1、16SrRNA 基因序列分析法鑒定病原細菌朱飛舟1，陳利玉2，田奇3，談成3，歐陽方丹1，陳漢春1，吳正理11. 中南大學生物科學與技術學院生物化學系，長沙 410013；2. 中南大學湘雅醫學院微生物學系，長沙 410078；3. 中南大學生物科學與技術學院，長沙 410013摘要：目的 運用 16S rRNA 基因序列分析法鑒定 14 種臨床上常見的病原細菌，為該方法的 臨床應用奠定根底。方法 提取病原細菌的 DNA，采用通用引物經 PCR 擴增 16S rRNA 基因片 段，再測序擴增片段。將測序結果用 Blastn 在線軟件在 Nucleotide 數據庫中進行同源性比對，根據序列同源

2、性鑒定病原細菌。結果 12 種病原細菌可以鑒定到“種，2 種病原細菌可以鑒定到“屬。結論 16S rRNA 基因序列分析是一種有用的病原細菌鑒定方法。關鍵詞：病原細菌；16S rRNA；基因序列分析中圖分類號：R3Identification of Pathogenic Microorganisms by Sequencing 16S rRNA GeneZhu Feizhou1, Chen Liyu2, Tian Qi3, Tan Cheng3, OuYang Fangdan1,Chen Hanchun1, Wu Zhengli1(1. Department of Biochemistry,

3、School of Biological Science and Technology, Central SouthUniversity, ChangSha 410013;2. Department of Microbiology, Xiangya School of Medicine, Central South University, ChangSha 410078;3. School of Biological Science and Technology, Central South University, ChangSha 410013)Abstract: Objective To

4、identify 14 kinds of common pathogenic microorganisms by sequencing 16S rRNA gene for establishing the basis of clinical use of this method. Methods DNA samples of the pathogenic microorganisms were extracted. The 16S rRNA genes were amplified by PCR and sequenced with the common primers. The sequen

5、ces of the 16S rRNA genes were aligned by using online software Blastn in Nucleotide database. The pathogenic microorganisms were identified according to the homology of their 16S rRNA genes. Results 12 kinds of pathogenic microorganisms could be identified to species. 2 kinds of pathogenic microorg

6、anisms could be identified to genus. Conclusions 16S rRNA gene sequence analysis has been demonstrated a useful method for identifying pathogenic microorganisms.Keywords:16S rRNA; pathogenic microorganism; gene sequence analysis病原細菌的鑒定是臨床細菌學的一項根本工作。鑒定病原細菌有多種方法，如形態學觀 察、血清分型、生化分析、遺傳學分析等。遺傳學分析法有基因序列分析、

7、分子標記檢測、 核酸分子雜交等1。遺傳學分析的候選基因主要有 16S rRNA、23S rRNA、16-23S rRNA 間 隔區、gyrBDNA 促旋酶 B、rpoBRNA 聚合酶的亞基、sod超氧化物歧化酶基 因等1,2,3，應用最多的是 16S rRNA 基因。分子標記法包括 RAPDrandom amplified polymorphic DNA, 隨機擴增多態性 DNA , AFLP amplified fragment lengt h polymorphis m, 擴增片段長度多 態性, REP-PCR REP 全稱為 repetitive extragenic palindrom

8、ics, 重復基因外回文序列1,4。目前，臨床上通常采用表型觀察和生化分析鑒定病原細菌，較少采用遺傳學分析法。本基金工程：高等學校博士學科點專項科研基金資助新教師基金課題工程編號 20210162120028；湖南省 科技方案工程編號 2021SK3192作者簡介：朱飛舟，1974-，男，講師，主要研究方向：基因結構與功能通信聯系人：吳正理，1978-，男，講師，主要研究方向：宏基因組學. E-mail: hundred_chenyahoo 研究運用 16S rRNA 基因序列分析法鑒定了 14 種臨床上常見的病原細菌，旨在為臨床病原 細菌的遺傳學鑒定奠定根底。1 材料與方法1.1 病原細菌病

9、原細菌由中南大學根底醫學院微生物學系提供，分別為大腸埃希菌、傷寒沙門菌、志 賀菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌、變形桿菌、粘質沙雷菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿 菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和白色葡萄球菌。1.2 細菌基因組 DNA 提取 CTAB(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromi de, 十六烷基三甲基溴化銨)法提 取細菌基因組 DNA。接種菌株于 LB 液體培養基，37震蕩培養過夜。次日，取 1.5ml 新鮮 培養物，12,000g 離心 2min。去上清液，參加 567 l TE 緩沖液，震蕩懸浮細菌。然后，加 入 30l 1

10、0%SDS 和 15l 20mg/ml 蛋白酶 K格蘭氏陽性菌需先參加 20l 10mg/ml 溶菌酶，37反響 15min 后再參加蛋白酶 K，混勻，于 37溫育 1hr，其間屢次顛倒混勻。如果溶 液變澄清，說明細菌裂解完全。隨后，參加 100l 5mole/L NaCl 和 80l CTAB/NaCl 溶液5g CTAB 溶于 100ml 0.5mole/L 的 NaCl 溶液中，加熱至 65使之溶解，室溫保存，混勻，65溫育 10min。可見白色的蛋白質沉淀。然后參加等體積的酚/氯仿/異戊醇25:24:1， 混勻至乳濁狀。12,000g 離心 5min，轉上清液至一潔凈試管，參加與上清液

11、等體積的異丙醇， 輕輕混勻，直至產生絮狀 DNA 沉淀。12,000g 離心 5min，去上清液，沉淀用 1ml 的 70%乙 醇洗滌。離心，棄乙醇，在潔凈工作臺中枯燥沉淀。將沉淀溶于 50l TE 緩沖液，參加 1l RNase A(10mg/ml)，4儲存備用。1.2.2 丙酮快速提取法。取新鮮細菌懸液，參加等體積丙酮，置于沸水浴中煮沸 10min。 然后 12,000g 離心 2min，其上清液即為細菌 DNA 溶液，可以用作 PCR 擴增的模板。1.3 PCR 擴增 16S rRNA 片段選取通用引物 27F 和 1492R 作為 16S rRNA 基因片段的擴增引物。正向引物 27F

12、 的序列 為 5´-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3´，反向引物 1492R 的序列為 5´-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3´。建立 50l 的 PCR 反響體系：DNA 模板 1l，ddH2O l，10*PCR 緩沖液(+KCl) 5l，25mmole/L MgCl2 2l，10mmole/L dNTP 1l，20mole/L 27F 引物 1l，20mole/L 1492R 引物 1l，5U/l Taq DNA 聚合酶酶 l，覆蓋 50l 礦物油防止蒸發。采 用 Biometra Personal

13、Cycler PCR 儀擴增，PCR 反響程序為 94變性 5min 后于 94變性45sec、55退火 45sec、72延伸 90sec，30 個循環后于 72延伸 7min。4儲存備用。1.4 PCR 產物序列分析擴增的細菌 16S rRNA 基因的 PCR 產物具有高度特異性，測序前無需純化即可直接測 序。測序引物為 27F 和 1492R 序列，正、反測序北京諾賽基因組研究中心完成。1.5 序列同源性比對和進化樹構建取各病原細菌 16S rRNA 基因片段測序圖的中間局部 1380bp 片段序列進行同源性分析。1.5.1 將序列導入美國 NCBI 網站 :/ ncbi.nlm.nih.

14、gov的 Blastn 在線軟件，選 擇 Nucleotide Collection(nr/nt)數據庫，運行 Blastn 程序，獲取 16S rRNA 基因序列同源性最高的菌群。1.5.2 將序列導入 ClustalX(1.86) 軟件，在菜單中選擇 Alignment-Do CompleteAlignment，即得 14 種細菌的 16S rRNA 基因序列同源性比對圖和進化樹。2 結果2.1 16S rRNA 基因序列分析法鑒定病原細菌分別采用 CTAB 法和丙酮快速提取法提取細菌基因組 DNA。比擬分析說明，CTAB 法 和丙酮快速提取法提取的 DNA 均可用作 PCR 擴增的模板，

15、但丙酮快速提取法快速、簡單、 易行，更適用于臨床應用。27F 和 1492R 引物的通用性好，可以擴增 14 種細菌的 16S rRNA 基因片段，擴增片段大小約為 1450bp；擴增的特異性很好，未見非特異性擴增產物，PCR 產物無需純化即可用于序列分析圖 1。圖 1 病原細菌的 16S rRNA 基因 PCR 產物瓊脂糖凝膠電泳Fig. 1 Agarose gel electroforesis of PCR products from 16S rRNA gene of pathogenic microorganisms注：M:DNA 分子量標志；1:無模板空白對照；2:大腸埃希菌；3:傷寒

16、沙門菌；4:志賀菌；5:陰溝腸桿菌；6:肺炎克雷伯菌；7:變形桿菌；8:粘質沙雷菌；9:銅綠假單胞菌；10:鮑曼不動桿菌；11:枯草芽孢 桿菌；12:蠟樣芽孢桿菌；13:金黃色葡萄球菌；14:表皮葡萄球菌；15:白色葡萄球菌。以 14 種細菌的 16S rRNA 基因 PCR 擴增片段為模板，采用引物 27F 和 1492R 序列進行 正、反向測序，其測序圖譜的反響峰值高，信號強，無套峰結果未顯示。取測序所得的14 種病原細菌 16S rRNA 基因 1380bp 片段的序列，導入美國 NCBI 網站的 Blastn 在線軟件 進行序列比對，取序列同源性最高的細菌作為鑒定結果。例如，取測序所得

17、的金黃色葡萄球 菌 16S rRNA 基因 1380bp 片段序列，經在線軟件 Blastn 中比對后，選擇 Taxonomy Reports， 即可得到具有同源序列的細菌，以同源性從高到低的順序從上向下排列；結果中 Max score(最大分值)表示序列同源性的大小，分值越大，表示同源性越高；E 值表示統計學顯著 性，E 值越小，表示顯著性越大5。圖 2 顯示金黃色葡萄球菌 16S rRNA 基因序列比對分析 結果。圖 2 金黃色葡萄球菌 16S rRNA 基因序列比對分析Fig. 2 Alignments of 16S rRNA genes from Staphyloccocus aure

18、us Rosenbach表 1 所示結果說明，16S rRNA 基因序列分析法鑒定的結果與菌種保存單位提供的結果 根本一致。兩者相比，14 種菌在“屬的層次上完全一致；8 種菌在“種的層次上一致， 如大腸埃希菌、腸道沙門菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌、粘質沙雷菌、鮑曼不動桿菌、 銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌；3 種菌保存單位只鑒定到“屬，但 16S rRNA 序列分析 法可鑒定到“種，如福氏志賀菌、奇異變形桿菌、科氏葡萄球菌；2 種菌 16S rRNA 序列 分析法只可鑒定到“屬，但菌種保存單位鑒定到了“種，如枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿 菌；有 1 種菌兩者鑒定結果“屬名一致，“種名不同，菌種保存

19、單位鑒定的結果是表皮 葡萄球菌，而 16S rRNA 基因序列分析法鑒定提示為溶血性葡萄球菌。菌種保存單位表 1 16S rRNA 基因序列分析法鑒定結果16S rRNA 基因序列分析法鑒定結果兩者結果比擬提供的菌名 英文名 中文名大腸埃希菌 Escherichia coli 大腸埃希菌 “種一致 傷寒沙門菌 Salmonella enterica 腸道沙門菌 “種一致志賀菌 Shigella flexneri 福氏志賀菌 “屬相同，16S rRNA 基因序列分析法可鑒定到“種陰溝腸桿菌 Enterobacter cloacae 陰溝腸桿菌 “種一致肺炎克雷伯菌 Klebsiellapneum

20、oniae肺炎克雷伯菌 “種一致變形桿菌 Proteus mirabilis 奇異變形桿菌 “屬相同，16S rRNA 基 因序列分析法可鑒定到“種粘質沙雷菌 Serratiamar cescens銅綠假單胞菌 Pseudomonasaeruginosa鮑曼不動桿菌 Acinetobacterbaumannii粘質沙雷菌 “種一致銅綠假單胞菌 “種一致 鮑曼不動桿菌 “種一致枯草芽孢桿菌 Bacillus 芽孢桿菌屬 “屬相同蠟樣芽孢桿菌 Bacillus 芽孢桿菌屬 “屬相同金黃色葡萄球菌 Staphylococcusaureus表皮葡萄球菌 Staphylococcushominis白色葡

21、萄球菌 Staphylococcuscohnii金黃色葡萄球菌 “種一致溶血性葡萄球菌 “屬相同，“種不同 科氏葡萄球菌 “屬相同，16S rRNA 基因序列分析法可鑒定到“種2.2 14 種病原細菌 16S rRNA 基因序列同源性和進化關系分析14 種病原細菌 16S rRNA 基因片段序列比對結果說明，16S rRNA 基因中存在保守區和 多態區，保守區如 225-276bp、429-450bp 等區段，多態區如 363-396bp 區段圖 3。利用 保守區設計通用引物，可以擴增多種細菌的 16S rRNA 基因片段；利用多態區序列可以區分 不同“種細菌。另外，16S rRNA 基因序列

22、分析可以判別不同“種細菌間的親緣關系， 在細菌的進化和分類分析中具有廣泛應用前景圖 4。圖 3 14 種病原細菌 16S rRNA 基因序列比對Fig. 3 Alignments of 16S rRNA genes from 14 pathogenic microorganisms圖 4 基于 16S rRNA 基因序列的 14 種病原細菌進化關系Fig. 4 Evolution relationships of 14 pathogenic microorganisms based on the 16S rRNA gene sequences3 討論與結論可以通過表現型和基因型兩條途徑鑒定細菌

23、。很明顯，基因型比表現型更加穩定。目前 臨床上應用的生化分析法屬于表現型鑒定，該法依賴于細菌基因的特定表達產物。但基因表 達水平受環境因素的影響，故其鑒定過程存在較多不確定因素。比擬而言，基因型的鑒定那么 更加穩定，受環境因素影響較小6,7。因此，本文建立的 16S rRNA 基因序列分析法較生化分析法更加穩定，且重復性更好。另外，生化分析法只能鑒定特定病原細菌，而 16S rRNA 基 因序列分析法可以鑒定幾乎所有的病原細菌。因此，16S rRNA 基因序列分析法具有穩定性 好、特異性強、費用低、效率高等特點，具有潛在的臨床實用價值。參考文獻 (References)1 徐建國，梁國棟，邢來

24、君，等譯.美P.R.默里，E.J.巴倫，M.A.法勒，等著.臨床微生物學手冊M. 北 京，科學出版社，2005. 3353522 Hoffmann M, Brown E W, Feng P C, et al. PCR-based method for targeting 16S-23S rRNA intergenic spacer regions among Vibrio speciesJ. BMC Microbiology, 2021, 10:903 楊玲玲，職曉陽，李文均. 擬諾卡氏菌 16S rRNA，gyrB，sod 和 rpoB 基因的系統發育分析J. Phylogeneticanalysis of Nocardiopsis species based on 16S rRNA, gyrB, sod and rpoB gene sequencesJ. 微生物學報,2007, 47(6):9