1、流式細胞術在臨床上的應用流式細胞術在臨床上的應用深圳市人民醫院臨床醫學研究中心深圳市人民醫院臨床醫學研究中心 李富榮李富榮 第一部分 流式細胞儀（fcm)）工作原理fcmfcm系統結構系統結構流體系統：樣本流、鞘液流體系統：樣本流、鞘液光學系統：激光光源、分光鏡、濾片、光學系統：激光光源、分光鏡、濾片、 散射光和熒光探測器散射光和熒光探測器分選系統：壓電晶體、液流成滴、加電分選系統：壓電晶體、液流成滴、加電 系統、偏轉系統系統、偏轉系統數據處理系統：計算機工作站數據處理系統：計算機工作站fcmfcm工作原理流程：工作原理流程：樣本（血液實體組織）單細胞懸液熒光染料特異染色的樣本上機細胞單列通過

2、測量區1.散射光信號2.熒光信號分離、收集、分析、光信號細胞理化特性分析圖加入熒光染料激光激發流式細胞儀的構造及原理流式細胞儀的構造及原理fcmfcm測量光信號獲取與分析測量光信號獲取與分析散射光信號前向散射光(fsc)-細胞大小側向散射光（ssc)-細胞粒度（膜的粒度、核大小與粒度、胞質數量）fsc信號越大，表明細胞體積越大；反之，則越小。ssc信號越大，表明細胞粒度越大；反之，則越小。根據根據fsc-sscfsc-ssc二維點圖，可以容易區分二維點圖，可以容易區分lym(r3)granlym(r3)gran(r1)(r1)與與mono(r2)mono(r2)r1r2incident lig

3、ht sourceright angle light dectector a cell complexityforward light detector a cell surface arear3r2r1根據根據fsc-sscfsc-ssc二維點圖，可以容易的區分出二維點圖，可以容易的區分出lym(r3) .granlym(r3) .gran(r1)(r1)與與mono(r2)mono(r2)流式細胞術常用染料及檢測波長流式細胞術常用染料及檢測波長熒光染料的發射不同波長熒光染料的發射不同波長dna dna 和和rnarna熒光探針的理化特性熒光探針的理化特性熒光探針熒光探針 分子量分子量 結合

4、方式結合方式 堿基特異性堿基特異性 激發鋒（激發鋒（nm) nm) 發射鋒發射鋒( (nm)nm)p1 668 p1 668 嵌入嵌入 無無 493 630493 630eb 394 eb 394 嵌入嵌入 無無 482 616482 616mi 1069 mi 1069 非嵌入非嵌入 g-c 320,445 575 g-c 320,445 575 ca3 1183 ca3 1183 非嵌入非嵌入 gc 320,445 575 gc 320,445 575 ho33258 624 ho33258 624 非嵌入非嵌入 at 343 480 at 343 480 ho33342 615 ho33

5、342 615 非嵌入非嵌入 at 343 455at 343 455dapi 350 dapi 350 非嵌入非嵌入 at 540 650at 540 6507-aad 1270 7-aad 1270 嵌入嵌入 gc 540 655 gc 540 655 ao 370 ao 370 嵌入嵌入 ( (雙鏈）雙鏈） 無無 492 530492 530 靜電（單鏈）靜電（單鏈） 640640py 303 py 303 嵌入嵌入 ( (雙鏈）雙鏈） gcat 549-562 565-574gcat 549-562 565-574 靜電（單鏈）靜電（單鏈）細胞周期分析細胞周期分析通過熒光探針對細胞周期

6、進行相對通過熒光探針對細胞周期進行相對dnadna含量的測定，可分析細含量的測定，可分析細胞周期各時期的百分比，周期動力參數及胞周期各時期的百分比，周期動力參數及dnadna異倍體異倍體g1sg2gom分選系統（分選系統（sorting)sorting)依據流式細胞術測定的細胞參數可分選所需細胞群體：依據流式細胞術測定的細胞參數可分選所需細胞群體：電荷式分選電荷式分選穩定液流測量區液滴形成液滴充電液滴偏轉分選收集邏輯電路電荷式分選電荷式分選通道式分選通道式分選穩定液流測量區邏輯電路捕獲管分選收集 第二部分第二部分 流式細胞術在臨床醫學中的應用流式細胞術在臨床醫學中的應用流式臨床應用流式臨床應用

7、淋巴細胞亞群分析淋巴細胞亞群分析th1/th2 腫瘤學腫瘤學hla-b27pnh 四聚體四聚體血小板活化血小板活化 細胞凋亡細胞凋亡 移植免疫移植免疫常常用用淋淋巴巴細細胞胞亞亞群群報報告告模模式式r深圳深圳市人市人民醫民醫院流院流式細式細胞術胞術報告報告單模單模式式hla-b27通過cd3pevsssc設門，圈定cd3陽性細胞（t淋巴細胞），檢測其b-27的平均熒光強度。如標本的平均熒光強度小于標準微球熒光強度則為陰性，反之為陽性。 th1/th2細胞 腫瘤學腫瘤學 細胞凋亡細胞凋亡 移植免疫移植免疫 四聚體四聚體tetramer-原理原理內源性抗原內源性抗原外源性抗原外源性抗原tetram

8、er-原理原理mhc class i-hla-a2tetramer-原理原理tetramer-原理原理國外醫學免疫學分冊 2001；24(2):102-105hla class i 限定性腫瘤抗原肽限定性腫瘤抗原肽抗原特異性抗原特異性ctl的分析方法的分析方法51cr釋放實驗釋放實驗pcr法法酶聯免疫斑點法酶聯免疫斑點法(elispot)擴增特異t淋巴細胞受體tetramer法法間接法需大量的特異性ctls作為效應細胞需體外擴增，周期長，敏感性低， 費時費力難以廣泛應用敏感性高但只能用于已知tcr基因型的特異性ctls檢測直接法敏感性高不受tcr基因型的限制有限稀釋法有限稀釋法(lda)用用t

9、etramer法研究表明，外周血中僅有法研究表明，外周血中僅有0.2-2.5% 的的cd8+細胞對細胞對cmv和和ebv特異特異tetramer法法doherty pc.the numbers game for virus-specific cd8+t cellsj. science,1998,280:227了解病毒特異性ctl和記憶性ctl方面的一項革命檢測病毒特異性cd8細胞的金標準(gold standard)tetramer-應用應用感染性疾病感染性疾病hiv-aids, ebv, cmv, hpv, hbv, hcv, influenza, measles, malaria, tb

10、and rsvbreast, prostate, melanoma, colon, lung, cervical, ovarian and leukemiadiabetes, lyme disease, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, autoimmune vitiligoebv and cmv 移植移植 自身免疫性疾病自身免疫性疾病腫瘤腫瘤感染性疾病感染性疾病tetramer-應用應用-例證例證含有hiv-i型病毒包膜肽等三種抗原肽：hiv特異性ctl數量與血漿中rna病毒量有明顯的負相關，而與產毒性感染細胞的清除率無關慢性hcv感染患者的

11、特異性ctls數量明顯少于急性hcv感染和已康復患者用黑色素瘤抗原誘導潛在的腫瘤特異性t細胞用tetramer分離，富集gvhd(移植物抗宿主反應)：受體與供體的次要組織相容性抗原(mhags)的不同引起，在骨髓移植后早期出現(14天內)，造成骨髓移植失敗-hla-mhags肽四聚體監測mhags特異性ctl，以了解對gvhd的臨床治療效果hla-a2/pp65 tetramer監測腎移植患者感染cmv后的免疫應答能力 移植移植腫瘤腫瘤 第三部分第三部分 定量流式細胞術定量流式細胞術 定量流式細胞術的概述定量流式細胞術的概述定量流式細胞術指的是對待細胞的某種生物分子的絕定量流式細胞術指的是對待

12、細胞的某種生物分子的絕對計量，而不是陽性細胞的相對百分數。對計量，而不是陽性細胞的相對百分數。原理：通過檢測標準微球的熒光強度獲得標準曲線，原理：通過檢測標準微球的熒光強度獲得標準曲線，通過標準曲線（或方程）求得待測細胞的某種生物分通過標準曲線（或方程）求得待測細胞的某種生物分子的精確數值，從而反應在某種生理、病理條件下待子的精確數值，從而反應在某種生理、病理條件下待測細胞出現的微細變化，對臨床疾病的研究、診斷及測細胞出現的微細變化，對臨床疾病的研究、診斷及治療等具有重要意義治療等具有重要意義。血小板表面抗原定量血小板表面抗原定量- - platelet calibrator kitplate

13、let calibrator kit特點特點可定量與血小板相關的任何抗原(如cd41, cd61, cd42a等)免洗間接法一抗亞型為igg1, igg2a或igg2b定量范圍寬(500-90,000 分子/血小板 )定量準確，cv值(變異系數)小血小板表面抗原定量血小板表面抗原定量- - platelet calibrator kitplatelet calibrator kit標準曲線標準曲線血小板表面抗原定量血小板表面抗原定量- - platelet calibrator kitplatelet calibrator kit結果結果血小板表面抗原定量血小板表面抗原定量- platelet

14、 calibrator kitcd41/61復合物變形與復合物變形與firbrinogen結合，為結合，為初期血栓初期血栓形成的關鍵步驟形成的關鍵步驟platelet fibrinogen kit應用應用心血管疾病(不穩定心絞痛，心肌梗塞等)監測抗凝集治療(如reppro, integrelin, plavix, ticlid等)檢測gpiib/iiia(cd41/cd61)受體fibrinogen結合能力血液體外(in vitro)活化(adp等誘導)后，檢測fibrinogen結合能力血小板活化狀態(ex vivo)標本處理標本處理platelet fibrinogen kit白細胞表面抗

15、原定量白細胞表面抗原定量- cellquanttm calibrator kit特點特點可定量與白細胞相關的任何抗原(如cd3, cd4, cd55, cd59等)單個定量(用一個單抗，如cd28抗體定量白細胞表面cd28分子數)多參數定量(如用cd8設門來定量cd8+ t細胞上cd28分子數)全血和分離的細胞(如細胞株等)均可間接法一抗亞型為igg1和igg2a定量范圍寬(1000-300,000 分子/白細胞 )定量準確，cv值(變異系數)小白細胞表面抗原定量白細胞表面抗原定量- cellquanttm calibrator kit標準曲線標準曲線白細胞表面抗原定量白細胞表面抗原定量- c

16、ellquanttm calibrator kit結果結果白細胞表面抗原定量白細胞表面抗原定量- cellquanttm calibrator kitblood dendritic cell enumeration kitdcdc作用作用：1.樹突狀細胞（dendritic cell,dc）為一群非均一性專職抗原遞呈細胞，與mhc二類分子結合向其它免疫活性細胞傳遞抗原信息。 2.骨髓樣dc（mdc）和淋巴樣dc(pdc).在誘導和調控免疫應答方式上完全不同：首先它們表達不同的抗原識別受體并對不同的抗原起作用；表達不同的細胞因子受體并對不同的細胞因子起反應，即使受到相同的抗原刺激。骨髓樣dc（m

17、dc）與th1效應相關,而淋巴樣dc（pdc）與th2效應有聯系； 已經應用的領域包括已經應用的領域包括：1）sle病人病情和療效觀察；2）aids病人免疫機能分析；3）病毒性肝炎病人免疫狀況研究；4）疫苗研究。特點特點簡便、簡便、快捷、快捷、絕對計數絕對計數dc亞群數亞群數/ml最新技術最新技術計數血液中循環內皮細胞的標準方法計數血液中循環內皮細胞的標準方法循環內皮細胞循環內皮細胞(cec)增加于增加于cellquant ff-cd146急性冠狀動脈綜合征血小板減少性紫癜鐮刀細胞貧血敗血癥狼瘡腎病綜合征器官移植排斥手術創傷癌癥傳統方法傳統方法顯微鏡檢，手工計數。費時，費力，無法標準化新技術新

18、技術新標準新標準cellquant ff-cd146免疫磁珠富集與3色流式細胞術結合僅需1 ml血整個過程不到1個小時靈敏度高：1ml血中可檢測出10個循環內皮細胞重復性好，室間差(interlaboratory cv)小方法方法cellquant ff-cd146將包被cd146單抗的鐵磁性納米顆粒(cd146ff)與1ml 血孵育富集的cd146+細胞用以下試劑染色 pi(碘化丙啶) (確定有核細胞) cd45-fitc(排除wbc(白細胞)干擾) cd146-pe單抗(識別cd146抗原的另一位點) 標準濃度微球(用于絕對計數)流式分析(循環內皮細胞鑒定) 有核細胞(pi+); cd45-; cd146+;前向散射角(fsc)范圍寬cellquant ff-cd146pi-cd