1、編號編號(學號學號)：08494094畢畢 業業 論論 文文 ( 2008 屆本科屆本科)題題 目：目： 無梗五加果色素提取及純化工藝研究無梗五加果色素提取及純化工藝研究 學學 院：院： 食食 品品 學學 院院 專專 業：業： 食品科學與工程食品科學與工程 姓姓 名：名： 韓韓 穎穎 指導教師：指導教師： 馮穎馮穎 講師講師 完成日期：完成日期： 2008 年年 6 月月 10 日日畢業論文任務書畢業論文任務書論文題目論文題目無梗五加果色素提取及純化工藝研究下發任下發任務日期務日期2007 年 9 月學生姓名學生姓名韓 穎指導教師指導教師馮穎 講師一、論文主要內容一、論文主要內容1通過單因素試

2、驗，確定無梗五加果色素的提取劑種類，并對浸提溫度、提取劑用量及浸提時間進行篩選，并在此基礎上，進行正交試驗，確定色素浸提的最佳工藝。2通過試驗篩選出純化無梗五加果色素的最佳樹脂，然后確定 HPD600對無梗五加果色素的最佳純化工藝條件。3通過花色苷類化合物的顯色反應，初步確定無梗五加果色素的組分。二、論文的基本要求二、論文的基本要求1. 掌握無梗五加果色素的提取工藝；2. 了解并掌握大孔樹脂的吸附原理，及影響吸附和解吸的條件；3. 通過畢業論文工作，學習并掌握研究方案的制定、實施、總結和論文報告寫作等基本原理和方法。三三.論文工作進度安排論文工作進度安排階段階段論文各階段名稱論文各階段名稱日期

3、日期1布置任務2007 年 9 月2查閱資料，設計實驗方案2007 年 10 月3進行實驗預備，確定具體的實驗方案2007 年 11 月4正式實驗，并進行數據的歸納整理2008 年 3 月5論文成稿、預答辯2008 年 6 月6畢業論文答辯2008 年 6 月備注：備注：四四.收集的資料及主要參考文獻收集的資料及主要參考文獻(指導教師指定指導教師指定)1 淳于家龍,郭麗娜,張長順.無梗五加化學成分與藥理活性的研究進展J.中國藥業2002,11(12):73-74.2 龐志申.花色苷研究概況.北京農業科學.2000,18(5):3742.3 袁海波,童華榮.天然食用色素花青素應用研究進展,廣州食

4、品工業科技,17(3): 7577.4 楊虎清,黃素娟.食品色素的過去、現在和未來中國食品添加劑.2002 (3)：1014.5 鐘瑞敏,葡萄花色苷優化提取和純化工藝研究.韶關大學學報1995,12(8):113121.6 夏明,杜琪珍.高速逆流色譜提取分離紅曲色素的研究.廣州食品工業科技,2002,18(4):15-17.7 孫振方,高鳳蘭,杜秀華.無梗五加片治療白細胞減少癥臨床觀察J中國中醫藥科技,1997,4(2):10.8 李興運,張盛橋,李曉珍.無梗五加沖劑治療婦女更年期綜合癥雙盲試驗研究J.中藥藥理與臨床,1989,5(1):45.9 周重楚,王桂芝,宋曉凱.無梗五加醇提物的抗變態

5、性反應性炎癥作用J.中藥通報,1985,10(10):3739.10 任曉楓,高鳳蘭，孫振方.無梗五加藥效學研究J.中國中醫藥科技,1998,5(1):4041.11 陳陽，王軍華，滕利榮 大孔樹脂法純化紅花蕓豆色素及初步鑒定J農業工程學報,2007,6(6):238.說明：此任務由指導教師填寫一式兩份，一份發給學生，一份發給指導教師留存。說明：此任務由指導教師填寫一式兩份，一份發給學生，一份發給指導教師留存。沈陽農業大學畢業論文選題審批表沈陽農業大學畢業論文選題審批表選題名稱無梗五加果色素提取及純化工藝研究題目來源自 選學號08494094姓名韓穎專業食品科學與工程指導教師馮穎職稱講師研 究

6、內 容1. 通過單因素試驗，確定無梗五加果色素的提取劑種類，并對浸提溫度、提取劑用量及浸提時間進行篩選，確定色素浸提的最佳工藝。2. 通過試驗篩選出純化無梗五加果色素的最佳樹脂，然后確定 HPD600 對無梗五加果色素的最佳純化工藝條件。研 究計 劃2008 年 3 月：通過試驗確定無梗五加果色素的提取劑種類，浸提溫度、提取劑用量及浸提時間。2008 年 4 月：通過試驗篩選出純化無梗五加果色素的最佳樹脂及最佳純化工藝條件。2008 年 6 月：論文成稿。特 色1. 無梗五加當作刺五加藥用，具有許多藥理學作用。2. 目前人們對五加根，莖、葉的研究十分多，但對五加果的研究卻很少。指 導 教 師

7、意 見教 研 室 意 見學 院 意 見畢業論文指導記錄畢業論文指導記錄學生姓名韓穎專業食品科學與工程指導教師姓名馮穎職稱講師本年度指導畢業生人數6論文題目無梗五加果色素提取及純化工藝研究時間地點指導內容指 導 過 程學生簽字：年 月 日 指導教師簽字：年 月 日教研室主任簽字：年 月 日沈陽農業大學畢業論文考核表沈陽農業大學畢業論文考核表論文題目：無梗五加果色素提取及純化工藝研究論文題目：無梗五加果色素提取及純化工藝研究姓名：韓穎姓名：韓穎 學號：學號：08494094 專業：食品科學與工程專業：食品科學與工程指導教師評語：指導教師評語： 指導教師指導教師(簽字簽字)： 年年 月月 日日評閱人

8、評審意見：評閱人評審意見： 評閱人評閱人(簽字簽字)： 年年 月月 日日答辯委員會意見：答辯委員會意見： 主任委員主任委員(簽字簽字)： 年年 月月 日日注：答辯委員會意見除填寫簡要評語、給出成績外，還要提出是否授予學位的建議注：答辯委員會意見除填寫簡要評語、給出成績外，還要提出是否授予學位的建議成績：目錄目錄中文摘要(關鍵詞).1外文摘要(關鍵詞).21 前 言 .31.1 花色苷的研究概況 .31.2 花色苷類天然植物色素的純化方法.51.2.1 離子交換樹脂柱層析 .51.2.2 大孔樹脂分離 .51.2.3 其他純化方法 .61.3 無梗五加的研究概況.61.4 本文研究內容及目標.7

9、2 材料和方法 .92.1 試驗材料 .92.2 試驗試劑 .92.3 試驗方法 .92.3.1 無梗五加果色素提取條件的研究 .92.3.2 最佳樹脂的選擇 .92.3.3 靜態試驗 .92.3.3.1 PH 對樹脂吸附性能的影響.92.3.3.2 洗脫劑(乙醇)濃度對樹脂吸附性能的影響.102.3.3.3 洗脫劑的PH 對解吸的影響.102.3.4 動態試驗 .102.3.4.1 上樣液與裝柱量比例的確定 .102.3.4.2 洗脫劑用量的確定 .102.3.5 化學顯色法鑒定無梗五加果色素 .103 結果與分析 .103.1 無梗五加果色素提取條件的研究結果.103.1.1 提取劑種類的

10、選擇.103.1.2 提取劑PH 的篩選.113.1.3 浸提溫度對色素提取效果的影響.113.1.4 提取劑用量對色素提取效果的影響.123.1.5 浸提時間對色素提取效果的影響.123.1.6 正交試驗確定無梗五加果色素提取的最佳條件.123.2 最佳樹脂的確定 .133.3 靜態試驗 .143.3.1 PH 對 HPD600 樹脂吸附性能的影響.143.3.2 洗脫劑(乙醇)濃度對樹脂吸附性能的影響.143.3.3 洗脫劑的PH 對解吸的影響.153.4 動態試驗 .163.4.1 上樣液與裝柱量的比例確定 .163.4.2 洗脫劑用量的確定 .163. 5 化學顯色法定性鑒定無梗五加果

11、色素.174 結論.184.1 無梗五加果色素的提取條件.184.2 無梗五加果色素的純化條件.184.3 無梗五加果色素組分的初步分析.185 討論.185.1 影響大孔吸附樹脂純化植物化學成分的因素.18參考文獻.20致謝.21沈陽農業大學學士學位論文1摘要摘要刺五加具有人參樣作用，能調節中樞神經系統、增強機體免疫能力、抗疲勞、抗衰老，亦對內分泌系統及造血系統有顯著的藥理活性。長期以來，在東北地區，將無梗五加當作刺五加藥用，未見不良反應報道。為擴大藥用資源，無梗五加已引起國內外學者的濃厚興趣1。目前人們對五加根，莖，葉的研究十分多，但對五加果的研究卻很少，所以為了資源利用提供依據，尋找一種

12、安全可行且利用率高的天然色素作為食品添加劑 ，本實驗采用浸提法提取無梗五加果色素，采用大孔樹脂法來對無梗五加色素進行純化，并對其色素組分進行初步分析。結果表明無梗五加果色素浸提的最佳工藝條件為：50%的乙醇溶液50mL；pH值為3；20作為浸提溫度；浸提時間以90min為佳。HPD600型大孔樹脂對pH值為3的無梗五加果色素浸提液吸附率為79.178%，pH值1.5的60%乙醇可較好的洗脫色素。純化后的色素初步被鑒定為花色苷類。關鍵詞：關鍵詞：無梗五加；大孔樹脂；花色苷；提取無梗五加果色素提取及純化工藝研究2AbstractAcanthopanax senticosus has the rol

13、e of ginseng, which can adjust the central nervous system, enhance the ability of the immune, which is also anti-fatigue and anti-aging. It also on the endocrine system and the hematopoietic system has significant pharmacological activity. For a long time, in the northeast region, Acanthopanax sessi

14、liflorus were used as medical Acanthopanax senticosus. No adverse reactions were reported. For the expansion of medicinal resources, scholars at home and abroad have attracted great interest in Acanthopanax sessiliflorus1.Currently the roots, stems and leaves of Acanthopanax sessiliflorus were resea

15、rched more, but the fruit of Acanthopanax sessiliflorus was little. In order to provide the basis for the use of resources , find a safe and feasible and high utilization of the natural pigment as a food additive.This study use Extraction method from Acanthopanax sessiliflorus，and a method of macrop

16、orous resin to purify the pigment of Acanthopanax sessiliflorus and conducted a preliminary analysis of pigment components.Results show that the optimum conditions to extract Acanthopanax sessiliflorus are as follows:50 percent of the ethanol 50 mL; pH value of 3;20 as the temperature extraction;90

17、min time to extract better. Macroporous resin HPD600 is favorable in purification of the Acanthopanax sessiliflorus pigments: adsorption rate of pigments (solvent pH 3) to HPD600 resin is79.178%. 60% ethanol (pH1.5) is suitable for elution. And, the main components of the purified pigments are prima

18、rily identified as anthocyanin.Key words：Acanthopanax sessiliflorus；Macroporous resins；Anthocyanin；Extraction沈陽農業大學學士學位論文31 前言前言1.1 花色苷的研究概況花色苷的研究概況花色苷是最常見的天然色素之一，是我們日常飲食中不可缺少的組成部分。因為它們在自然界中分布廣泛，構成了植物王國中絕大多數品種的藍色、紅色、紫色和黃色等，是人們最熟悉的水溶性天然食用色素。最初使用花色苷名稱的人是Marguart(1835)，最早獲得花色苷結構的是Molish(1905)，花色素類最初是由L

19、. C. Marguart (1835)在處理矢車菊的藍色花時所命的名(希臘語antbos花+cyanos青)。此后，許多人致力于這方面的研究，其中貢獻最大的要算是Harbone等人。他得出了各類花色苷的紙層析的經典數據，并奠定了花色苷的鑒定中顏色反應和光譜特性的實驗基礎。此外，美國的Wrollod、日本的安田齊、臺灣的蔡正宗等也長年從事這一領域的研究，并形成許多寶貴的資料。花色苷是由花色苷配基(苷元)與糖鍵合形成的一種多酚類物質。現已查明，天然花色苷配基的基本結構為3, 5, 7三羥基2苯基苯并吡喃，是黃烊鹽離子上不同位置被不同數目的游離羥基或甲氧基取代而形成的。如圖1所示：圖圖1 2苯基苯

20、并吡喃陽離子苯基苯并吡喃陽離子到目前為止，總共有17種已知的天然花色素或糖苷配基。每種花色素常根據最先分離得到它們的植物的名稱來命名。在高等植物中，有6種花色素比較普遍2(如表1所示)。無梗五加果色素提取及純化工藝研究4表表1 6種主要花色素種主要花色素結構編號英文簡稱英文全稱中文名稱R1R2主要來源顏色1PgPelargonidin天竺葵色素HH草莓、蘿卜皮深紅2PnPeonidin芍藥色素OCH3H芒果、櫻桃藍紅3CyCyanidin矢車菊素/花青素OHH桑椹、蘋果皮藍紅4MvMalvidin錦葵色素OCH3OCH3葡萄皮紫5PtPetunidin矮牽牛色素/碧冬茄素OHOCH3葡萄皮紫藍

21、6DpDelpHinidin飛燕草素/花翠素/翠雀素OHOH石榴、茄子紫藍花色苷顏色受介質pH值影響較大，隨pH值變化而改變，其原因是花色苷結構中吡喃雜環上的氧原子為四價，使得表現出某些堿性性質，而本身又含有酚羥基又具有某些酸的性質，因此在酸、堿作用下，花色苷化學結構發生變化。近20多年來，花色苷的抗氧化作用開始引起人們的注目，其在生物體內的各種功能研究逐漸成為熱門焦點。由于色素的出色功能，目前還專門出現一門稱為“色素營養學”學科，主要研究植物色素(Phytopigments)的營養生理功能，此為花色苷的開發以及利用發揮了積極作用。根據醫食同源/藥食同源的原則，通過攝入一定量的植物色素，在生物

22、體內起到一定調節生理功能作用，此正是人們所期待的。由WHO/FAO組成的食品添加劑聯合專家委員會(IECFA)考查了花色苷的毒理學資料，結論是“毒性很低”。唯一的負面作用是使一些動物器官(肝、腎上腺、甲狀腺)的重量和體重下降。1982年確定其人體ADI值(每日允許攝入劑量)為02.5mg/kg體重。花色苷廣泛存在于開花植物(被子植物)中，據初步統計，27個科、73個屬植物中含花色苷3。現在，天然色素的開發與應用發展很快，不少天然色素是綜合利用的產物。如從紅葡萄酒廠的廢渣中提取紅葡萄色素，從高粱殼中提取高粱紅色素，從黑米中提取黑米紅。葡萄皮是花色苷類色素的主要原料。這些商業用色素在食品中用量0.

23、5%5%，也用于化妝品，如紅色花色苷做口紅。據估計，目前全世界每年有9.4億美元的食品色素市場貿易額，其中天然色素及天然來源色素合計4.39億美元，接近總貿易額的一半。隨著消費者對純天然食品的興趣日沈陽農業大學學士學位論文5益增加，天然色素的市場份額迅速增加。據預測，未來幾年天然色素每年將以5%10%的速度增加。當前，國外的食品著色劑大多以天然色素為主，合成色素為輔；而國內的天然食用色素研究起步較晚，目前尚處于天然色素與合成色素并存的狀況。但我國已把開發天然食用色素作為發展食品添加劑的一個重要方向，天然色素開發也較快：近十年來，我國批準使用的天然著色劑從20多種增加到40多種，是目前世界上批準

24、天然著色劑最多的國家。1990年我國合成色素的產量約為800噸，而食用天然色素的產量約達10000噸4(其中焦糖色素7000噸)：目前在中國生產食用天然色素的工廠百余家，1998年產量已達25000噸。2003年全國著色劑約為6.65萬噸，其中合成色素約2400噸，其余皆為天然色素。而僅國家“七五”重點科技攻關項目就開發了4種天然食用色素新產品。可以肯定，憑借豐富的天然資源和國家政策支持，我國的天然食用色素研究今后必將迅速發展。1.2 花色苷類天然植物色素的純化方法花色苷類天然植物色素的純化方法1.2.1 離子交換樹脂柱層析離子交換樹脂柱層析離子交換樹脂柱層析(ion exchange chr

25、omatography，簡稱IEC)是從復雜的混合物中，分離性質相似的大分子的一種方法。自1935年Adams和Holmes成功地研制了酚醛型離子交換樹脂以來，離子交換樹脂的應用已經歷了60多年的發展歷史。各種類型離子交換樹脂的相繼出現，應用技術的不斷改善，應用范圍的日益擴大，都顯示了離子交換樹脂所具備的優越性和發展潛力。目前，離子交換樹脂已由最初在水處理工業中的應用，延伸到化工、電力、電子、環境科學、濕法冶金、分析化學、食品加工和醫療藥物等領域中，形成一個獨特的化工操作單元。離子交換樹脂是能在水溶液中交換離子的固體，其巨大分子可以分成兩部分：一部分是不能移動的多價高分子基團，構成樹脂的骨架，

26、不溶于酸、堿和有機溶劑，化學穩定性良好；另一部分是可移動的離子，稱為活性離子，它在樹脂骨架中進進出出，發生離子交換現象。例如將葡萄皮浸出的花色苷紅色素浸提濃縮液，用磺酸型陽離子交換樹脂進行純化，可除去其中的糖和有機酸化合物等雜質，使色素產品得以純化，并提高了色素產品的穩定性。1.2.2 大孔樹脂分離大孔樹脂分離大孔樹脂(macro-reticular resin)又稱全多孔樹脂，是網狀骨架結構中既存在小于5nm的微孔，又存在大于5nm乃至數十nm大孔的樹脂。它是在聚合反應過程中加入惰性溶劑，此惰性溶劑對共聚物具有惰性，而對單體苯乙烯和二乙烯基苯又具有良好的溶解性。在聚合過程中，由于惰性溶劑的存

27、在，形成的共聚物顆粒內會產生相分離，最終在樹脂骨架內形成大孔結構。體積較大的分子也能進入樹脂的孔結構內部而接近無梗五加果色素提取及純化工藝研究6離子交換樹脂的功能基團，適合大分子的分離。其交換容量既可以很低，也可以很高。這類不含離子基團的網狀結構高分子聚合物吸附劑，具有吸附性強，解吸附容易，機械強度好，可反復使用和流體阻力小等優點。早期在廢水處理、維生素、抗生素分離純化方面應用較多5 。大孔樹脂吸附技術是上世紀七十年代發展起來的一種新工藝，近幾年國內用大孔樹脂分離提取天然色素的研究較多。就是將溶液通過大孔樹脂，吸附其中的有效成分，再經洗脫回收，除掉雜質的一種純化精制方法。大孔樹脂的優點是：第一

28、，經大孔樹脂吸附技術處理后得到的精制物可使有效成分高度富集，雜質少，能提高提取物的質量和水平。如人參莖葉中也含人參皂甙，可以提取出來作為藥用。但含量低，用一般方法提取麻煩，而用大孔樹脂吸附技術提純后人參皂甙含量可達70%以上，很方便。第二，減小產品的吸潮性。經大孔樹脂吸附技術處理后，可有效地去除色素中大量的糖類、無機鹽、粘液質等吸潮成分，增強產品的穩定性。第三，大孔樹脂吸附技術能縮短生產周期，所需設備簡單；免去了靜置沉淀、濃縮等耗時多的工序；節約包裝，降低成本。1.2.3 其他其他純化方法純化方法近年來，國外研究者對采用另外一些方法分離花色苷進行了探索。(1) 高速逆流色譜HSCCC是近20年

29、發展起來的一種不用任何固態載體或支撐體的液-液分配色譜技術，其基本原理是利用樣品在兩相中分配系數的不同實現分離。與傳統分析方法相比，HSCCC具有分離效率高，產品純度高，不存在載體對樣品的吸附和粘染，制備量大和溶劑消耗量少等優點。Michael S6等采用HSCCC分離分析了接骨木果汁中的花青素，溶劑系統為正丁醇-TBME-乙氰-水，體積比3:1:1:5，流速5.0mL/min。夏明等7用HSCCC對提取得到的紅曲色素進行分離，溶劑系統為石油醚-甲醇-乙酸乙酯-水，體積比3:6:5:4，流速1.0mL/min，將一種黃色素與一種紫紅色素分離。(2)毛細管區帶電泳Ruben Saenz-Lope

30、z等8首次提出了在酒樣品中采用毛細管區帶電泳(CZE)法定量花色苷，研究了花色苷在堿性媒介中采用該方法分析的可行性。結果發現花色苷在堿性媒介中比在酸性媒介中更能被快速分離，CZE方法的結果可以和HPLC相比較。跟HPLC相比，CZE表現出較好的靈敏性、重復性和精確性。此外，有最短的裝置時間，減少了成本以及試劑的用量，能在更短的分析時間內得到較好的分離效果。因此，對于定量分析酒中的花色苷，CZE是一種有效的方法。1.3 無梗五加的研究概況無梗五加的研究概況無梗五加(Acanthopanax sessiliflorus)為五加科五加屬植物，生于海拔 2001600m的森林灌木叢中。分布于東北、華北

31、、陜西等地。在山地、溪流兩岸、丘陵坡地、林沈陽農業大學學士學位論文7緣及灌木叢中也有生長。其根皮為五加皮，始載于神農本草經 ，列為上品。五加科主要的藥用植物有刺五加、人參、西洋參、三七、竹節參等。刺五加具有人參樣作用，能調節中樞神經系統，增強機體免疫能力，抗疲勞，抗衰老，亦對內分泌系統及造血系統有顯著的藥理活性。由于長期以來，在東北地區，將無梗五加當作刺五加藥用，未見不良反應報道。為擴大藥用資源，無梗五加引起了國內外學者的濃厚興趣，他們對其化學成分及藥用活性進行了深入且系統的研究1。目前已經研究了解到，可以從無梗五加中分離得到苷類成分(強心苷9、胡蘿卜苷即刺五加苷10、刺五加苷類化合物11、三

32、萜皂苷12)、木脂素13(芝麻素和灑維寧)、甾體類化合物14(豆甾醇，菜油甾醇和 -谷甾醇)、脂肪酸類化合物和多糖類1。本草記載：無梗五加的根皮即五加皮具有祛風濕、補肝腎、強筋骨 、活血脈等功效、用于治療風寒濕痹、腰膝疼痛、筋骨凄軟、小兒行遲、體虛嬴弱等病癥15。隨著對無梗五加的進一步開發和利用，現在人們用無梗五加制劑治療白細胞減少癥16、眩暈癥17，及婦女更年期綜合征18。由此可見，無梗五加的藥理學有了更進一步的研究，現概述如下：(1)抗炎鎮痛作用：無梗五加對大鼠角叉菜膠、蛋清、甲醛有顯著抑制作用，對熱燙性足腫脹、巴豆油氣囊腫的肉芽組織增生及滲出物均有顯著抑制作用，對急慢性炎癥也有明顯抑制作

33、用，能明顯抑制佐劑性關節炎，示其為治療關節炎的良好藥物，同時也證明它有免疫抑制作用。(2) 抗應激作用：無梗五加能非常顯著地提高小鼠在低壓缺氧條件下的存活率，明顯延長其游泳時間；能非常顯著地增強異戊巴比妥鈉促睡眠時間，其作用與刺五加相似，甚至強于刺五加19。(3) 解熱鎮痛作用：對小鼠腹腔注射無梗五加醇提物，能起到明顯的解熱鎮痛作用，與嗎啡相似，但作用較嗎啡緩和。(4) 對心血管的作用：無梗五加乙醇提取物的未脫脂制劑對離體蟾蜍心臟有明顯的抑制作用，使蟾蜍在位心臟幅度減小；還可使麻醉兔的血壓下降，并能降低家兔血管的通透性。(5) 其它作用：無梗五加對家兔離體腸及子宮均有興奮作用1。1.4 本文研

34、究內容及目標本文研究內容及目標無梗五加具有如此多的功效，目前人們對五加根、莖、葉的研究十分多，但對五加果的研究卻很少，而且天然食用色素越來越被人們重視并加以利用。所以為了資源無梗五加果色素提取及純化工藝研究8利用提供依據，尋找一種安全可行且利用率高的天然色素作為食品添加劑。故本課題以無梗五加果為原料，對其色素的浸提工藝及在大孔樹脂上的吸附和解吸特性進行了研究，并對純化的無梗五加果色素的組成進行了初步定性分析，結果可為無梗五加果色素的開發利用和工業生產提供參考20。沈陽農業大學學士學位論文92 材料和方法材料和方法2.1 試驗材料試驗材料無梗五加(Acanthopanax sessiliflor

35、us)粉末(沈陽農業大學果蔬實驗室提供)2.2 試驗試劑試驗試劑95%乙醇，無水乙醇，鹽酸，乙酸乙酯，蒸餾水大孔吸附樹脂：HPD400、HPD450、HPD600、HPD700、HPD750(滄州寶恩化工廠生產)氨水，碳酸鈉溶液，98%的濃硫酸，鹽酸，鎂粉2.3 試驗方法試驗方法2.3.1 無梗五加果色素提取條件的研究無梗五加果色素提取條件的研究將0.5g干燥無梗五加果粉末放入三角瓶中，加入一定體積的提取劑，密封好后于一定溫度水浴中浸提，將提取液過濾，收集濾液即制得色素提取液。于400800nm波長范圍內進行掃描，測定不同種類提取劑提取無梗五加果色素的最大吸收波長并觀察色素提取液的顏色，以確定

36、提取劑種類。將色素提取液定容至相同體積，以色素提取液的吸光度為考察指標，進行浸提溫度、提取劑用量及浸提時間的篩選，并在此基礎上，進行正交試驗，確定色素浸提的最佳工藝。2.3.2 最佳樹脂的選擇最佳樹脂的選擇準確稱量樹脂各0.5g和20mL供試液(濃度為30%的色素溶液)，置于三角瓶中，放在全溫振蕩培養箱中(轉速130r/min)，24h后取出。過濾，調波長為520 nm，測濾液的吸光度A1，記錄。用95%的乙醇10mL洗脫濾出的樹脂，放置24h后過濾，測A2。根據吸附與解吸的結果，確定最佳樹脂。吸附率按式(1)計算，解吸率按式(2)計算20X(A0-A1)/A0 100 _(1)YA2/ (A

37、0-A1) 100 _(2) 其中X吸附率，%；Y解吸率，%；A0吸附前樣品吸光度；A1吸附后樣品吸光度；A2解吸后樣品吸光度。2.3.3 靜態試驗靜態試驗2.3.3.1 pH 對樹脂吸附性能的影響準確量取5份調至不同pH值的20mL供試液，測其吸光度。分別加入盛有0.5g活化樹脂的50mL燒杯中，于室溫下靜置吸附2h后，測定上清液的吸光度并折算成吸附率。確定吸附最佳pH值。無梗五加果色素提取及純化工藝研究102.3.3.2 洗脫劑(乙醇)濃度對樹脂吸附性能的影響準確稱取5份0.5g飽和樹脂，分別加入不同濃度的乙醇溶液20mL，于室溫下靜置解吸2h后，測定上清液的吸光度(分別以相對應的乙醇溶液

38、作參比)。確定洗脫劑(乙醇)濃度對解吸的影響。2.3.3.3 洗脫劑的 pH 對解吸的影響準確稱取5份0.5g飽和樹脂，分別加入調至不同pH值最佳濃度的乙醇溶液20mL，于室溫下靜置吸附2h后，測定上清液的吸光度(分別以相對應的乙醇溶液作參比)。確定洗脫劑(乙醇)的pH值對解吸的影響。2.3.4 動態試驗動態試驗2.3.4.1 上樣液與裝柱量比例的確定準確量取5g活化樹脂裝柱，將色素以確定的流速1mL/min加入樹脂，定量測定流出液的吸光度，確定適宜的上樣液與裝柱量的比例。2.3.4.2 洗脫劑用量的確定準確量取5g活化樹脂裝柱，將色素以確定的流速1mL/min加入樹脂，用最佳洗脫劑以同樣的流

39、速洗脫，定量測定流出液的吸光度，確定洗脫劑的用量。2.3.5 化學顯色法鑒定無梗五加果色素化學顯色法鑒定無梗五加果色素通過花色苷類化合物的顯色反應，如色素在可見光和紫外光下的自然顯色，以及發生的一些還原反應和與堿性試劑的顯色反應，可初步鑒定無梗五加果色素的組成。顯色反應現象見表2。表表2 花色苷類化合物的顯色反應花色苷類化合物的顯色反應氨定性方法可見光下紫外光下可見紫外碳酸鈉濃硫酸鹽酸鎂粉反應現象粉紅橙或紅紫暗紅藍色淺藍藍色黃橙紅褪為粉紅3 結果與分析結果與分析3.1 無梗五加果色素提取條件的研究結果無梗五加果色素提取條件的研究結果3.1.1 提取劑種類的選擇提取劑種類的選擇沈陽農業大學學士學

40、位論文11表表3 無梗五加果色素在不同溶劑中的提取效果無梗五加果色素在不同溶劑中的提取效果溶劑50%乙醇70%乙醇95%乙醇蒸餾水甲醇乙酸乙酯無水乙醚石油醚max540540410540440410540410A1.4610.351.20.350.450.80.14顏色紅紅棕黃暗紅棕褐黃綠淺黃綠淺黃注：提取條件：溶劑用量 50mL，提取溫度 20，提取時間 2h.由表 3 可知，在提取條件一定的條件下，無梗五加果色素在不同溶劑中的提取效果并不相同。其中以 50%乙醇、70%乙醇、蒸餾水提取效果較好，提取液最大吸收波長均為 540nm，顏色為紅色或暗紅色，與無梗五加果顏色接近。三者之中，以 50

41、%乙醇為溶劑提取色素顏色最鮮艷，而且吸光度最大，因此，本實驗選取 50%乙醇作為無梗五加果色素提取溶劑。3.1.2 提取劑提取劑 pH 的篩選的篩選表表4 提取劑提取劑pH的篩選的篩選pH135791113max525528530593550650655A2.0571.9481.3150.8860.7190.250.102顏色紅紅紅灰黑黑褐咖啡色棕黃注：提取條件：提取劑 50%乙醇，溶劑用量 50mL，提取溫度 20，提取時間 2h.由表 4 可知，不同 pH 的 50%乙醇提取無梗五加果色素的效果不同。所考察的 pH以 1、3、5 為佳。其中以 pH 為 1 的 50%乙醇提取效果最好，所得

42、色素溶液顏色最鮮艷，吸光度最大，但其 pH 過低，容易造成原料中其它成分的破壞而影響原料的綜合利用，考慮 pH 為 3 的 50%乙醇溶液提取效果與其接近，因此，實驗選取 pH 為 3 的 50%乙醇作為最終的提取劑，此條件下獲得的色素溶液其最大吸收波長為 528nm。3.1.3 浸提溫度對色素提取效果的影響浸提溫度對色素提取效果的影響表表5 浸提溫度對色素提取效果的影響浸提溫度對色素提取效果的影響溫度()20406080100A5282.6012.5812.6252.6222.620顏色紅紅紅紅紅注：提取條件：提取劑 pH 為 3 的 50%乙醇，溶劑用量 50mL，提取時間 2h.無梗五加

43、果色素提取及純化工藝研究12由表 5 可以看出，隨浸提溫度的提高，提取液顏色無明顯變化。吸光度測定結果表明，隨浸提溫度的提高，提取液的吸光度減小，當升高到 60，吸光度達到最大，溫度繼續提高，吸光度基本不變。考慮到隨浸提溫度提高，提取液粘性增加，不利于過濾，因此，本實驗選取 20作為浸提溫度進行后序提取劑用量和提取時間的篩選。3.1.4 提取劑用量對色素提取效果的影響提取劑用量對色素提取效果的影響表表6 提取劑用量對色素提取效果的影響提取劑用量對色素提取效果的影響提取劑用量(mL)30507090110A5282.5802.5942.4072.1001.955注：提取條件：提取劑 pH 為 3

44、 的 50%乙醇，浸提溫度 20，提取時間 2h.由表 6 可知，隨提取劑用量的增加，提取液吸光度增大，提取液用量達到 50mL時，提取液吸光度達到最大，繼續增加提取劑用量，提取液吸光度減小。因此，確定提取劑最佳用量為 50mL。3.1.5 浸提時間對色素提取效果的影響浸提時間對色素提取效果的影響表表7 浸提時間對色素提取效果的影響浸提時間對色素提取效果的影響時間(min)10306090120A5282.5652.5652.5922.6112.575注：提取條件：提取劑 pH 為 3 的 50%乙醇，溶劑用量 50mL，浸提溫度 20.由表 7 可知，隨浸提時間的延長，提取液吸光度增大，當提

45、取時間達到 90min 時，提取液吸光度達最大，繼續延長浸提時間，提取效果下降。所以浸提時間以 90min 為佳。3.1.6 正交試驗確定無梗五加果色素提取的最佳條件正交試驗確定無梗五加果色素提取的最佳條件由表 8 可以看出，所考察的三個因素對無梗五加果色素提取效果的影響由大到小依次為：提取劑用量、浸提溫度、浸提時間。提取劑用量對色素提取效果影響最大。正交試驗結果表明，無梗五加果色素提取的最佳條件為 A3B1C2，即浸提溫度 60，提取劑用量 30mL(即料液比 1:60)，浸提時間 60min。沈陽農業大學學士學位論文13表表8 無梗五加果色素提取的正交試驗無梗五加果色素提取的正交試驗試驗號

46、A 浸提溫度()B 提取劑用量(mL)C 浸提時間(min)吸光度(A)120(1)30(1)30(1)2.733220(1)60(2)60(2)2.671320(1)90(3)90(3)2.372440(2)30(1)60(2)2.712540(2)60(2)90(3)2.692640(2)90(3)30(1)2.441760(3)30(1)90(3)2.719860(3)60(2)30(1)2.671960(3)90(3)60(2)2.520K17.7768.1647.845K27.8458.0347.903K37.917.3337.783k12.5922.7212.615k22.6152

47、.6782.634k32.6372.4442.594R0.0450.2770.04注：提取劑 pH 為 3 的 50%乙醇.3.2 最佳樹脂的確定最佳樹脂的確定大孔吸附樹脂的篩選結果見表 9。由表 9 可以看出：HPD450、HPD600 和 HPD700都具有較大的吸附率，且 HPD450 的解吸率更高，受試驗條件所限，本試驗選用HPD600 作為篩選后的最佳樹脂。無梗五加果色素提取及純化工藝研究14表表9 不同樹脂對色素的吸附和解吸效果不同樹脂對色素的吸附和解吸效果樹脂類型HPD400HPD450HPD600HPD700HPD750吸附率(%)80.1586.2687.0286.0142.

48、24解吸率(%)82.2296.1780.1284.7981.333.3 靜態試驗靜態試驗3.3.1 pH 對對 HPD600 樹脂吸附性能的影響樹脂吸附性能的影響無梗五加果色素在 pH 值 15 范圍內溶液顏色最鮮艷，吸光度最大，故研究 pH值在 15 范圍內樹脂對色素的吸附。由表 10 可見，樹脂在 pH 值 3.0 時對色素吸附率較高，而 pH 值 1.0 時吸附率較低，因此 pH 值 3.0 利于色素吸附，定為吸附的最佳 pH值。表表10 不同不同pH值條件下值條件下HPD600對色素的吸附對色素的吸附pH值吸附前吸光度值吸附后吸光度值吸附率%1.00.4610.15267.0281.

49、50.4490.14667.4832.00.4450.13769.2132.50.3930.09176.8453.00.3650.07679.1795.00.3670.07978.4743.3.2 洗脫劑洗脫劑(乙醇乙醇)濃度對樹脂吸附性能的影響濃度對樹脂吸附性能的影響洗脫劑都具有使大孔樹脂溶脹，減弱吸附物質與樹脂之間的吸附力的作用，并可溶解被吸附物質。常用的洗脫劑是低級醇、酮或其水溶液，如甲醇、乙醇、丙醇和丙酮，考慮到食品生產安全性等方面的要求，本試驗使用乙醇作為洗脫劑21。由圖 2 可知，隨乙醇濃度增大，色素洗脫量呈現先增大后減小的趨勢，故乙醇濃度為 60%時，對無梗五加果色素的洗脫效果最

50、好。沈陽農業大學學士學位論文150102030405060705060708090乙醇濃度(%)解吸率(%)圖圖2 乙醇濃度對解吸的影響乙醇濃度對解吸的影響3.3.3 洗脫劑的洗脫劑的 pH 對解吸的影響對解吸的影響由于無梗五加果色素在 pH 值 15 范圍內溶液顏色最鮮艷，吸光度最大，故研究pH 值在 15 范圍內洗脫劑的 pH 對解吸的影響。由圖 3 可知，在 pH 值為 1.5 時，解吸率最大，為峰值，故選用 pH 值為 1.5 的乙醇作為最佳洗脫劑。405060708011.522.533.55pH值解吸率(%)圖圖3 洗脫劑的洗脫劑的pH對解吸的影響對解吸的影響無梗五加果色素提取及純

51、化工藝研究163.4 動態試驗動態試驗3.4.1 上樣液與裝柱量的比例上樣液與裝柱量的比例確定確定隨上樣量的增加，經大孔樹脂吸附后的流出液的吸光度逐漸增大，即流出液中色素含量增加。當達到一定值時，吸光度趨于不變。由圖 4 可知，當上樣液為 50mL 時，大孔樹脂達到飽和，即上樣液與樹脂用量比例為 10:1 時，樹脂對色素的吸附率最高，達到 96.32%。因此，試驗確定二者用量比例為 10:1。0.140.150.160.170.180.190.20.210.22102030405060708090100上樣量 (mL)吸光度A圖圖4 上樣液與裝柱量的比例上樣液與裝柱量的比例3.4.2 洗脫劑洗

52、脫劑用量的確定用量的確定采用體積分數 60%的乙醇進行解吸，由圖 5 可知，當用量達到 70mL 時色素基本上被洗脫下來。沈陽農業大學學士學位論文1700.050.10.150.20.250.30.35102030405060708090100上樣量(mL)吸光度A圖圖5 洗脫劑與裝柱量的比例洗脫劑與裝柱量的比例3. 5 化學顯色法定性鑒定無梗五加果色素化學顯色法定性鑒定無梗五加果色素經過花色苷類化合物的顯色反應做出的結果見表11。表表11 花色苷類化合物的顯色反應花色苷類化合物的顯色反應定性方法定性反應現象試驗結果結論可見光下粉紅橙或紅紫紅紫+紫外光下暗紅至棕暗紅+可見藍色藍色+氨紫外淺藍淺

53、藍+碳酸鈉藍色藍色+濃硫酸黃橙黃橙+鹽酸鎂粉紅褪為粉紅紅褪為粉紅+注： “+”代表反應呈陽性.由表 11 可知，反應均呈陽性，故可以初步確定無梗五加果色素為可溶性花色苷類。無梗五加果色素提取及純化工藝研究184 結論結論4.1 無梗五加果色素的提取條件無梗五加果色素的提取條件研究表明：無梗五加果色素在不同條件下其提取效果不同，提取劑種類為50%的乙醇溶液；pH為3；20作為浸提溫度；提取劑最佳用量為50mL；浸提時間以90min為佳。滿足以上條件的提取劑為無梗五加果色素的最優提取劑。4.2 無梗五加果色素的純化條件無梗五加果色素的純化條件在進行篩選的5種樹脂中，HPD600對色素的吸附量大，吸

54、附率高，易解吸，是一種理想的色素吸附劑，適宜于對色素的提取分離。HPD600對無梗五加果色素的最佳純化工藝條件為：原料濃度30%，pH值為3,上樣液與裝柱量的最佳比例10:1(mL:g)，控制流速為1mL/min；最優洗脫條件為：以70mL體積分數為60%，pH為1.5的乙醇解吸。4.3 無梗五加果色素組分的初步分析無梗五加果色素組分的初步分析通過花色苷類化合物的顯色反應，可看出其顯色反應結果與花色苷類色素的顯色反應結果一致，故可以初步確定無梗五加果色素屬于水溶性花色苷類。5 討論討論5.1 影響大孔吸附樹脂純化植物化學成分的因素影響大孔吸附樹脂純化植物化學成分的因素影響樹脂吸附的因素很多，主

55、要有被分離成分的性質(極性和分子大小等)、上樣溶劑的性質(溶劑對成分的溶解性、鹽濃度和pH值)、上樣液濃度及吸附流速等。通常，極性較大分子適用中極性樹脂上分離，極性小的分子適用非極性樹脂上分離；體積較大化合物選擇較大孔徑樹脂；上樣液中加入適量無機鹽可以增大樹脂吸附量；酸性化合物在酸性溶液中易于吸附，堿性化合物在堿性液中易于吸附，中性化合物在中性液中吸附；一般上樣液濃度越低越利于吸附；對于滴速的選擇，則應保證樹脂可以與上樣液充分接觸吸附為佳。影響解吸條件的因素有洗脫劑的種類、濃度、pH值、流速等。洗脫劑可用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等，應根據不同物質在樹脂上吸附力的強弱選擇不同的洗脫劑和不同的洗

56、脫劑濃度進行洗脫；通過改變洗脫劑的PH值可使吸附物改變分子形態，易于洗脫下來；洗脫流速一般控制在0.55mL/min。工業上，樹脂柱經反復使用后，樹脂表面及內部殘留許多非吸附性成分或雜質使柱顏色變深，柱效降低，因而需要再生，一般用95%乙醇洗至無色后用大量水洗即可。總之，吸附條件和解吸附條件的選擇直接影響著樹脂吸附工藝的好壞，因而，實沈陽農業大學學士學位論文19驗中應綜合考慮各種因素，確定最佳吸附解吸條件。無梗五加果色素提取及純化工藝研究20參考文獻參考文獻1 淳于家龍,郭麗娜,張長順.無梗五加化學成分與藥理活性的研究進展J.中國藥業2002,11(12):73-74.2 龐志申.花色苷研究概

57、況.北京農業科學.2000,18(5):37-42.3 袁海波,童華榮.天然食用色素花青素應用研究進展,廣州食品工業科技,17(3):75-77.4 楊虎清,黃素娟.食品色素的過去、現在和未來中國食品添加劑.2002(3):10-14.5 鐘瑞敏.葡萄花色苷優化提取和純化工藝研究.韶關大學學報1995,12(8):113-121.6 Michaels,Silke H.Application of hish-speed counter current chromatography to the large scale isolation of anthocyaninsJ.Biochemical Engineering Journal,2003,14:179-189.7 夏明,杜琪珍.高速逆流色譜提取分離紅曲色素的研究.廣州食品工業科技,2002,18(4):15-17.8 Michael Schwarz,Silke Hillebrand,Saskia Habben.Andreas Degenhardt,Peter Winterh