，則以最接近300 或 30 的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報(bào)告（見表3 例 6） 。表 3 稀釋度選擇及菌落總數(shù)報(bào)告方式例次不同稀釋度的平均菌落數(shù)兩個(gè)稀釋度菌落數(shù)之比菌落總數(shù)（個(gè) /ml）報(bào)告方式（個(gè) /ml

8、 ）備注10-1 10-210-31 1365 164 20 16400 16000 或 1.6104 兩位以后的數(shù)字采取四舍六入五單雙的原則取舍2 2760 295 46 1.6 37750 38000 或 3.81043 2890 271 60 2.2 27100 27000 或 2.71044 無(wú)法計(jì)數(shù)1650 513 513000 510000 或 5.11055 27 11 5 270 270 或 2.71026 無(wú)法計(jì)數(shù)305 12 30500 31000 或 3.11043質(zhì)量控制要求3.1對(duì)照控制采用無(wú)菌水作全過程對(duì)照控制，當(dāng)有明顯雜菌污染時(shí)，表明測(cè)定過程某環(huán)節(jié)無(wú)菌性失控，應(yīng)重

9、新檢驗(yàn)；每次檢驗(yàn)時(shí)，另用兩個(gè)平皿只傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并且打開平皿10min作實(shí)驗(yàn)室對(duì)照控制，當(dāng)有明顯雜菌污染時(shí)，表明測(cè)定過程實(shí)驗(yàn)環(huán)境無(wú)菌性失控，應(yīng)重新檢驗(yàn)3.2精確度同一實(shí)驗(yàn)人員所作前15 個(gè)陽(yáng)性水樣平行雙樣結(jié)果為x1i、 x2i（x1i、 x2i 0， i1， 2， , ，15） ，則精確度判斷值r27. 3。（，iiixxr21loglog）當(dāng)分析所得21loglogxxrr27. 3表示精密度已失控；否則平行雙樣的差距可以接受。3.3最佳計(jì)數(shù)量細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定無(wú)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用，為提高檢驗(yàn)分析的準(zhǔn)確性，除要盡量消除系統(tǒng)誤差、15115/ )(iirr常州市武進(jìn)區(qū)環(huán)境監(jiān)測(cè)站作業(yè)指導(dǎo)書文件編號(hào)：

10、 wjes/qz-0017-2003名稱：水質(zhì)細(xì)菌總數(shù)測(cè)定作業(yè)指導(dǎo)書第 4 頁(yè)共 5 頁(yè)4 人為誤差的影響外，還應(yīng)盡量降低隨機(jī)誤差的影響。增加計(jì)數(shù)量可減少隨機(jī)誤差的影響，考慮到工作量等因素，細(xì)菌總數(shù)測(cè)定每一平皿的最佳菌落數(shù)為30 300 個(gè)，因此， 應(yīng)盡量選取菌落數(shù)在這一范圍的平皿計(jì)數(shù)。4數(shù)據(jù)處理4.1數(shù)據(jù)審核分析結(jié)果填寫原始記錄表與樣品送檢單，應(yīng)經(jīng)科室內(nèi)部校對(duì)、審核后，方可上交。4.2數(shù)據(jù)填報(bào)菌落計(jì)數(shù)報(bào)告時(shí)， 菌落數(shù)在100 以內(nèi)按實(shí)有數(shù)據(jù)報(bào)告； 大于 100 采用二位有效數(shù)字報(bào)告，有效數(shù)字后面的數(shù)值以四舍五入方法計(jì)算，為縮短數(shù)字后面的零數(shù)可用10 的指數(shù)形式表示（如報(bào)告16，000 或 1

11、.6104） 。在報(bào)告菌落數(shù)為“無(wú)法計(jì)數(shù)”時(shí)，應(yīng)注明水樣的稀釋倍數(shù)。5樣品采集5.1 采樣瓶應(yīng)經(jīng)高壓或干熱滅菌處理后方可使用；5.2 樣品含有余氯時(shí)采樣瓶滅菌前應(yīng)加脫氯劑，即于500ml 采樣瓶中加入0.3ml10% 硫代硫酸鈉溶液；5.3 樣品含銅鋅等重金屬較高時(shí)采樣瓶滅菌前應(yīng)加螯合劑，即于500ml 采樣瓶中加入1.0ml15% 乙二胺四乙酸二鈉（edta-na2）溶液；5.4 同一地點(diǎn)同時(shí)采多瓶水樣時(shí)，細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)水樣先采；5.5 采樣時(shí)，采樣瓶不得用水樣蕩洗；5.6 采樣后，樣品應(yīng)2 小時(shí)內(nèi)檢驗(yàn)，否則，應(yīng)10以下保存且不超過6 小時(shí)。6期間核查6.1人員素質(zhì)首先要參加省上崗證理論考試，理論考試合格后方能上崗。同時(shí)站內(nèi)進(jìn)行操作技能考核、培訓(xùn)，考核合格后方能持證上崗，承但本項(xiàng)分析。按國(guó)家和省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心的要求，須要進(jìn)行五年換證的理論考試、操作技能考核。6.2儀器設(shè)備臭氧殺菌效果、高壓鍋壓力表指示、恒溫培養(yǎng)箱溫控情況每年由站質(zhì)管中心組織持證人員檢驗(yàn)、校正，玻璃量具每三年由站質(zhì)管中心組織持證人員校正。7分析環(huán)境條件控制7.1儀器設(shè)備保持實(shí)驗(yàn)室環(huán)境整潔，定期檢查，避免恒溫培養(yǎng)箱溫控失控，做好儀器設(shè)備使用和保養(yǎng)記錄。7.2無(wú)菌室定期采用消毒劑清潔無(wú)菌室，定期檢查臭氧殺菌效果，保證無(wú)菌室微生物實(shí)驗(yàn)條件的滿足