1、橡膠樹抗逆相關WRKY專錄因子的克隆與功能鑒定我國屬于非傳統植膠區 , 低溫和干旱是影響我國橡膠樹地理分布和天然橡膠 產量的主要因素 , 因此, 培育高產抗低溫干旱的優良品種對我國橡膠事業發展意 義重大。由于橡膠樹是多年生木本植物 , 常規育種周期長 ,分子生物學和組織培養 技術及基因工程技術的發展為橡膠品種改良創造了條件。WRK轉錄因子是近二十年來在植物中發現的一類轉錄因子 ,它主要參與調 控植物的生長發育 , 以及各種生物和非生物脅迫的響應。病原菌侵染、創傷、各 種非生物脅迫 （如干旱、低溫、高鹽、高滲透壓等 ）和植物信號類物質 （如水楊酸、 茉莉酸、乙烯、脫落酸等）都能誘導WRK基因的表

2、達。本研究以低溫處理的熱研 7-33-97 為材料,基于本實驗構建的橡膠樹 cDNA 文庫中WRK基因的EST片段，通過RACE技術，獲得了 4個HbWRK基因，分別命名 為HbWRKY1HbWRKY2HbWRKY3HbWRKY4寸其生物學功能進行了研究；并構建 植物表達載體 , 應用農桿菌介導法轉化橡膠樹愈傷組織。其主要結果如下： 1、 HbWRK基因的克隆本研究通過 RACE技術,共獲得了 4個HbWRK轉錄因子基因， 其中HbWRKY基因DNA序列全長3780bp,由四個外顯子和三個內含子組成,包含 一個2211bp的開放閱讀框,編碼737個氨基酸組成的多肽,含有兩個WRKYGQK 構域

3、和兩個C2H2鋅指結構,屬于WRK基因家族第I類。研究發現,HbWRK丫在不同的組織中都存在兩種編碼框,分別命名為 HbWRKYI和 HbWRKYIb雖然它們編碼的肽段長度相同，但結構上有75個氨基酸 存在差異。HbWRKY理論等電點為6.05,蛋白質的分子量為79.70389KD,HbWRKY理論等電點為5.83,蛋白質的分子量為79.6026KD。HbWRKY基因DNA序列全長2273bp, 由六個外顯子和五個內含子組成,包含一個1773bp的開放閱讀框,所編碼的肽段 由 590個氨基酸組成的多肽 , 理論等電點為 6.36, 蛋白質的分子量為 63.9419KD, 含有一個保守的 WRK

4、YGQ結構域和一個C2H2鋅指結構,屬于WRK基因家族第U 類中的第U b亞類。HbWRKY基因DNA序列全長1255bp,由三個外顯子和兩個內含子組成,包含個 963bp的開放閱讀框。所編碼的肽段由 320個氨基酸組成,理論等電點為4.80, 蛋白質的分子量為36.152KD,含有一個保守的WRKYG結K勾域和一個C2H2鋅指 結構,屬于WRK基因家族第U類中第U e亞類。HbWRKY基因DNA序列全長1009bp,由三個外顯子和兩個內含子組成，包含一 個789bp的開放閱讀框架，編碼262個氨基酸組成的多肽，理論等電點為8.51,蛋 白質的分子量為28.8086KD,含有一個保守的 WRK

5、YG結K勾域和一個C2H2鋅指結 構，屬于WRK基因家族第U大類中的第U a亞類。2、HbWRK基因啟動子區域的 克隆與分析對克隆得到的4個HbWRKS因進行啟動子克隆并分析，其主要結果如 下：其中HbWRKY基因擴增獲得2319bp的啟動子序列，該調控區含有 W-BOX響 應高溫脅迫和茉莉酸甲酯(MeJA)等多種順式作用元件；HbWRKY基因擴增獲得 1276bp的啟動子調控區，該調控區含有 W-BOX向應高溫(HSE)和水楊酸 (TCA-element)等多種順式元件；HbWRKY基因擴增獲得1068bp的啟動子調控區， 該調控區含有 W-BOX傷害響應元件(WUN motif)、低溫響應

6、元件(LTRE)、脫落 酸響應元件(ABRE)等多種順式作用元件；HbWRKY基因擴增獲得708bp的啟動子 調控區，該調控區含有 W-BOX脫落酸響應元件(ABRE)、低溫響應元件(LTRE)等 多種順式元件。3、HbWRK基因的功能分析4個HbWRK轉錄因子在橡膠樹花中的表達量最 高。HbWRKY基因在各種非生物脅迫下表達水平變化不大,但受低溫和ABA的誘 導。HbWRKY基因在葉片中響應干旱、PEG低溫脅迫以及受SA的早期誘導表達； 在樹皮中響應高鹽、低溫脅迫以及受 ET的誘導表達。HbWRKY基因在葉片中響 應PEG高鹽、低溫脅迫,以及受MeJA SA ABA H2O2和ET的誘導表達

7、,在樹 皮中響應干旱、PEG低溫脅迫以及受 MeJA SA(?) 口 ET的誘導表達；HbWRKY4 基因在葉片中響應干旱、 PEG低溫脅迫以及受 MeJA SA ABA H2O2口 ET 的早期應答反應，在樹皮中響應NaCI、低溫脅迫以及受ET誘導表達,且低溫脅迫 強烈誘導其表達。HbWRKY超表達增強了擬南芥植株的耐旱性；在高鹽脅迫下,HbWRKY超表達 擬南芥植株提高了擬南芥下游基因 AtRD22和AtRD29A的表達水平，增強了植株的 耐鹽能力；在SA的誘導下,HbWRKY超表達強烈提高了 AtNPR1和 AtPR1的表達 水平,在MeJAB導下,HbWRKY超表達強烈誘導了 AtLO

8、X2基因的表達以響應 MeJA 信號途徑,說明HbWRKY可能參與SA和 JA信號途徑，與植物病原菌的防衛有關； 在乙烯誘導下,HbWRKY超表達抑制了擬南芥乙烯相關基因 AtETR1 和 AtERSl的 表達；在低溫脅迫下,HbWRKY超表達擬南芥植株的脯氨酸和可溶性糖含量高于 野生型植株,同時提高了下游基因AtRD29A AtCOR15A和AtCOR47勺表達水平。 HbWRKY超表達增強了植株的耐旱能力；在乙烯誘導下,HbWRKY超表達擬南芥植 株AtERS1和AtETR1基因的表達水平急劇增高。HbWRKY超表達增強了擬南芥植株的耐旱性；在高鹽脅迫下，HbWRKY超表達 擬南芥植株提高

9、了擬南芥下游基因 AtRD22和AtRD29A的表達水平,增強了植株的耐鹽能力：在乙烯誘導下,HbWRK丫超表達抑制了擬南芥乙烯相關基因 AtETR1和AtERSI的表達；低溫脅迫下，HbWRKY超表達擬南芥植株提高了 AtC0R15A和AtC0R4；基因的表達水平。4、橡膠樹遺傳轉化以EHA105工程菌株，pCAMBIA2301 為植物表達載體,將橡膠樹HbWRKY通過農桿菌介導轉化橡膠樹熱研 7-33-97和 熱研 8-79 胚性愈傷組織 , 以 uidA 基因的穩定表達頻率為指標研究共培養時間對 遺傳轉化效率的影響,結果表明熱研7-33-97愈傷組織共培養5d的uidA的穩定 表達頻率最高 , 熱研 8-79 愈傷組織共培養 6d 的 uidA 的穩定表達頻率最高。通過Kan篩選,各獲得4個熱研7-33-97和熱研8-79抗性愈傷組織系,經GUS 組織化學染色和PCR檢測,都為轉化愈傷組織系。以GV3101為工程菌株,以bar 基因為篩選基因,雙丙氨磷為篩選劑，通過根癌農桿菌介導將橡膠樹 HbWRKY基 因轉化橡膠樹熱研 8-79 愈傷組織。結果表明雙丙氨磷篩選橡膠樹愈傷組織的適宜濃度為3mg/L。研究