1、概述概述一、基本概念一、基本概念 DNADNA重組重組 （in vitro DNA recombination technologyin vitro DNA recombination technology ）：）： 基因克隆基因克隆（gene cloninggene cloning） 或分子克隆或分子克隆（molecularmolecular cloning cloning）技術。）技術。 基因工程基因工程（gene engineeringgene engineering） ：第1頁/共261頁二、基因工程產生的基礎二、基因工程產生的基礎1 1 理論上三大發現理論上三大發現 4040年代發現

2、了生物的遺傳物質年代發現了生物的遺傳物質-DNA-DNA 5050年代闡明了生物遺傳物質的分子機制，年代闡明了生物遺傳物質的分子機制，Watson and CrickWatson and Crick提出了提出了DNADNA雙雙螺旋結構模型。螺旋結構模型。 6060年代確定了遺傳信息的傳遞方式年代確定了遺傳信息的傳遞方式- -中心法則中心法則 第2頁/共261頁 2 2 技術上三大發明技術上三大發明 限制性內切酶和連接酶的發現限制性內切酶和連接酶的發現 載體（載體（VectorVector）的發現：載體相當于運送重組）的發現：載體相當于運送重組DNADNA分子到宿主細胞的車子分子到宿主細胞的車子

3、 逆轉錄酶的發現，打破了中心法則，使真核基因的制備成為可能逆轉錄酶的發現，打破了中心法則，使真核基因的制備成為可能 第3頁/共261頁 一、重組一、重組DNADNA技術的基本過程技術的基本過程 基因工程要素基因工程要素 目的基因的制備和分離目的基因的制備和分離 DNADNA重組體的構建重組體的構建 DNADNA重組體擴增和表達重組體擴增和表達 重組體篩選和鑒定重組體篩選和鑒定 外源基因的表達外源基因的表達 表達產物的分離純化、鑒定表達產物的分離純化、鑒定第4頁/共261頁載體酶切目的基因重組體導入受體細胞擴增、抽提和鑒定表達表達產物的分離鑒定大量生產基因工程的基本流程第5頁/共261頁二、基因

4、工程的分類基因工程的分類 真核基因工程真核基因工程 原核基因工程原核基因工程第6頁/共261頁三、三、1.1.研究基因的結構功能和活動的規律。研究基因的結構功能和活動的規律。2.2.為疾病的防治、診斷、預后及發病機理的研究開辟新途徑。為疾病的防治、診斷、預后及發病機理的研究開辟新途徑。3.3.研究細胞分化和胚胎發育的本質問題。研究細胞分化和胚胎發育的本質問題。4.4.基因治療。基因治療。5.5.促進基礎理論的研究。促進基礎理論的研究。第7頁/共261頁四、四、基因工程技術制備藥物的優勢基因工程技術制備藥物的優勢 制備很珍貴但利用傳統方法難以制備的藥制備很珍貴但利用傳統方法難以制備的藥 可以提供

5、足夠數量的生理活性物質，以便對其生理、可以提供足夠數量的生理活性物質，以便對其生理、生化和結構進行深入研究，生化和結構進行深入研究， 可以發現和挖掘更多的內源生理活性物質。可以發現和挖掘更多的內源生理活性物質。 內源生理活性物質在作為藥物使用時存在的不足之內源生理活性物質在作為藥物使用時存在的不足之處，可通過基因工程和蛋白工程進行改造和克服。處，可通過基因工程和蛋白工程進行改造和克服。 利用基因工程技術可獲得新型化合物，擴大藥物篩利用基因工程技術可獲得新型化合物，擴大藥物篩選來源。選來源。第8頁/共261頁第三節第三節 基因工程的酶和載體基因工程的酶和載體 第一部分：工具酶第一部分：工具酶 限

6、制性內切酶和甲基化酶限制性內切酶和甲基化酶 DNADNA連接酶連接酶 DNADNA多聚酶多聚酶 第二部分：基因工程的載體第二部分：基因工程的載體 原核細胞（大腸桿菌）的常用載體：原核細胞（大腸桿菌）的常用載體： 真核細胞載體真核細胞載體： 第9頁/共261頁 第一部分：工具酶第一部分：工具酶一一 限制性內切酶和甲基化酶限制性內切酶和甲基化酶 限制性內切酶的發現限制性內切酶的發現 限制性內切酶的生理功能限制性內切酶的生理功能 限制性內切酶的分類和命名限制性內切酶的分類和命名 識別和切割位點及切割片段的末端識別和切割位點及切割片段的末端 型酶的分類型酶的分類 反應系統反應系統 限制性內切酶的應用限

7、制性內切酶的應用 第10頁/共261頁1 1限制性內切酶（限制性內切酶（restriction endonuclease) restriction endonuclease) 定義定義 發現發現 ArberArber的假說的假說 限制修飾酶限制修飾酶第11頁/共261頁第12頁/共261頁2 2 限制性內切酶的生理功能限制性內切酶的生理功能 構成了細胞抵御外源入侵構成了細胞抵御外源入侵DNADNA的防御機制的防御機制 提供了細菌種屬間進行交叉繁殖的屏障，但又允許外源提供了細菌種屬間進行交叉繁殖的屏障，但又允許外源DNADNA有某些遺漏有某些遺漏第13頁/共261頁3 3 限制性內切酶的分類和命

8、名限制性內切酶的分類和命名 三種類型：三種類型：型、型、型、型、型型 命名：命名：EcoREcoRE: Escherichia E: Escherichia 屬屬Co:coli Co:coli 種種R: RY13R: RY13株株：該菌株第一個被發現的核酸內切酶：該菌株第一個被發現的核酸內切酶第14頁/共261頁4 4 型限制性核酸內切酶：型限制性核酸內切酶：識別與切割識別與切割DNADNA鏈上同一個特異性核苷酸順序，產生特異性的鏈上同一個特異性核苷酸順序，產生特異性的DNADNA片斷。片斷。1 1）基本特性）基本特性 識別與切割識別與切割DNADNA鏈上同一個特異性核苷酸順序鏈上同一個特異性

9、核苷酸順序 切割片段的末端切割片段的末端 對對dsDNAdsDNA的兩條鏈同時切割，產生的兩條鏈同時切割，產生3 3種不同的切口：種不同的切口： 第15頁/共261頁識別序列：第16頁/共261頁 切割末端： 5GTTAAG-33CAATTG-55GTT-33CAA-55AAG-33-TTG-5平末端5CTGCAG-33GACGTC-55CTGCA-33-G5G-33ACGTC-55-粘末端Hpa IPst I5GAATCC-33CTTAAG-55-G-33CTTAA-55AATCC-33G-5EcoR I3粘末端第17頁/共261頁5 5 型酶的分類型酶的分類A:Isochizomers(A

10、:Isochizomers(異源同工酶異源同工酶) )，來源不同，識別順，來源不同，識別順序相同的酶序相同的酶。 SmaSma Xma Xma 它們識別順序相同，切割位點不同，產生平頭或粘性它們識別順序相同，切割位點不同，產生平頭或粘性末端末端。C C C G G GG G G C C C C C C G G GG G G C C C第18頁/共261頁B:同尾酶（isocaudarner） 5-GATC-33-CTAG-5 5-GGATCC-33-CCTAGG-5 5-AGATCT-33-TCTAGA-5 Mbo I BamH I Bgl II 來源及識別序列不相同，切割后產生相同的粘性片段

11、第19頁/共261頁第20頁/共261頁6 6 反應系統反應系統組成：酶及活性緩沖液（組成：酶及活性緩沖液（buffer)buffer)：影響酶反應的因素：影響酶反應的因素： DNADNA的純度的純度 DNADNA甲基化程度甲基化程度 DNADNA分子結構：線性分子結構：線性環狀環狀 反應溫度反應溫度 反應系統組成反應系統組成 第21頁/共261頁7 7 限制性內切酶的應用限制性內切酶的應用 DNADNA重組重組 組建新質粒組建新質粒 組建組建DNADNA物理圖譜物理圖譜 DNADNA的分子雜交的分子雜交 制備制備DNADNA的放射性探針的放射性探針 DNADNA的序列分析的序列分析 DNAD

12、NA甲基化堿基的識別與切割。甲基化堿基的識別與切割。 第22頁/共261頁二、DNADNA連接酶連接酶 功能功能: :是指催化兩條分別具有是指催化兩條分別具有5 5- -磷酰基末端與磷酰基末端與3 3- -羥基末端的羥基末端的DNADNA單鏈連接形成磷酸二酯單鏈連接形成磷酸二酯鍵的酶鍵的酶 常用的連接酶：常用的連接酶： T4 DNAT4 DNA連接酶連接酶 大腸桿菌大腸桿菌DNADNA連接酶連接酶第23頁/共261頁 1 T4 DNA ligase 1 T4 DNA ligase 來自T4感染的Ecoli，MR:68Kd，輔助因子：Mg2+ and ATP 1 1）反應特性 5 5ACG-OH

13、 P-AATTCGT-3ACG-OH P-AATTCGT-3 TGCTTAA-P + OH-GCA-5 TGCTTAA-P + OH-GCA-5 ATP Mg2+ ATP Mg2+ 5 5ACGAATTCGT3ACGAATTCGT3 3 3TGCAAGTTCA5TGCAAGTTCA5第24頁/共261頁 2 2）2020ul ul 反應體系反應體系: : 10 10* *buffer 2ul(66 mM Tris-HCl, pH7.5, buffer 2ul(66 mM Tris-HCl, pH7.5, 6.6 mM MgCl 6.6 mM MgCl2 2, 10 mM MDTT,0.4 ,

14、10 mM MDTT,0.4 mM ATP) mM ATP) 底物底物 10pM10pM 連接酶：連接酶： 0.01-0.1unit0.01-0.1unit 3 3）反應溫度及時間：）反應溫度及時間： 1616，過夜，過夜4 4）用途：粘端）用途：粘端DNADNA或切口間連接，也連接平末端或切口間連接，也連接平末端第25頁/共261頁2 2大腸桿菌大腸桿菌DNADNA連接酶連接酶 來自來自Ecoli, Mr:7.4kDa, Ecoli, Mr:7.4kDa, 輔助因子輔助因子NAD+NAD+。作用：封閉雙螺旋作用：封閉雙螺旋DNADNA上具有上具有5 5磷酸酰基和磷酸酰基和3 3羥基的缺口（羥

15、基的缺口（nicknick）形成磷酸二酯鍵。無法）形成磷酸二酯鍵。無法封閉裂口（封閉裂口（gapgap）。因此可連接粘性末端的）。因此可連接粘性末端的DNADNA片斷，不能連接平末端的片斷，不能連接平末端的DNADNA片斷。片斷。用途：粘端用途：粘端DNADNA或切口間連接或切口間連接第26頁/共261頁三 DNADNA多聚酶多聚酶 聚合酶聚合酶 Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 逆轉錄酶逆轉錄酶(reverse transcriptase) (reverse transcriptase) 末端脫氧核苷酸轉移酶（末端脫氧核苷酸轉移酶（Terminal Deoxynucleotidayl

16、 TransferaseTerminal Deoxynucleotidayl Transferase）第27頁/共261頁( (一）聚合酶聚合酶 功能：以功能：以DNA or RNADNA or RNA為模板，催化為模板，催化DNA and RNADNA and RNA的的體外合成。體外合成。 以以DNADNA為模板為模板 不耐熱聚合酶不耐熱聚合酶 耐熱聚合酶耐熱聚合酶 大腸桿菌大腸桿菌DNADNA聚合酶聚合酶 Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 KlenowKlenow大片段酶大片段酶 pfupfu聚合酶聚合酶 T4(T7)T4(T7)噬菌體噬菌體DNADNA聚合酶聚合酶 以以RNAR

17、NA為模板為模板 反轉錄酶反轉錄酶第28頁/共261頁共共 性：性： 需要引物和模板需要引物和模板 不能起始新的不能起始新的DNADNA連，催化連，催化dNTPdNTP連續加到雙鏈連續加到雙鏈DNADNA分子引物鏈分子引物鏈3 3OHOH端；端； 不發生從引物模板上解離不發生從引物模板上解離第29頁/共261頁1 1 大腸桿菌大腸桿菌DNADNA聚合酶聚合酶（E.coli PolymeraseE.coli Polymerase） 來自來自E.coliE.coli細胞。細胞。Mr:109kDMr:109kD。 由單一多肽組成。由單一多肽組成。沿沿DNADNA模板催化核苷酸聚合，是一多功能酶，有三

18、模板催化核苷酸聚合，是一多功能酶，有三種活性種活性： 5-3外切酶N3-5外切酶聚合酶C小片段大片段（Klenow片段）第30頁/共261頁1 1）5 533聚合酶活性聚合酶活性 在模版指導下，以在模版指導下，以4 4種種dNTPdNTP為底物，催化單核苷酸為底物，催化單核苷酸接合到接合到DNADNA引物引物的的3 3-OH-OH末端。末端。5 5CCGOH 5CCGOH 5CCGATAGCCTCCGATAGCCTGGCTATCGGA GGCTATCGGAGGCTATCGGA GGCTATCGGA催化合成的要求：模板，催化合成的要求：模板，4 4種種dNTPdNTP，引物，引物與模，引物，引物

19、與模板形板形 成正確的氫鍵配對成正確的氫鍵配對第31頁/共261頁三種活性：三種活性： gap filling:gap filling:在雙鏈在雙鏈DNADNA上的缺口部分的上的缺口部分的3 3OHOH末端上附加核苷酸，補平其鏈部分末端上附加核苷酸，補平其鏈部分 Nick translation:Nick translation:在雙鏈在雙鏈DNADNA的切口部分的的切口部分的3 3OHOH末端附加核苷酸，同時外切性除去末端附加核苷酸，同時外切性除去5 5末端的核苷酸。末端的核苷酸。 Strand displacement:Strand displacement:通過在切口的通過在切口的3 3

20、OHOH末端附加核苷酸達到置換據有末端附加核苷酸達到置換據有5 5- -末端的鏈末端的鏈第32頁/共261頁2 2） 雙鏈特異性的雙鏈特異性的5 533外切酶活性外切酶活性 無無dNTPdNTP時，從時，從5 5末端降解末端降解ds-DNAds-DNA成為成為5 5單核苷酸。單核苷酸。 5CGCATCGGCGTAATC 5CATTAG3GCGTAAGCPC 、PG3）單鏈特異性的3-5外切酶活性 無dNTP時從3-OH末端降解ss-DNA或游離3_OH末端成為單核苷酸。5CGCATCGGCG5CGC GCGPA、PC、PT、PG第33頁/共261頁第34頁/共261頁 5-3外切酶 3-5外切

21、酶起始端 5-P 3-OH斷裂位置 末端磷酸二酯鍵 3OH末端切除特點 配對的 不配對的 脫氧核糖核苷酸 核糖核苷酸第35頁/共261頁coli DNA Polcoli DNA Pol在基因工程中的用途：在基因工程中的用途： 制備高比活的制備高比活的DNADNA探針探針 用于分子克隆用于分子克隆 DNADNA序列分析序列分析 與與DNaseIDNaseI一起使用，進行切口平移一起使用，進行切口平移 通過通過Okayama_BergOkayama_Berg合成合成cDNAcDNA的第二條鏈的第二條鏈 第36頁/共261頁2 2Klenow Klenow 片段：片段： E.coli DNA E.c

22、oli DNA 聚合酶的一個大片斷。聚合酶的一個大片斷。MW:7.6KDaMW:7.6KDa。 具有聚合酶具有聚合酶I I的的5 533聚合酶活性聚合酶活性在模版和引物存在時，以在模版和引物存在時，以dNTPdNTP做底物，沿做底物，沿5 5-3-3方向方向合成與模版互補的合成與模版互補的DNADNA。對單鏈對單鏈DNADNA有有3 3 5 5外切酶活性，較弱，不適于外切酶活性，較弱，不適于3 3突出端的平滑化突出端的平滑化無無5 533外切酶活性。外切酶活性。 第37頁/共261頁Klenow Klenow 片斷用途：片斷用途： 填充用限制酶消化填充用限制酶消化dsDNAdsDNA的的3 3

23、延伸末端延伸末端平末端平末端。 用用3232PdNTPPdNTP進行補平反應，可對進行補平反應，可對DNA 3DNA 3末端進行標記末端進行標記 合成合成cDNAcDNA第二條鏈。第二條鏈。 寡核苷酸定向誘變中雙鏈寡核苷酸定向誘變中雙鏈DNADNA合成合成 在在Sanger ddNTPSanger ddNTP系統中進行順序分析。系統中進行順序分析。第38頁/共261頁（二）（二） Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶Taq DNATaq DNA聚合酶是耐熱的依賴于聚合酶是耐熱的依賴于DNADNA的的DNADNA聚合酶。聚合酶。MW:6.5kDa.MW:6.5kDa.在模版及引物存在的條件下

24、，催化與模版互補的脫氧在模版及引物存在的條件下，催化與模版互補的脫氧核苷酸一次選擇性地連接在引物的核苷酸一次選擇性地連接在引物的3 3OHOH末端上的反末端上的反應應 末端末端A, A, 即粘性末端即粘性末端 5 533外切核酸酶活性外切核酸酶活性 有鏈置換的能力。有鏈置換的能力。 無無3 3 5 5 外切核酸酶活性，無校對功能外切核酸酶活性，無校對功能, ,易突變易突變。 Mg2+Mg2+依賴酶依賴酶第39頁/共261頁用途：用途： DNADNA序列分析；序列分析； 應用于聚合酶連反應（應用于聚合酶連反應（PCRPCR）, ,對對DNADNA分子的特定序列體外擴增分子的特定序列體外擴增( (

25、產物為粘末端）；產物為粘末端）；第40頁/共261頁 pfu DNA Polymerasepfu DNA Polymerase 有有DNADNA聚合酶活性聚合酶活性 沒有逆轉錄活性沒有逆轉錄活性 有有3 3-5-5方向的外切酶活性方向的外切酶活性. . 產物為平末端產物為平末端 但是這些聚合酶的產量比但是這些聚合酶的產量比Taq DNATaq DNA聚合酶低。聚合酶低。常用于常用于PCRPCR反應反應 高保真高保真第41頁/共261頁（三）、逆轉錄酶逆轉錄酶(reverse transcriptase)(reverse transcriptase) 1 1 特性：特性： 依賴于依賴于RNARN

26、A的的DNADNA聚合酶，又稱聚合酶，又稱RNARNA依賴的依賴的DNADNA聚合酶聚合酶 有效的轉錄有效的轉錄RNARNA成為成為DNADNA 產物產物DNADNA又稱又稱cDNA,cDNA,即互補即互補DNA(Complementary DNA)DNA(Complementary DNA) 逆轉錄酶是一個多功能酶逆轉錄酶是一個多功能酶第42頁/共261頁2 2 活性：活性： 將真核生物的將真核生物的mRNAmRNA轉錄成轉錄成cDNAcDNA。 單鏈單鏈DNADNA或或RNARNA為模板時，使用反轉錄酶制備雜交探針。為模板時，使用反轉錄酶制備雜交探針。 標記帶標記帶5 5突出端的突出端的D

27、NADNA片斷。片斷。 用于雙脫氧鏈法測序用于雙脫氧鏈法測序 反轉錄反轉錄PCRPCR。第43頁/共261頁（四）末端脫氧核苷酸轉移酶末端脫氧核苷酸轉移酶（Terminal Deoxynucleotidayl TransferaseTerminal Deoxynucleotidayl Transferase） 簡稱末端轉移酶（簡稱末端轉移酶（Terminal TransferaseTerminal Transferase） 來自小牛胸腺，來自小牛胸腺，Mr:34kD,Mr:34kD,堿性蛋白質。堿性蛋白質。 作用：作用： 在二價陽離子存在下，催化在二價陽離子存在下，催化dNTPdNTP沿沿5

28、5-3-3方向聚合方向聚合作用逐個順序加于線性作用逐個順序加于線性DNADNA分子的分子的3 3OHOH末端。末端。 不需模版，不需模版，4 4種種dNTPdNTP任意一種可作前體物；只一種任意一種可作前體物；只一種dNTPdNTP組成有一種核苷酸組成的組成有一種核苷酸組成的3 3尾巴，同聚物尾巴尾巴，同聚物尾巴第44頁/共261頁用途：用途： 給載體或給載體或cDNAcDNA加上同聚尾。加上同聚尾。 3 3末端用末端用3232P P標記的標記的dNTPdNTP標記。標記。 利用非放射性標記物生物素利用非放射性標記物生物素-11-dUTP-11-dUTP滲入到滲入到DNADNA片段分子的片段分

29、子的3 3末端。末端。第45頁/共261頁第二部分：基因工程的載體一、概述 載體的概念（VectorVector）：凡來源于質粒或噬菌體的DNADNA分子，可以供插入或克隆目的基因并具有傳遞運載外源DNADNA導入宿主細胞能力的DNADNA片段稱為載體。 第46頁/共261頁載體的功能及特征 運送外源基因高效轉入受體細胞 為外源基因提供復制能力或整合能力 為外源基因的擴增或表達提供必要的條件第47頁/共261頁載體應具備的條件 具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉移性） 具有合適的篩選標記 具有較高的外源DNA的載裝能力 具有多種單一的核酸內切酶識別切割位點 具有與特定受體細胞相適應的復制位

30、點或整合位點第48頁/共261頁用于基因工程的載體 質粒（plasmid） 噬菌體或病毒DNA 考斯質粒（cosmid）與噬菌粒 人造染色體載體第49頁/共261頁質粒(plasmid)質粒的基本特征 質粒是生物細胞內固有的、能獨立于寄主染色體而自主復制、并被穩定遺傳的一類核酸分子. 質粒常見于原核細菌和真菌中 絕大多數的質粒是DNA型的 絕大多數的天然DNA質粒具有共價、封閉、環狀的分子結構，即cccDNA( covalenty, closed and circular double-stranded DNA) 質粒DNA的分子量范圍：1 - 300 kb第50頁/共261頁 質粒DNA分子

31、構型： 三種分子構型： 線性(sscDNA)：L-構型 環狀（OCDNA)：一條保持完整環形結構，另一條鏈有缺口，OCD構型 超螺旋：共價閉合環狀DNA(CCCDNA)，呈超螺旋構型 第51頁/共261頁線性環狀超螺旋第52頁/共261頁OCDNALDNASCDNA第53頁/共261頁質粒的特性 質粒的自主復制性 質粒具有不相容性 質粒具有遺傳傳遞和遺傳交換的能力。 攜帶特殊的遺傳標記第54頁/共261頁質粒的自主復制性 質粒能利用寄主細胞的DNA復制系統進行自主復制 質粒DNA上的復制子結構決定了質粒與寄主的對應關系 根據在每個細胞中的分子數（拷貝數）多寡，質粒可分為兩大復制類型： 嚴緊型復

32、制控制的質粒1 - 3 拷貝 松弛型復制控制的質粒10 - 60 拷貝第55頁/共261頁質粒的不相容性 任何兩種含有相似復制子結構的不同質粒，不能同時存在于一個細胞中，這種現象稱為質粒的不相容性，不相容性的質粒組成不相容性群。 以大腸桿菌的質粒為例： ColE1、pMB1 擁有相似的復制子結構，彼此不相容 pSC101、F、RP4 擁有相似的復制子結構，彼此不相容 p15A及其衍生質粒擁有相似的復制子結構，彼此不相容第56頁/共261頁質粒的不相容性：分子機制 兩種含有相似復制子結構的不同質粒，在復制時受到同一種拷貝數控制系統的干擾，致使兩種質粒的最終拷貝數不同。因此在經過若干復制周期和細胞

33、分裂周期后仍能共處于同一細胞內，其中拷貝數多的質粒在以后的細胞分裂周期中更具優勢 兩種含有不同復制子結構的不同質粒，在復制時各受自己的拷貝數控制系統的調節，致使兩種質粒的最終拷貝數恒定。 第57頁/共261頁質粒的可轉移性革蘭氏陰性菌的質粒可分成兩大類： 接合型質粒能在天然條件下自發地從一個細胞轉移到另一個細胞（接合作用），如F、Col、R質粒等。 非接合型質粒不能在天然條件下獨立地發生接合作用如Col、R的其它成員 值得注意的是，某些非接合型質粒（ColE1）在接合型質粒的存在和協助下，也能發生DNA轉移，這個過程由bom 和mob 基因決定第58頁/共261頁攜帶特殊的遺傳標記 野生型的質

34、粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因，這使得寄主生物產生正常生長非必需的附加性狀，包括： 物質抗性：抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機物 物質合成：抗生素、細菌毒素、有機堿 這些標記基因對DNA重組分子的篩選具有重要意義第59頁/共261頁質粒作為載體的優缺點優點：分子量小，易操作。 大多有抗性標記 易導入宿主細胞缺點：插入外源基因的片斷不能太大第60頁/共261頁質粒的分類人工構建的質粒根據其功能和用途可分成如下幾類： 高拷貝質粒突變拷貝數控制基因拷貝數1000-3000 ，擴增基因 低拷貝質粒來自pSC101 ，拷貝數小于10， 表達某些毒性基因 溫敏質粒在不同溫度下表現出拷貝數、整

35、合等不同性質 測序質粒含有測序通用引物互補序列和多酶接頭polylinker 整合質粒裝有整合促進基因及位點，便于外源基因的整合 穿梭質粒裝有針對兩種不同受體的復制子，便于基因克隆 表達質粒裝有強化外源基因表達的轉錄、翻譯、純化的元件 探針質粒裝有報告基因便于啟動子等元件的克隆篩選第61頁/共261頁（一） 質粒質粒- -克隆載體克隆載體復制起始位點多克隆位點篩選標記第62頁/共261頁克隆載體三個要素：1）復制子：復制子又稱復制起始區，包含控制質粒DNA復制起點和質粒拷貝數等遺傳因素。2）選擇標記： 由質粒編碼的選擇標記賦予宿主細胞新的表型，用于鑒定和篩選轉化有質粒的宿主細胞。 最常見的選擇

36、標記為抗生素抗性基因，包括氨芐青霉素（amp），四環素（tet），氯霉素（cm），卡那霉素（kan）和新霉素（neo）等。 第63頁/共261頁3）多克隆位點：質粒載體中由多個限制性內切酶識別序列密集排列形成的序列稱之為多克隆位點（multiple cloning site, MCS）。 第64頁/共261頁常用的質粒克隆載體pBR322質粒圖譜4363bp; Ampr and tetr,拷貝數3000松弛型第65頁/共261頁pUC18/19質粒圖譜第66頁/共261頁第67頁/共261頁（二）表達載體第68頁/共261頁表達載體具備的條件表達載體具備的條件: : 載體能夠獨立的復制 穩定的

37、遺傳復制、傳代能力，在無選擇壓力下能存 在于宿主細胞內。 強的啟動子，能為大腸桿菌RNARNA聚合酶所識別。 應具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當誘導時才能進行轉錄。 強的終止子。 好的核糖體結合位點：SDSD序列、ATGATG 目的基因插入位點 篩選標記第69頁/共261頁第70頁/共261頁2 表達載體分類：表達載體分類：原核表達載體原核表達載體非融合蛋白表達載體：啟動子和核糖體結合位點非融合蛋白表達載體：啟動子和核糖體結合位點 啟動子包括啟動子包括噬菌體噬菌體PLPL啟動子，啟動子，T7T7噬菌體啟動子，噬菌體啟動子，tactac啟動子，啟動子，trctrc啟動子等啟動子等融合蛋白表達

38、載體。融合蛋白表達載體。pETpET系列載體，硫氧還蛋白融合表達系列載體，硫氧還蛋白融合表達載體，載體，XpressXpress表達系統，表達系統，GSTGST基因融合系統基因融合系統-pGEX-pGEX系列載系列載體等。體等。 真核表達載體真核表達載體不帶病毒復制子不帶病毒復制子帶病毒復制子帶病毒復制子真核表達載體含有原核基因序列和真核轉錄單位，能在大腸真核表達載體含有原核基因序列和真核轉錄單位，能在大腸桿菌中自我復制，也能在真核細胞中進行表達。桿菌中自我復制，也能在真核細胞中進行表達。 第71頁/共261頁質粒DNA的分離純化實驗室一般使用下列三種方法制備質粒DNA： 氯化銫密度梯度離心法

39、 質粒DNA純度高、周期長、設備要求高、溴乙錠污染 堿溶法 質粒DNA純度低、快速、操作簡便 沸水浴法 質粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和堿溶法之間第72頁/共261頁第73頁/共261頁第74頁/共261頁第75頁/共261頁二噬菌體載體1 1 特點： 噬菌體容量大 噬菌體轉染宿主細胞的效率比大腸桿菌轉化效率高2-32-3個數量級2 2 常用的噬菌體載體： 噬菌- -體衍生物 CosmidCosmid第76頁/共261頁1)噬菌體衍生物 噬菌體是雙鏈DNA病毒 基因組長度為48502bp 分子兩端各有12個堿基的單鏈互補粘性末端。當感染宿主細胞后線性DNA分子會迅速籍助粘性末端互補連接成

40、環，連 接 區 域 稱 為 C O S（cohesive site）位點。第77頁/共261頁第78頁/共261頁-DNA-DNA載體的構建：縮短長度 野生型-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當插入的外源DNA片段不大于2.5kb時，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型-DNA的長度，可以提高裝載量。 其實野生型-DNA上約有40-50%的片段是復制和裂解所非必需的。根據切除的多少，可將-DNA載體分成兩大類載體： 插入型載體 取代型載體第79頁/共261頁第80頁/共261頁第81頁/共261頁-DNA作為載體的優點： -DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能

41、高效轉染大腸桿菌-DNA載體的裝載能力為25 kb，遠遠大于質粒的裝載量。 重組-DNA分子的篩選較為方便 -DNA載體適合克隆和擴增外源DNA片段，但不適合表達外源基因第82頁/共261頁2) Cosmid 2) Cosmid （考斯質粒，粘性質粒） CosmidCosmid質粒是將質粒和COSCOS粘性末端構建的克隆載體。 長度約4-6kb4-6kb，克隆的真核基因DNADNA大約在31-31-45kb45kb。第83頁/共261頁特點： 具有噬菌體粘性末端特性 具有質粒載體抗藥性標記特性 具有一個或多個限制性酶切位點 具有高容量的克隆能力 接上真核細胞的表達元件，能在真核細胞中表達和生存

42、。 第84頁/共261頁應用：第85頁/共261頁人造染色體載體 人類、動物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數百甚至上千kb 的DNA片段， 此時考斯質粒和噬菌粒載體的裝載量也遠遠不能滿足需要。將細菌接合因子或酵母菌染色體上的復制區、分配區、穩定區與質粒組裝在一起，即可構成染色體載體。當大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細胞中穩定的復制并遺傳。目前常用的人造染色體載體包括： 細菌人造染色體（BAC） 酵母人造染色體（YAC）第86頁/共261頁細菌人造染色體（Bacterial Artificial Chromosomes BAC

43、） 細菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子FF質粒的基礎上構建的，其裝載量范圍在50 - 300 kb之間，各種類型的pBACs在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝。 pBACs主要適用于： 克隆大型基因簇（gene cluster）結構 構建動植物基因文庫第87頁/共261頁酵母人造染色體（Yeast Artificial Chromosomes YAC）第88頁/共261頁基因工程的宿主細胞基因工程的宿主細胞條件： 限制性缺陷型 外切酶和內切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-） 重組整合缺陷型 用于基因擴增或高效表達的受體細胞（recA-） 具有較高的轉化效率 具有與載體選擇標記互補

44、的表型 感染寄生缺陷型 防止重組細菌擴散污染，生物武器除外原核：細菌：大腸桿菌、枯草桿菌、鏈球菌等真核：酵母、哺乳動物細胞、昆蟲細胞等第89頁/共261頁大腸桿菌 遺傳背景清楚，載體受體系統完備，生長迅速，培養簡單，重組子穩定 產結構復雜、種類繁多的內毒素 適用于外源DNA的擴增和克隆、原核生物基因的高效表達、基因文庫的構建，是DNA重組實驗和基因工程的主要受體菌第90頁/共261頁枯草桿菌 遺傳背景清楚，蛋白質分泌機制健全，生長迅速，培養簡單，不產內毒素 適用于原核生物基因的克隆、表達以及重組蛋白多肽的有效分泌 遺傳欠穩定，載體受體系統欠完備第91頁/共261頁酵母菌 具有真核生物的特征，遺

45、傳背景清楚，生長迅速，培養簡單，外源基因表達系統完善，遺傳穩定 內源性蛋白產物種類繁多且含量高 適用于外源DNA的擴增、克隆以及真核生物基因的高效表達、基因文庫的構建、真核生物基因表達調控的研究，是DNA重組實驗和基因工程重要的真核性受體菌第92頁/共261頁昆蟲細胞（家蠶） 具有真核生物的特征，外源基因表達量高，繁殖相對較快，培養成本低廉，遺傳穩定 適用于真核生物基因的高效表達 DNA重組操作系統欠完善第93頁/共261頁哺乳動物細胞（中國倉鼠卵巢細胞CHO） 與人的親緣關系近，分子重組表達系統健全，具有合適的糖基化修飾系統 細胞培養條件苛刻，生長緩慢 適用于哺乳類動物和人的基因表達調控研究

46、、基因藥物的生產，是DNA重組實驗和基因工程的主要哺乳動物受體第94頁/共261頁實驗室常用的基因工程受體 大腸桿菌： 用于接受質粒：C600、W3110、HB101、JM83、JM101（Aps、Tcs、Cms） 用于接受-DNA：LE392、ED8654 酵母菌： 畢赤酵母 啤酒酵母 哺乳動物細胞CHO第95頁/共261頁 第四節第四節 目的基因的制備生物合成基因未知 基因文庫組構建 cDNA 文庫 生物合成基因已知(GeneBank可查) 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR） 逆轉錄PCR（retrotranscription PCR， RTPC

47、R） 化學合成 第96頁/共261頁 基因工程或DNA重組技術三大用途的前提條件是從生物體基因組中分離克隆目的基因，目的基因獲得之后，或確定其表達調控機制和生物學功能，或建立高效表達系統，構建具有經濟價值的基因工程菌（細胞），或將目的基因在體外進行必要的結構功能修飾，然后輸回細胞內改良生物體的遺傳性狀，包括人體基因治療。一般來說，目的基因的克隆戰略分為兩大類： 一類是構建感興趣的生物個體的基因文庫，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從基因組文庫中挑出含有目的基因的重組克隆； 另一類是利用PCR擴增技術甚至化學合成法體外直接合成目的基因，然后將之克隆表達。第97頁/共261頁

48、一、尋找目的基因尋找目的基因1 1 基因組文庫（基因組文庫（genomic DNA librarygenomic DNA library）：）： 是指將基因組是指將基因組DNADNA通過限制性內切酶部分酶解后所產生的基因組通過限制性內切酶部分酶解后所產生的基因組DNADNA片斷隨即的同相應片斷隨即的同相應的載體重組、克隆，所產生的克隆群體代表了基因組的載體重組、克隆，所產生的克隆群體代表了基因組DNADNA的所有序列，包括外顯子和內的所有序列，包括外顯子和內含子序列含子序列 。第98頁/共261頁 基因組文庫應用：基因組文庫應用： 1 1）原核生物目的基因的分離（目的基因在質粒上）原核生物目的

49、基因的分離（目的基因在質粒上） 提取提取質粒質粒DNADNA限制性酶切限制性酶切從從DNADNA凝膠電泳回凝膠電泳回收不同大小的片段收不同大小的片段與載體連接構建物理圖譜與載體連接構建物理圖譜探探針雜交針雜交分離目的基因。分離目的基因。 2 2 ）鳥槍法分離基因（目的基因在染色體）鳥槍法分離基因（目的基因在染色體DNADNA上）：上）： 用限制性內切酶將用限制性內切酶將染色體染色體DNADNA酶切，得到很多同一酶切，得到很多同一般基因大小相當的般基因大小相當的DNADNA片斷，然后將這些片斷混合片斷，然后將這些片斷混合物隨即重組入適當的載體，轉化后在受體菌種擴增，物隨即重組入適當的載體，轉化后

50、在受體菌種擴增，再用適當的方法篩選出需要的基因：再用適當的方法篩選出需要的基因： 第99頁/共261頁鳥槍法克隆目的基因的基本戰略 染色體DNA的切斷 超聲波處理：片段長度均一，大小可控，平頭末端 全酶切： 片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開，大小不可控 部分酶切： 片段長度可控，含有粘性末端，目的基因完整 與載體連接 如果轉化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體；如果轉化子采用基因產物功能檢測法篩選，則選擇表達型載體 受體細胞； 如果轉化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為轉化受體細胞 如果轉化子采用基因產物功能檢測

51、法篩選，則選擇能使目的基因表達的受體細胞 篩選含有目的基因的目的重組子 菌落原位雜交法、基因產物功能檢測法（篩選模型的建立）第100頁/共261頁鳥槍法克隆目的基因的局限性 工作量較大，需要了解目的基因的背景知識 不能獲得的最小長度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的內含子結構第101頁/共261頁2 2 真核生物基因組文庫- -（cDNAcDNA文庫含內含子）cDNAcDNA文庫（cDNA librarycDNA library）建立： 從真核細胞分離總RNA,RNA,純化出mRNA,mRNA,逆轉錄合成互補的DNA,DNA,再在聚合酶作用下合成cDNAcDNA第二條鏈, ,然后將雙鏈cD

52、NAcDNA插入到載體內, ,構建重組體, ,轉入宿主菌, ,得到的克隆總和成為該類細胞的cDNAcDNA文庫. .第102頁/共261頁cDNA文庫特征： 包含成熟mRNA的全部信息,即包含該細胞內表達的全 部蛋白的編碼信息. 它只包括在特定的組織或細胞類型中已經被 轉錄成mRNA的那些基因序列。其復雜性比基因組文庫低。 由于不同的細胞類型、發育階段以及細胞所處的特定狀態是由特定基因的表達的所決定的，因此各自的mRNA的種類就不同，由此而產生獨特的cDNA文庫。第103頁/共261頁cDNA法克隆目的基因的局限性 并非所有的mRNA分子都具有polyA結構 細菌或原核生物的mRNA半衰期很短

53、 mRNA在細胞中含量少，對酶和堿極為敏感， 分離純化困難 僅限于克隆蛋白質編碼基因第104頁/共261頁二. .制備目的基因（一）聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）1 基本原理 :根據堿基配對原則利用DNA聚合酶催化和dNTP的參與下，引物依賴于DNA模板特性引導DNA的合成。 使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴增目的基因或 DNA片段兩側的序列，根據該序列化學合成聚合反應必需的雙引物 變性（denaturation）：94 3-5min. 退火（annealing）：55-60，1min左右。 延伸（extension）：72，1mi

54、n. 從引物的3-OH進行延伸，合成方向為5-3,從而合成2分子與原來基因相互補的片段，每循環一次，DNA分子按指數倍增。一般可得到100bp-5000bp的目的基因。 第105頁/共261頁第106頁/共261頁第107頁/共261頁PCR反應要點1）模板 DNA模板：0.05-1ug，含單拷貝基因數3*105， RNA模板：RNAcDNA2）DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶：耐高熱，粘末端產物 Pfu DNA聚合酶：高保真酶。平末端產物3）緩沖系統：4）dNTP濃度：5）引物設計原則：第108頁/共261頁PCRPCR各要素及其作用各要素及其作用（1） 模板 PCR模板可以是DNA或RN

55、A。 以線性DNA模板為佳，量適中，一般為102105個拷貝； RNA作為模板時，需要： RNA cDNA PCR, 稱此為RT-PCR.（2）耐熱DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 是從耐熱細菌體內提取的一種DNA聚合酶，可在95穩定30分鐘。從而保證PCR在94變性 55退火72延伸循環30次過程中不變性失活。 在PCR中，Taq DNA聚合酶應用最廣泛。 逆轉錄第109頁/共261頁引物引物 引物是根據已知序列的模板DNA待擴增區兩端而設計的一對寡核苷酸小片斷，長度一般為1530個堿基。 引物是保證PCR擴增產物的大小和特異性的關鍵因素，其設計與合成對PCR的成功至關重要。 引物設計原

56、則如下：第110頁/共261頁引物設計應符合以下基本原則引物設計應符合以下基本原則長度適宜，一般為長度適宜，一般為1515 3030個堿基；個堿基； 引物的有效長度不能大于引物的有效長度不能大于 38 mer38 mer，否則最適延伸溫度會超過，否則最適延伸溫度會超過TaqDNATaqDNA聚聚合酶的最適溫度（合酶的最適溫度（7272），不能保證），不能保證PCRPCR擴增產物的特異性擴增產物的特異性G+CG+C含量，一般為含量，一般為4040 6060；G+CG+C太少擴增效果不佳，太少擴增效果不佳，G+C G+C 過多易出現非特異條帶過多易出現非特異條帶4 4種堿基應隨機性分布；種堿基應隨

57、機性分布； ATGCATGC最好隨機分布，避免最好隨機分布，避免5 5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列 第111頁/共261頁引物自身不應存在互補序列；引物自身不應存在互補序列；兩個引物之間不應有多于兩個引物之間不應有多于4 4個堿基的互補；個堿基的互補； 避免兩條引物間互補，避免兩條引物間互補， 特別是特別是 3 3端的互補，否則會形成引物二聚體，端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異性的擴增條帶產生非特異性的擴增條帶引物引物3 3端不應有任何修飾；端不應有任何修飾； 特別是最末及倒數第二個堿基，以避免因末端堿基不配對而導致特別是最末及倒數第二個堿基，

58、以避免因末端堿基不配對而導致PCRPCR失敗失敗引物引物5 5可以修飾。可以修飾。第112頁/共261頁引物的特異性：引物的特異性：引物必須經引物必須經GenBankGenBank查詢后，證實沒有與其他非目的查詢后，證實沒有與其他非目的DNADNA有高度互補，才有高度互補，才能使用。能使用。引物量：引物量： 每條引物的濃度每條引物的濃度0.1-1umol0.1-1umol或或10-100 pmol10-100 pmol，以最低引物量產生所需要，以最低引物量產生所需要的結果為好的結果為好 引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引

59、物之間形成二聚體的機會聚體的機會第113頁/共261頁（4）緩沖溶液與Mg2+ PCR技術常用1050mmol/L Tris-HCl、Ph8.38.88、偏堿緩沖液；并含有一定量的Mg2+濃度；（5）dNTP濃度 PCR一般用50200mol/L的dNTP；并且4種dNTP濃度應相等；濃度過高可引起會造成雜帶、特異產物帶不清晰等不好的結果，濃度過低則得不到所需的產物。最可靠的做法是先做濃度對照,再根據結果決定最佳條件第114頁/共261頁參數參數變性溫度與時間變性溫度與時間 一般選擇： 940C， 30秒退火溫度與時間退火溫度與時間 取決于引物長度、濃度和G+C含量， 一般選擇： Tm - 5

60、延伸溫度與時間延伸溫度與時間 一般選擇：一般選擇： 70 70 7575循環次數循環次數 取決于模板濃度，取決于模板濃度， 一般循環：一般循環：3030次次第115頁/共261頁PCRPCR操作操作各種PCR反應的操作基本相同，只是根據引物與靶序列不同，選擇不同的反應體系和循環參數。將PCR反應管置于DNA自動化熱循環儀上，輸入各種循環參數，使DNA擴增在熱循環儀上很方便地完成。PCR技術優點 特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時，對樣本質量要求不高，能快速、特異地擴增任何DNA片斷。PCR缺點 由于高靈敏度，使易出現假陰性或假陽性結果。第116頁/共261頁PCRPCR產物分析產物分析（1）凝