1、精品 油菜素甾醇類物質(zhì)的生理作用及信號傳導(dǎo)一：概述要了解一個物質(zhì)的生理功能，首先我們應(yīng)該了解這個物質(zhì)是什么，如何生成等基本問題，所以在介紹其生理作用及信號傳導(dǎo)前，首先介紹一下什么是油菜素甾醇類物質(zhì)。油菜素甾醇（Brassinosteroids，BR）是一大類植物甾醇類激素，廣泛分布于高等植物中。其具有促進植物細胞生長的作用，并在植物發(fā)育中處于著至關(guān)重要的地位。它是最近幾十年來被新確認(rèn)的植物激素，被稱為繼生長素、細胞分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯之后的第六大激素，其他植物激素包括茉莉酸、水楊酸、獨腳金內(nèi)酯等。最近十幾年的研究也揭示了油菜素甾醇信號傳遞的途徑，為其在農(nóng)業(yè)和其他領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。（

2、 BL的結(jié)構(gòu)式）甾體長期被當(dāng)做是多細胞動 物的激素，直到1970年代Michelle從植物中把甾體分子的激素活性發(fā)現(xiàn)，把一種從油菜（Brassica napus）花粉中提取的促進生長的物質(zhì)鑒定為甾體化合物，并命名為油菜素內(nèi)酯（brassinolide，BL）。從此以后，具有與BL相似結(jié)構(gòu)和活性的甾體分子不斷被發(fā)現(xiàn)，統(tǒng)稱為油菜素甾醇。油菜素甾醇為甾醇類激素，是一類環(huán)戊烷多氫菲，與動物甾體類激素相似但是作用機制不同，它不經(jīng)過細胞核內(nèi)受體發(fā)揮作用，而是通過細胞膜表面受體傳遞信號。由于很低濃度的油菜素甾醇就可以強烈誘導(dǎo)生長和分化，以及利用模式生物擬南芥（Arabidopsis th

3、aliana）中鑒定出BR缺失和BR不敏感突變體，發(fā)現(xiàn)了BR在發(fā)育中的功能。這些突變體表現(xiàn)出了許多生長缺陷，包括矮小、葉暗綠、開花延遲、雄性不育和全黑暗情況下的光形態(tài)建成，所以油菜甾醇已被公認(rèn)為是一種能使細胞伸長、維管分化、根生長、對光的反應(yīng)、抗逆、衰老等的基本植物激素之一。BR的合成有一系列酶的參與。與赤霉素和脫落酸的合成類似，油菜素甾醇的合成是萜類途徑的一個分支。油菜素甾醇的合成開始于2個法尼醛二磷酸聚合形成C30的三萜三十碳六烯。三萜三十碳六烯經(jīng)過一系列的閉環(huán)反應(yīng)，形成五環(huán)的三萜前體環(huán)阿屯醇。后又合成前體菜油甾醇（Campesterol）、谷甾醇和膽固醇等。菜油甾醇首先生成菜油甾烷醇（c

4、ampestanol），然后經(jīng)過早期C-6氧化和后期C-6氧化2條途徑，轉(zhuǎn)化為栗木甾酮，繼而轉(zhuǎn)化成油菜素內(nèi)酯。現(xiàn)在油菜素甾醇已經(jīng)在27個科的種子植物、1種羊齒類植物（問荊）、1種苔蘚類植物（地錢）、1種綠藻（水網(wǎng)藻）等中得到了鑒定。因此，油菜素甾醇是一種在陸生植物進化之前就普遍存在于各種植物中的激素。在被子植物中，油菜素甾醇在花粉、花藥、種子、葉片、莖、根、幼嫩的生長組織中均有較低濃度的廣泛分布。現(xiàn)在多數(shù)實驗表明，BRs缺乏長距離運輸模式，可進行短距離運輸。在施用BL處理后的種子，產(chǎn)量可提高45%。BR促進植物長大，因此生物量自然會增多，這在水果、蔬菜中有著重大的意義。BR參與調(diào)控植物株型的調(diào)

5、整，這在農(nóng)業(yè)上也有著潛在的用途。比如控制株型大小、種植密度等。外源的表油菜素內(nèi)酯處理后，作物對各種環(huán)境脅迫，如熱脅迫、冷脅迫、干旱等的耐受性均會有較大幅度的提高。二、生理作用油菜素甾醇為甾醇類激素，也是一類環(huán)戊烷多氫菲，但其與動物甾體類激素的作用機制不同，不經(jīng)過細胞核內(nèi)受體發(fā)揮作用，而是通過細胞膜表面受體傳遞信號。油菜素甾醇最早由Michelle于1970年發(fā)現(xiàn)。他從油菜花粉中提取出了一種能促進植物莖桿伸長和細胞分裂的高活性物質(zhì)，將其稱為油菜素（Brassins）。由于很低濃度的油菜素甾醇就可以強烈誘導(dǎo)生長和分化，并且通過進一步的對擬南芥（Arabidopsis thaliana）的分子遺傳學(xué)

6、研究，證明油菜素甾醇是一種植物激素。合成途徑：BR的合成有一系列酶參與完成。與赤霉素和脫落酸的合成類似，油菜素甾醇的合成也是萜類途徑的一個分支。油菜素甾醇的合成開始于2個法尼醛二磷酸聚合形成C30的三萜三十碳六烯。三萜三十碳六烯經(jīng)過一系列的閉環(huán)反應(yīng)，形成五環(huán)的三萜前體環(huán)阿屯醇。油菜素甾醇的合成前體為菜油甾醇（Campesterol）、谷甾醇及膽固醇等，其來源于環(huán)阿屯醇。菜油甾醇首先生成菜油甾烷醇（campestanol），然后經(jīng)過早期C-6氧化和后期C-6氧化2條途徑，轉(zhuǎn)化為栗木甾酮。兩條途徑在栗木甾酮處合并，繼而轉(zhuǎn)化成油菜素內(nèi)酯。油菜素唑Brz（Brassinazole）是一種BR合成的特異

7、性抑制劑，其抑制油菜素內(nèi)酯合成途徑中催化6-氧-菜油甾烷醇生成卡它甾酮的單氧酶CYP72B1 DWF4的活性。BR，是新型植物激素，在不同情況下對植物生長發(fā)育表現(xiàn)出特殊的調(diào)節(jié)作用，但因其性質(zhì)不完全符合植物激素的嚴(yán)格定義，一般稱之為植物激素類似物。合成機制如下圖：生理作用：BR在植物的生長發(fā)育中有著重要的作用，與其他植物激素一起參與調(diào)控植物發(fā)育的很多方面，包括莖葉的生長、根的生長、維管組織的分化、育性、種子萌發(fā)、頂端優(yōu)勢的維持、植物光形態(tài)建成等。另外，對于植物的對環(huán)境脅迫的防御中也有重要作用。油菜素內(nèi)酯（BS）與根系的生長發(fā)育有關(guān)系，它在很低濃度水平下能表現(xiàn)出強的生活性。有實驗表明在黃化水稻幼苗

8、第二葉片彎曲實驗中，油菜素內(nèi)酯在0.005mg/L時即可產(chǎn)生明顯的傾斜效應(yīng)。而生長素、赤霉素雖也有此反應(yīng)，但一般在較高濃度下，才表現(xiàn)出傾斜效應(yīng)。與傳統(tǒng)的五大類植物激素相比，其作用機理獨特、生理效應(yīng)廣泛、生理活性極高，但用量僅是五大類激素的千分之一。BS和BR可以促進胚芽鞘的生長提取的BS與合成的BR均能促進植物胚芽鞘的伸長，且生理活性相似。以下是BS和BR對水稻胚芽鞘伸長的作用BR可提高幼苗光合速率以玉米幼苗為例，epihomoBR浸種后，玉米品種鐵單10號幼苗根力活力、根干重、葉面積、地上部干重、充實度、葉綠素a含量、光合速率、玉米素含量均有提高；葉鞘主脈出維管束細胞徑向增大，細胞壁增厚，同

9、時維管束變大。 實驗表明，經(jīng)BR浸種處理，除了能增加光合面積外，還能顯著提高光合速率，這充分說明BR能有效提高苗期光合作用，為培育壯苗，增加秧苗干物質(zhì)的積累創(chuàng)造有利條件。BR浸種后推斷其提高光合速率的機制有兩種可能：一是浸種處理提高了葉片的素質(zhì)。二是BR浸種提高了幼苗葉片內(nèi)ZR（玉米素）的含量，機制如下圖所示：BS生物活性具有穩(wěn)定性通過實驗，提取的BS促進黃化水稻第二葉切段的效果隨BS處理濃度的增大而增加，隨BS處理時間的延長而增加，如下圖，BS處理時間與黃化水稻葉片傾斜角度的關(guān)系，說明BS的生理活性很穩(wěn)定。油菜素甾醇類與生長素能夠相互作用。近年來研究表明，BR與生長素能協(xié)同調(diào)節(jié)基因的表達，二

10、者在代謝、運輸和信息轉(zhuǎn)導(dǎo)等不同層次上存在相互作用，并且這兩種信號與其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，如激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間也存在信號對話。1. 協(xié)同調(diào)節(jié)基因的表達近年來隨著基因芯片技術(shù)的應(yīng)用，推動了BR調(diào)節(jié)基因表達的研究。Mussig等利用基因芯片技術(shù)，比較BR處理和對照植株，以及BR缺失型突變體和野生型植株的基因表達，發(fā)現(xiàn)BR對一些生長素反應(yīng)基因也有調(diào)節(jié)作用，BR能快速誘導(dǎo)生長素早期基因IAA3和IAA19的表達，并且這種誘導(dǎo)不僅依賴于生長素的水平。ARF1是與生長素反應(yīng)元件結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，ARF1結(jié)合蛋白（ARF1 PB）的功能很可能是調(diào)節(jié)ARF1的活性。在BR處理的擬南芥植株中ARF1

11、PB表達較少，這表明BR通過調(diào)控ARF1 PB基因與生長素協(xié)同調(diào)節(jié)生長素影響基因的表達。而生長素也能增強BR響應(yīng)基因TCH4的表達。2. BR和生長素與其他植物激素的相互作用除了BR生長素之間存在相互作用外，它們還會共同語其他植物激素相互作用，以調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育。如在擬南芥中，BL能誘導(dǎo)GA20氧化酶基因（GA20ox）的表達，在豌豆中，生長素能抑制該基因（PsGA20oxl）的表達。3. BR和生長素與光的相互作用Reed研究發(fā)現(xiàn)BR和生長素共同調(diào)節(jié)AUX/IAA蛋白和GH3蛋白，同時還可能調(diào)節(jié)植物的光反應(yīng)。在酵母雙交中，光敏色素A（PHYA）能與AUX/IAA蛋白相互作用，如燕麥中的PH

12、YA在體外能磷酸化IAA1、SHY2/IAA3、IAA9、AXR3/IAA17和豌豆中的IAA4等AUX/IAA蛋白。這些實驗證據(jù)從水分子水平揭示了BR和生長素與光信號之間的相互作用。 二、信號傳導(dǎo)油菜素甾醇的細胞信號通路研究是最近植物學(xué)領(lǐng)域最前沿的領(lǐng)域之一。通過十多年的分子遺傳學(xué)、生物化學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，已經(jīng)基本建立了完整的油菜素甾醇細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在油菜的近親-模式生物擬南芥中發(fā)現(xiàn)了BR不敏感突變體，找到的這些擬南芥突變體不僅包括BR生物合成酶的突變，也有感知和傳導(dǎo)BR信號的信號蛋白的突變。BR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)途徑：細胞表面受體激酶BRI1感知BR BRI1激酶通過與共受

13、體BAK1的配體誘導(dǎo)契合和相互磷酸化 BKI1的解離而被激活 BRI1繼而磷酸化BSK1，接著激活BSU1 BIN2由于BSU1催化其Tyr的去磷酸化而被抑制 引起去磷酸化BZR的核內(nèi)累積和BR應(yīng)答基因的表達BRI1在細胞表面感知BRBR不敏感突變體bri1 (brassinosteroid insenstitive 1)是用外源BR處理后仍保持矮小的不敏感狀態(tài)而鑒定出來的。bri1的其他等位突變體促使了BRI1基因（編碼LRR-RTK蛋白）的克隆。BRI1的胞外域包含了24個富亮氨酸重復(fù)序列（LRR）和一個位于第20和21個LRR之間的“島”區(qū)域（ID）；胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括一個Ser/Thr激酶

14、結(jié)構(gòu)域、一個近膜區(qū)（JM）和一個C末端序列。幾組實驗證明BRI1的功能是作為BR的受體。這些實驗包括：嵌合受體BRI1-XA2能在BR誘導(dǎo)下引發(fā)防御反應(yīng)、擬南芥內(nèi)源的或者大腸桿菌表達純化的BRI1能與氚標(biāo)記BL（3H-BL）免疫共沉淀結(jié)合、BR能誘導(dǎo)BRI1的自磷酸化。更深入的研究顯示，含94個氨基酸殘基的ID-LRR21結(jié)構(gòu)域（包括島區(qū)域ID和緊挨著ID的LRR21）是BR結(jié)合的充分條件。這些研究就證明BRI1是BR受體，并給出了一種新的甾體結(jié)合基序。BR結(jié)合到BRI1的胞外域后，激活胞內(nèi)激酶，進而將信號傳遞到胞內(nèi)其它蛋白分子。28個bri1位點突變的大部分都位于ID-LRR21或胞內(nèi)激酶結(jié)

15、構(gòu)域，這與BRI1的BR結(jié)合和激酶活性的基本功能相吻合。結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)分析也揭示了JM和CT結(jié)構(gòu)域的重要作用。去掉JM結(jié)構(gòu)域能消除BRI1的信號功能，這暗示JM在BRI1的功能發(fā)揮中起著正調(diào)控作用。相反，去掉BRI1碳末端49個氨基酸殘基后，在體外實驗中激酶活性更高，轉(zhuǎn)基因到bri1突變體植物后挽救bri1表型更強，這暗示CT起著自抑制的作用。CT區(qū)包含很多磷酸化位點，將這些Ser/Thr位點突變?yōu)槟M磷酸化的酸性氨基酸后的效應(yīng)與去掉這個區(qū)域的效應(yīng)相似，暗示CT區(qū)域的磷酸化能幫助激活激酶。這可能是通過C末端尾巴通過構(gòu)象改變而釋放自抑制功能而發(fā)生的。BR增加BRI1與其共受體BAK1異源寡聚化，誘

16、導(dǎo)受體激酶二聚體化和寡聚體化動物中的許多研究顯示，受體激酶的激活通常需要配體誘導(dǎo)的同源或異源二聚體化，或著異源寡聚體化。BRI1的同源二聚體化最早是通過對豌豆原生質(zhì)體的質(zhì)膜進行熒光能量轉(zhuǎn)移共振實驗（FRET） 而檢測到的。在此之后，單分子檢測技術(shù)證明質(zhì)膜中大約20%的BRI1分子是以同源二聚體形式存在的，并沒有更加高級的寡聚體化。 擬南芥轉(zhuǎn)基因植株中BRI1-GFP和BRI1-FLAG融合蛋白的免疫共沉淀實驗也檢測到了BRI1的同源二聚體化。盡管在原生質(zhì)體中，BR對BRI1的同源二聚體化幾乎沒有作用，但BR處理擬南芥植物后，BRI1-GFP和BRI1-FLAG的免疫共沉淀增加了，這就暗示BR能

17、促進或者是穩(wěn)定BRI1的同源二聚體化。目前尚不清楚BR是像生長素誘導(dǎo)TIR1-IAA的二聚體化一樣，作為分子膠水來幫助穩(wěn)定BRI1同源二聚體；還是BR結(jié)合后引起構(gòu)象變化成為更加偏愛同源二聚體的形式。據(jù)估算，每一分子BL能結(jié)合一個分子的BRI1-GFP，這就支持了第二種可能性。目前也不是很清楚BRI1激酶活性對BR誘導(dǎo)的BRI1同源二聚體化是否是必要的。不管怎樣，BR誘導(dǎo)的BRI1同源二聚體化并不足以完全激活BRI1激酶，還需要共受體激酶BAK1的結(jié)合。BAK1是由兩個獨立的研究小組分別采用酵母雙雜交的方法篩選BRI1互作蛋白和激活標(biāo)簽篩選bri1-5抑制蛋白的方法鑒定到的。BAK1也叫SERK

18、3，是SERK家族（SERK1-SERK5）五個成員中的一個。它也是LRR-RTKs，包含有一個具有5個富亮氨酸重復(fù)的小胞外域（圖）。過表達BAK1能抑制bri1弱突變體的表型。bak1功能缺失突變體表型與bri1弱突變體類似，并且過表達激酶功能缺失的bak1突變體具有強烈的矮化表型，與bri1強突變體類似，推測這是由于顯性抑制效應(yīng)的結(jié)果。最近的BAK1/SERK3及其同源蛋白（SERK1和SERK4）的功能缺失遺傳學(xué)研究闡明了他們在BR信號中的重要作用，與在其他通路中一樣。在體外實驗和酵母實驗中，BRI1和BAK1的激酶結(jié)構(gòu)域能相互作用并轉(zhuǎn)磷酸化，并且他們的體內(nèi)相互作用已經(jīng)通過轉(zhuǎn)基因擬南芥的

19、免疫共沉淀實驗和原生質(zhì)體的熒光能量轉(zhuǎn)移共振實驗證實。BRI1和BAK1在體外實驗中，都有本底激酶活性，相互由對方作用后迅速增加。在酵母中，只有野生型BRI1和BAK1共表達的時候才能檢測到激酶活性，突變或者缺失BRI1或BAK1都不能檢測到。這些結(jié)果暗示，BRI1和BAK1受體激酶活性的完全激活需要相互之間的轉(zhuǎn)磷酸化。圖1：BRI1和BAK1的結(jié)構(gòu)。BRI1由24個富亮氨酸重復(fù)LRR、1個含70個氨基酸的島區(qū)域ID、單跨膜區(qū)TM、近膜區(qū)JM、激酶結(jié)構(gòu)域KD和C末端尾巴CT組成。BAK1由4個亮氨酸拉鏈LZ、5個LRR、1個富脯氨酸區(qū)、單跨膜區(qū)TM、激酶結(jié)構(gòu)域KD和一個CT組成。黑色方框表示推測

20、的信號肽序列，灰色方框表示未知的區(qū)域。AL表示激酶結(jié)構(gòu)域的激發(fā)環(huán)。圓圈表示得到證實的磷酸化位點，帶方框的P表示推測的磷酸化位點。激活型磷酸化位點用紅色表示，抑制性磷酸化位點用藍色表示，對激酶活性沒有明顯效應(yīng)或者沒有得到實驗驗證的用黃色表示。在擬南芥中，BR處理能促進BRI1和BAK1的相互作用并增加它們的磷酸化水平。BR誘導(dǎo)的BRI1-BAK1結(jié)合似乎是由它們的激酶結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)，而不是胞外域的共同結(jié)合。首先，BR結(jié)合BRI1并不依賴于BAK1，BAK1也不參與BR與BRI1的結(jié)合，在bak1無義突變體和BAK1過表達的植株中，BL結(jié)合BRI1的活性都沒有發(fā)生變化。其次，BRI1與BAK1的相互作

21、用依賴于它們的激酶活性。將BAK1的激酶結(jié)構(gòu)域突變后，體外相互作用減弱；BRI1的激酶結(jié)構(gòu)域突變?yōu)闆]有激酶活性形式后，它們的相互作用幾乎完全消失。一個BRI1激酶活性喪失的突變體不能表現(xiàn)出BR誘導(dǎo)的與BAK1的結(jié)合，這暗示對于BR誘導(dǎo)的BRI1與BAK1的結(jié)合，完整的胞外域并不是充分條件，而BRI1激酶活性卻是必要條件。然而，酵母中BAK1胞外域亮氨酸拉鏈中的L46E突變似乎丟失了BAK1與BRI1的結(jié)合。雖然這個結(jié)果可能支持了胞外域在BRI1-BAK1結(jié)合中的作用，但缺乏與BRI1的相互作用也可能是由于突變BAK1蛋白的定位錯誤（如滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中）或在細胞中的不穩(wěn)定性。另一方面，一個BAK1

22、激酶活性喪失的突變體在BR處理后仍能與野生型BRI1結(jié)合，這暗示BR首先激活BRI1激酶，BAK1與BRI1的結(jié)合是第一步BRI1激酶激活的結(jié)果。BRI1激酶活性的對于與BAK1相互作用和BAK1的激活的必要性也與一個觀察到的現(xiàn)象一致，即BAK1過表達只能抑制bri1弱突變的表型，而不能抑制bri1-5 det2雙突變和bri1無義突變的表型。以上這些結(jié)果顯示，BAK1參與BRI1的激活，不參與將BR信號傳遞到下游物質(zhì)。受體激酶的團體行動和多重任務(wù)處理BRI1是高等植物中主要的BR受體。番茄、水稻和豌豆中BRI1的直向同源物突變能引起B(yǎng)R不敏感的表型。然而，BRI1并不是唯一的BR受體。擬南芥

23、中有3個很接近于BRI1的同源蛋白，其中至少2個BRL1和BRL3能高親和地結(jié)合BR。并且，以BRI1啟動子表達這兩個蛋白后，能挽救bri1突變體的表型。這些BRI1同源蛋白似乎能介導(dǎo)維管組織中細胞類型特異的BR反應(yīng)。這種BRI1同源蛋白的功能特化在進化中顯然是在單子葉植物和雙子葉植物分化之前形成的，因為水稻的OsBRL1和OsBRL3也能介導(dǎo)組織特異的和細胞類型特異的BR反應(yīng)。BAK1也屬于RLKs家族中的SERK亞家族（SERK1-SERK5）。除了BAK1（SERK3），2個SERK家族的其他成員SERK1和BKK1（BAK1-like 1，SERK4）似乎在BR信號中起著和BAK1冗余

24、的作用。和BAK1一樣，過表達SERK1或BKK1都能部分抑制bri1-5的表型；體內(nèi)實驗中，它們也能與BRI1相互作用。雖然bak1功能確實單突變只有比較弱的矮化表型，但bak1 serk1-1雙突變的BR不敏感的矮化表型顯著增強，bak1-4 bkk1-1雙突變和bak1單突變相比，只有去黃化輕微增強的表型。遺傳學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)了BAK1和SERK家族其他成員在多個信號通路中的作用。BAK1和BKK1/SERK4參與控制光依賴性細胞死亡過程。bak1 bkk1雙突變體表現(xiàn)出光下的幼苗致死表型，但在暗處卻沒有。在bak1 bkk1雙突變中能觀察到細胞死亡表型的多個方面，包括防御相關(guān)基因的上調(diào)和胼

25、胝質(zhì)、H2O2的積累，但在每個基因的單突變和bri1無義突變體重卻沒有這種現(xiàn)象。這就暗示BAK1和BKK1在抑制不依賴于BR信號的細胞死亡通路中起著冗余的作用。BAK1在病原菌感染后的植物發(fā)病過程中起著非常重要的作用。bak1突變體對腐殖營養(yǎng)病原菌感染表現(xiàn)出更強的易感性。用BR處理后，只能抑制bak1的生長缺陷表現(xiàn)，而不能抑制他的疾病易感表型，這就支持了BAK1在防御中不依賴于BR的假設(shè)。另外，bak1突變體對病原菌相關(guān)分子模式（PAMPs）如鞭毛蛋白、EF-Tu、INF1和CSP22表現(xiàn)出敏感性降低。更加深入的研究顯示，用鞭毛蛋白處理后，BAK1能與鞭毛蛋白受體FLS2（也是一種LRR-RT

26、K）相互作用。這些結(jié)果顯示BAK1在鞭毛蛋白信號途徑中能作為FLS2的共受體。Shan及其同事報道了細菌性病原菌的毒性因子能與targetBAK1以戰(zhàn)勝寄主防御系統(tǒng)，同時抑制BR信號通路。過表達細菌效應(yīng)蛋白AvrPto的轉(zhuǎn)基因植物具有與bri1弱突變體相似的矮小表型，AvrPto和AvrPtoB也能與BAK1相互作用，導(dǎo)致FLS2-BAK1結(jié)合的瓦解。SERK1和SERK2在雄性孢子發(fā)生中起著冗余作用。serk1 serk2雙突變因為花粉絨氈層發(fā)育缺陷而雄性不育。綜合起來，SERK家族的四個成員似乎在4個不同的途徑中起著相互重疊的作用：BAK1、SERK1和BKK1/SERK4在BR信號通路中

27、起作用；BAK1和BKK1/SERK4在細胞死亡控制中起作用；BAK1在鞭毛蛋白信號途徑和自然免疫中起作用；SERK1和SERK2在雄性孢子發(fā)生中起作用。一個基因家族的成員可能是通過基因duplication產(chǎn)生的，這樣最早得到的基因拷貝功能上就是完全冗余的。SERK家族不同成員是如何獲得并保持自身特定的功能的在進化上是一個有趣的問題。功能上的特異性或許是由啟動子和編碼序列的改變而產(chǎn)生的，結(jié)果就導(dǎo)致了多種多樣的組織特異性基因表達和蛋白活性。用SERK1或SERK2的啟動子驅(qū)動SERK3的表達并不能拯救serk1 serk2雙突變體的雄性不育表型，這說明SERK蛋白功能是特異的。相反，BRI1同

28、源蛋白的功能特異性是通過啟動子改變和基因表達模式改變而獲得的，因為用BRI1啟動子驅(qū)動表達BRL1也能拯救bri1的表型。番茄BRI1的雙重功能是值得注意的，即還能與系統(tǒng)素結(jié)合，然而，這項發(fā)現(xiàn)之后受到爭議。近期的研究發(fā)現(xiàn)得出結(jié)論：番茄BRI1對于BR信號是必需的，但對于系統(tǒng)素的信號不是必需的。與此類似，孕酮被發(fā)現(xiàn)能與一些動物細胞中的催產(chǎn)素的G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，但這些結(jié)果也是隨后頗受爭議。通過自磷酸化和轉(zhuǎn)磷酸化調(diào)控 為了了解BRI1和BAK1的信號機制，最新的幾項的研究主要通過質(zhì)譜（MS）鑒定出了它們激酶結(jié)構(gòu)域的磷酸化位點（圖1）。體外的磷酸化位點鑒定是通過分析大腸桿菌表達并純化的重組胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域

29、實現(xiàn)的，而體內(nèi)磷酸化位點鑒定是通過分析免疫共沉淀的轉(zhuǎn)基因擬南芥的表位標(biāo)記BRI1或BAK1而實現(xiàn)的。這些研究明確鑒定出了11個BRI1中的磷酸化位點（6個是體內(nèi)磷酸化位點，5個只在體外磷酸化）。質(zhì)譜數(shù)據(jù)也說明存在不屬于特定氨基酸殘基的其他磷酸化位點，包括存在于第VII和第VIII結(jié)構(gòu)域之間激發(fā)環(huán)上的至少3個位點。此外，磷酸肽作圖（phosphopeptide mapping）之后進行的定點突變證明其他位點存在磷酸化（S1162）。盡管最初的質(zhì)譜數(shù)據(jù)只鑒定出了Ser/Thr殘基的磷酸化，最近的一項采用磷酸肽特異性抗體和質(zhì)譜分析的研究為BRI1的Tyr殘基在體內(nèi)和體外都能磷酸化給出了令人信服的證據(jù)

30、，這暗示BRI1是一個雙重特異性激酶。許多鑒定出的或推測出的BRI1磷酸化位點的功能已經(jīng)通過定點突變后的體外激酶實驗和bri1表型挽救實驗得到了研究。這些研究證明BRI1激發(fā)環(huán)的磷酸化對于激酶活性具有及其重要的作用。體外實驗中，S1044/T1045、T1049、Y1052、Y1057突變的BRI1幾乎完全喪失激酶活性，并且不能挽救bri1-5的表型。兩個激發(fā)環(huán)外的Tyr位點突變（Y956和Y1072）也失去了激酶活性，盡管在體內(nèi)還沒有檢測到Y(jié)1072的磷酸化。BRI1的JM區(qū)和C末端結(jié)構(gòu)域磷酸化的重要作用也被證明了。去除JM區(qū)后，BRI1不能發(fā)揮信號作用和拯救bri1-5突變體表型，并且沒有

31、影響B(tài)RI1在質(zhì)膜上的定位。通過質(zhì)譜分析，鑒定出了JM區(qū)的7個磷酸化位點，它們在體內(nèi)和體外實驗中能自我磷酸化。其中，四個磷酸化位點的模擬磷酸化替代（S838D、T842D、T846D和S858D）在沒有BAK1的情況下增強了BRI1自身的磷酸化，說明JM區(qū)的磷酸化激活了BRI1。然而，JM區(qū)調(diào)制BRI1活性的激活機制目前仍不清楚。與JM相反，在體外實驗和體內(nèi)實驗中，去除CT區(qū)域的BRI1能增加BRI1的激酶活性，且比野生型BRI1更加有效促進地bri1-5和det2突變體的下胚軸生長。CT尾巴的多個Ser/Thr位點都是磷酸化的，其中8個可能的位點中的4個（S-1162、S-1166、S-11

32、68和T-1180）已經(jīng)被實驗證實。將CT的多個Ser/Thr殘基替換成Asp后能顯著增加BRI1不依賴于BAK1的激酶活性。此外，將CT尾巴包含模擬磷酸化突變位點的BRI1突變體能更加有效抑制det2的矮化表型缺陷。這些研究結(jié)果說明，BRI1的CT尾巴是其激酶結(jié)構(gòu)域的自抑制區(qū)，磷酸化可以減輕抑制效應(yīng)。BRI1的JM區(qū)和CT尾巴的功能說明，胞內(nèi)域的非催化部分在特異性調(diào)節(jié)激酶的活性中起著重要作用。哺乳動物受體激酶胞內(nèi)非激酶結(jié)構(gòu)域不僅在自調(diào)節(jié)中起重要作用，也為底物創(chuàng)造結(jié)合位點，而這些作用是依賴于磷酸化狀況的。同樣，BRI1的JM區(qū)和CT尾巴也可能參與調(diào)節(jié)激酶活性，并能為BRI1下游底物創(chuàng)造結(jié)合位點

33、。目前已經(jīng)鑒定出了BAK1胞內(nèi)域的9個磷酸化位點，其中5個（S290,T312,T446,T449, T455）在體內(nèi)磷酸化，4個在體外（S286,T450,S604,S612）。和BRI1不同的是，BAK1的磷酸化主要發(fā)生在激發(fā)環(huán)（T446,T449,T450,T455）上，不過最近在體外也鑒定到了CT尾巴上的2個磷酸化位點（S604，S612）。BAK1激發(fā)環(huán)上對應(yīng)于BRI1 T1049的T455殘基的磷酸化在其功能發(fā)揮中是必需的，因為將T455突變?yōu)锳以后，激酶活性喪失。盡管激發(fā)環(huán)上其他磷酸化位點的單突變對BAK1的活性沒什么影響，但將所有3個Thr突變?yōu)锳la（T446A/T449A/

34、T450A）后激酶活性也會喪失，預(yù)示激發(fā)環(huán)的磷酸化對BAK1的激酶活性至關(guān)重要。雖然分析體外自磷酸化位點和體內(nèi)磷酸化位點已經(jīng)闡明了其磷酸化狀態(tài)能影響激酶活性和信號功能的重要氨基酸殘基，但BR調(diào)控這些位點磷酸化過程的機制仍然不清楚。最近，有人提出BR誘導(dǎo)的BRI1和BAK1的結(jié)合是BRI1激酶第一步激活的結(jié)果，接下來BRI1和BAK1相互轉(zhuǎn)磷酸化，進而激活這兩個受體激酶。BR誘導(dǎo)的BRI1和BAK1的結(jié)合依賴于BRI1的激酶活性而非BAK1，因為BR能增加野生型BRI1和激酶活性喪失BAK1的互作，但不能增加突變體BRI1和野生型BAK1的互作。盡管突變體BRI1仍然能與BAK1有基底水平的互作

35、，但其不能由BR處理而增加。此外，BRI1過表達能增強BR誘導(dǎo)的BAK1磷酸化，但在bri1無義突變體中沒有此效應(yīng)。相反，在bak1 bkk1（serk3 serk4）雙突變背景下，BR處理仍能誘導(dǎo)BRI1磷酸化，雖然和在野生型背景和BAK1過表達背景下的相比，其磷酸化水平要低一些。體外實驗中，BAK1對BRI1的預(yù)磷酸化增加了BRI1對底物特異的磷酸化水平，暗示BRI1具有能被BAK1轉(zhuǎn)磷酸化顯著增強的基底水平磷酸化。此外，過表達BRI1能拯救bak1 bkk1雙突變體的下胚軸伸長表型，而過表達BAK1卻不能抑制bri1無義突變體的表型缺陷。然而，在bak1 bkk1雙突變體內(nèi)SERK1可能

36、仍有功能，因為它也能與BRI1結(jié)合并對BR信號起作用。這樣，為了了解BAK1及相關(guān)蛋白是否在BR誘導(dǎo)的BRI1激活中起著必要性的作用還是支持性作用，還需要研究bak1 bkk1 serk1無義三突變體。BRI1和BAK1的相互激活由轉(zhuǎn)磷酸化介導(dǎo)。通過以一個激酶失活蛋白作為另一個野生型蛋白的底物的體外激酶實驗，已經(jīng)鑒定出了轉(zhuǎn)磷酸化的位點。質(zhì)譜（MS）數(shù)據(jù)顯示BRI1主要磷酸化BAK1的激酶結(jié)構(gòu)域。有6個BAK1殘基能被BRI1磷酸化（S290，T312，T446，T449，T450，T455），其中的4個Thr殘基（T446，T449，T450，T455）位于激發(fā)環(huán)，對于BAK1的激酶活性和信號

37、功能是必需的。將T455突變?yōu)锳la，或者將T446、T449、T450全部突變?yōu)锳la后，BAK1的活性均會喪失。所以，BAK1磷酸化這些殘基后，可能就激活了BAK1。與BRI1磷酸化BAK1的激發(fā)環(huán)不同，BAK1主要磷酸化BRI1的JM區(qū)和CT尾巴。已經(jīng)鑒定出BAK1轉(zhuǎn)磷酸化BRI1的位點是JM區(qū)的3個殘基（S838,T846,S858）和CT尾巴的2個殘基（S1166,T1180）。此外，JM和CT的模擬磷酸化突變體的BRI1激酶活性增強；且JM區(qū)Ser/Thr替換為Ala后的bri1突變體在抑制bri1-5的短下胚軸表型缺陷上，比野生型BRI1更弱。這些結(jié)果就支持BAK1通過磷酸化JM

38、和CT結(jié)構(gòu)域來激活BRI1的假說綜合起來，這些結(jié)果也就支持了一個BR激活BRI1-BAK1受體激酶的順序磷酸化模型：BR結(jié)合誘導(dǎo)BRI1激酶的基底水平激活，然后BRI1與BAK1結(jié)合并磷酸化BAK1的激發(fā)環(huán)從而激活BAK1；激活的BAK1磷酸化BRI1的JM和CT而完全激活BRI1的激酶活性，通過增強BRI1磷酸化下游底物的能力實現(xiàn)其信號功能。雖然磷酸化大多數(shù)位點都能激活激酶活性，但突變研究也找到了一些磷酸化能抑制激酶活性的位點。BRI1的T872A突變能增強激酶活性十幾倍：其Vmax增加且Km減小。這說明T872的磷酸化具有負(fù)調(diào)控激酶活性的作用，不過也有可能是因為將這個Thr替換為Ala后，

39、蛋白構(gòu)象改變成了更有活性的狀態(tài)。另外，BAK1的S286D突變在體外和體內(nèi)實驗中能使BAK1失活，但S286A卻沒有什么作用。在體外檢測到S286是作為BAK1的自磷酸化位點。目前仍不清楚的是，BAK1的S286在體內(nèi)的自磷酸化是一種脫敏機制，還是一種其他激酶調(diào)控BAK1活性的機制。一些磷酸化位點除了影響激酶活性，似乎也能介導(dǎo)特異性的信號輸出。BRI1中JM區(qū)的Y831F突變對激酶活性沒有明顯影響，但表達Y831F突變的BRI1卻能拯救bri1-5的生長表型缺陷，導(dǎo)致葉片更大、開花提前。這就意味著Y831的磷酸化可能對葉片發(fā)育和調(diào)控開花具有信號輸出功能。此外，包含激發(fā)環(huán)上T450A突變的BAK

40、1表達也能拯救bak1 bkk1雙突變的細胞死亡和矮化表型缺陷，但不能拯救其鞭毛蛋白不敏感表型（91）。以上結(jié)果說明，個別磷酸化位點可能影響特異性的信號輸出。BRI1和BKI1的內(nèi)吞在哺乳動物和酵母中，內(nèi)吞是將激活的受體從質(zhì)膜傳遞到下游靶標(biāo)、將受體從細胞表面清除以終止信號和使系統(tǒng)脫敏的普遍機制。最早研究人員在豌豆原生質(zhì)體中觀察到了BRI1和BAK1的內(nèi)吞，且在原生質(zhì)體中共表達BRI1和BAK1能加速內(nèi)吞。最近，在擬南芥根細胞核內(nèi)體中觀察到了不依賴于BR處理的BRI1-GFP。一種阻止從初級核內(nèi)體向次級成熟核內(nèi)體的抑制劑Brefeldin A（BFA）能誘導(dǎo)BRI1-GFP在核內(nèi)體小泡中的積累。

41、有趣的是，BFA處理能激活BR信號，引起B(yǎng)ZR2/BES1的去磷酸化和抑制DWF4的表達。相反，一種影響PM/核內(nèi)體間運輸?shù)幕瘜W(xué)物質(zhì)Endosidin 1能使BRI1-GFP在大的胞內(nèi)體（large intracellular bodies）中積累，并有與bri1相似的矮化表型。BRI1的內(nèi)吞似乎不受BR調(diào)控，但在原生質(zhì)體中過表達BAK1能使其增強。SERK1也是向胞內(nèi)運輸?shù)模鋬?nèi)運與激酶相關(guān)的蛋白磷酸酶相關(guān)（KAPP）。KAPP具有一個磷酸化肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域（FHA），并依賴于激酶活性而于SERK1互作。共表達KAPP能增強SERK1的內(nèi)運。盡管KAPP和SERK1都定位于細胞膜，但FRET檢測

42、發(fā)現(xiàn)，其生理互作只發(fā)生于胞內(nèi)小泡（vesicles）中。這樣，就有KAPP控制SERK1 內(nèi)運的假說。KAPP也能依賴于磷酸化狀態(tài)而與BRI1和BAK1互作，其不能與激酶活性喪失的mBRI1（K911E）和mBAK1（T546A）互作。kapp bri1-5雙突變對BL的敏感性比bri1-5單突變更強，這預(yù)示KAPP可能是一個BR信號途徑的負(fù)調(diào)控原件。KAPP究竟是通過去磷酸化受體激酶抑制BR信號，還是通過促進內(nèi)吞而抑制BR信號的尚需進一步研究。雖然這些研究說明了BRI1的正確定位對于其信號功能的重要性，但BRI1內(nèi)吞的功能尚未知曉。基于BFA敏感的核內(nèi)體BRI1對信號的正作用，有人提出內(nèi)吞對

43、與胞內(nèi)蛋白互作提供了額外的表面空間和可接近性，或者是小泡包圍并捕獲受體-配體復(fù)合物以維持BR的信號。在根中，后一種假說或許更加重要，因為水能洗脫掉胞外的信號分子。在擬南芥中，BRI1定位于大多數(shù)細胞的質(zhì)膜上，而核內(nèi)體 BRI1只是在根細胞中觀測到。另一方面，我們?nèi)圆恢繠RI1如何從細胞表面去除，比如說在停止生長的成熟組織中。我們也不知道BRI1的內(nèi)運是否像動物系統(tǒng)的一些受體一樣，是參與受體降解的一種方式。通過BKI1調(diào)控BRI1/BAK1受體的活性也受其他互作蛋白的調(diào)控。除了BAK1，幾個其他的新BRI1互作蛋白也通過酵母雙雜交的方法鑒定出來了。其中一個即是BKI1，它能夠負(fù)調(diào)控BRI1的活

44、性。RNAi減少BKI1量能增強下胚軸的伸長，而過表達BKI1導(dǎo)致弱的矮化表型。此外，BKI1過表達能減少BR處理誘導(dǎo)的BZR2/BES1去磷酸化，也能改變BR調(diào)控的基因表達水平，這說明BKI1是BR信號的負(fù)調(diào)控原件。沒有BR的時候，BKI1定位于細胞膜，但經(jīng)BR處理后，BKI1迅速從膜上解離而到細胞質(zhì)中。這些現(xiàn)象說明BKI1在細胞膜上與BRI1相互作用，使BRI1處于失活狀態(tài)。BKI1抑制BRI1的部分原因也是阻止BRI1與BAK1的互作，因為在體外實驗中，當(dāng)與BKI1共培養(yǎng)后，BRI1與BAK1的互作減弱。一旦BR激活BRI1的激酶活性，BKI1即被BRI1磷酸化，并迅速與BRI1解離，使

45、BAK1能與BRI1結(jié)合并完全激活BRI1。為了支持這個假說，人工在BKI1的N末端加上豆蔻酰化位點而強制使BKI1定位于質(zhì)膜上，能增強BKI1過表達植物的矮化表型。這些結(jié)果說明，BKI1是當(dāng)BR濃度低的時候使BRI1處于基底水平的另一種控制方式。受體激酶的信號輸出BRI1-BAK1受體復(fù)合物的信號輸出應(yīng)該由這些激酶的胞內(nèi)底物介導(dǎo)。出了BAK1和BKI1，還有一些其他的BRI1互作蛋白被鑒定出來，并且，至少咋體外實驗中能被BRI1磷酸化。這些蛋白包括位于細胞膜上的TTL蛋白（TRANSTHYRETIN LIKE）、TGF受體互作蛋白TRIP-1的同源蛋白、BSKs（BRI1 Signaling

46、 Kinases）。TTL在酵母中能與BRI1互作，在體外實驗中能被BRI1磷酸化。過表達TTL能引起與bri1弱突變體相似的矮化表型，ttl敲出突變體顯示出更強的BR敏感性和生長表型，這說明TTL通過與BRI1激酶互作而負(fù)調(diào)控BR信號。TTL與激活的BRI1的結(jié)合比與激酶失活的BRI1更強。這與BKI1恰好相反，因為BKI1與失活狀態(tài)BRI1的結(jié)合更強。基于TTL定位于質(zhì)膜上，有人提出TTL可能直接介導(dǎo)BR調(diào)控的控制細胞伸長的細胞膜的活性。目前還不知道TTL與BRI1的互作是否影響對BR相應(yīng)的下游基因的表達。TRIP-1與哺乳動物TGF受體互作蛋白序列相似。TGF受體互作蛋白在TGF信號途徑

47、中起重要作用，并且也是真核生物翻譯起始因子eIF3的一個必需亞基。TRIP-1在體內(nèi)實驗和體外實驗中，均能與BRI1互作；體內(nèi)實驗中，其至少有3個殘基（T14，T89，T197或S198）能被BRI1磷酸化，暗示其為胞質(zhì)內(nèi)的BRI1激酶底物。有人提出TRIP-1可能在BR介導(dǎo)的翻譯調(diào)控中起作用，然而還缺乏BR直接調(diào)控蛋白翻譯的證據(jù)。最近，定量蛋白組學(xué)研究鑒定出了大量受BR調(diào)控的蛋白，但除了在翻譯后磷酸化調(diào)控的BR信號原件以外，還沒發(fā)現(xiàn)其他蛋白的蛋白水平和編碼RNA水平的變化。通過二維差異凝膠電泳，對總蛋白的蛋白組學(xué)研究鑒定出了BR信號途徑后期的響應(yīng)原件蛋白，但進行磷酸化蛋白分析或質(zhì)膜部分分析，

48、鑒定出了介導(dǎo)早期BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的響應(yīng)蛋白。這包括BAK1和定位于質(zhì)膜且只在BR處理后磷酸化的BR信號激酶BSK（BSK1、BSK2）（84）。BSKs屬于含12個成員的RLCK XII亞家族，它們都包含有一個N末端激酶結(jié)構(gòu)域和一個C末端tetratricopeptide基序。在擬南芥中，RLKs是一個擁有超過610個成員的大家族，其中25%是沒有胞外域或跨膜區(qū)的RLCK（80）。在體外實驗中，BSK1能被BRI1磷酸化，而不被BAK1磷酸化，且BRI1磷酸化BSK1的特定Ser殘基（S230）。熒光免疫共沉淀檢測到了BSKs與BRI1的體內(nèi)相互作用，BR處理后，熒光免疫共沉淀的量減少，說明一旦磷

49、酸化，BSKs與BRI1解離。盡管大部分BSKs敲除突變體都沒有明顯表型，但bsk3敲除植物對BR的敏感性和對BR合成抑制劑BRZ的超敏感性減弱。在bri1-5中過表達BSKs能強烈抑制其矮化表型缺陷，使BR調(diào)控的基因表達恢復(fù)。此外，在bri1無義突變體中過表達BSKs能部分拯救表型，但不能拯救純合bin2-1的表型，說明BSKs是位于BRI1下游、BIN2上游的正調(diào)控原件。BZR1和BZR2/BES1: BR調(diào)控基因表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子遺傳學(xué)研究鑒定出了2個同源的轉(zhuǎn)錄因子，它們是BR信號途徑的關(guān)鍵組分。遺傳學(xué)研究還證明BR調(diào)控植物發(fā)育是通過調(diào)制核基因的表達來實現(xiàn)的。抗油菜素唑突變體bzr1-1

50、D突變體在沒有BRZ和有BRZ的條件下像野生型，相反，野生型幼苗在BRZ條件下有去黃化表型。bzr1-1D突變體能完全抑制bri1的去黃化表型，且能部分抑制其矮化表型。BZR1是擬南芥中一個植物特有基因家族5個成員中的一個（圖2）。bzr1-1D中的P234L突變能穩(wěn)定BZR1蛋白，引起黑暗條件下組成性BR相應(yīng)生長。在bes1-D（bri1-EMS-suppressor 1）突變體中也發(fā)現(xiàn)了BZR1最近的同源蛋白BZR2同一個位點的Pro到Leu的突變（BZR2氨基酸序列的88%與BZR1相同），因此，BZR1也叫BES1。過表達BZR1能增加下胚軸長度，T-DNA插入敲除突變體bzr2-1下

51、胚軸長度稍微減短。此外，RNAi干擾抑制BZR2/BES1及其同源蛋白能引起矮化表型，暗示BZR1和BZR2/BES1是BR信號途徑中具有冗余作用的正調(diào)控因子。最近證明BZR1和BZR2/BES1是直接調(diào)控BR響應(yīng)基因表達的轉(zhuǎn)錄因子。在一組實驗中，BZR1與GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白能抑制含GAL4結(jié)合位點的啟動子-報告基因的轉(zhuǎn)錄，說明BZR1具有抑制轉(zhuǎn)錄的活性。染色質(zhì)免疫共沉淀實驗（ChIP）證明BZR1與BR合成相關(guān)基因CPD和DWF4的啟動子區(qū)域結(jié)合，BR處理后能以負(fù)反饋機制迅速抑制這種結(jié)合。一系列體外DNA結(jié)合實驗說明BZR1通過其N末端直接與CPD啟動子對BR相應(yīng)必需的CG

52、TGT/CG序列結(jié)合，這個序列也被稱為BR相應(yīng)原件（BRRE）。與BZR1通過BRRE抑制基因表達的結(jié)果一致，人們發(fā)現(xiàn)BRRE在大量的受BR抑制基因中含量豐富，包括一些BR生物合成基因。有趣的是，BRRE在BR誘導(dǎo)的基因中含量也稍顯豐富。鑒于BZR1在BR合成反饋抑制和BR促進植物生長的過程中有著雙重作用，推測BZR1可能通過與不同的元件互作來激活特定的啟動子。與BZR1的轉(zhuǎn)錄抑制活性相比，BZR2/BES1能激活BR誘導(dǎo)的基因SAUR-AC1。BZR2/BES1與bHLH轉(zhuǎn)錄因子BIM1結(jié)合后，一起與SAUR-AC1啟動子的E盒（CANNTG）結(jié)合。Transient過表達BZR2/BES1

53、和BIM1能激活SAUR-AC1啟動子:GUS報告基因，說明BZR2/BES1和BIM1正調(diào)控SAUR-AC1的表達。雖然BIM1過表達和抑制表達實驗都說明其在植物生長中起作用，但這些表型卻很不明顯。可能原因是其他的bHLH蛋白具有冗余作用，或者是BIMs只控制一些特定的受BR調(diào)控的基因和發(fā)育過程。事實上，一項最新研究鑒定出了2個含Jumonji結(jié)構(gòu)域的蛋白ELF6和REF6，他們也是BZR2/BES1互作蛋白。之前的研究發(fā)現(xiàn)這兩個蛋白能調(diào)控開花。此外，也有實驗證明BIMs能與2個參與胚胎發(fā)育的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子DORNROSCHEN和DORNROSCHEN-LIKE互作，且bim1突變體

54、具有低外顯率的胚胎發(fā)育缺陷。這些結(jié)果說明BZR2/BES1通過募集其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子來調(diào)制某部分靶基因的表達和特定的發(fā)育過程。圖2：BZR1轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)。BZR1由一個富丙氨酸結(jié)構(gòu)域AR、核定位序列NLS、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域DB、BIN2磷酸化結(jié)構(gòu)域、14-3-3結(jié)合基序和一個富PEST結(jié)構(gòu)域組成。星號表示推測的BIN2磷酸化位點，黃圈表示被BIN2體外磷酸化的位點，紅圈表示被BIN2體內(nèi)磷酸化的位點。（修改自Ref.16,21;T-W. Kim和Z.Wang未發(fā)表數(shù)據(jù)）BZR1和BZR2/BES1相反的轉(zhuǎn)錄活性也為bzr1-1D和bes1-D突變體在光下表型的不同提供了可能的解釋。這兩種突變體

55、都對BRZ不敏感、在暗光照條件下能抑制bri1的表型，但在光生長條件下表型相反，bzr1-1D是半矮化的，而bes1-D卻有與BR處理植物相似的長葉柄和白化葉表型。通過BR處理或者過表達BR合成基因能拯救bzr1-1D的表型，這至少部分是由過度反饋抑制BR的合成引起的。相反的轉(zhuǎn)錄活性能夠解釋光生長突變體在細胞伸長上相反的效應(yīng)。然而，這卻與黑暗條件下和無BR條件下這些突變體具有相似的總體組成型BR相應(yīng)的表型不一致。事實上，有研究顯示BZR2/BES1也能介導(dǎo)CPD和DWF4的反饋抑制表達，BZR1也能介導(dǎo)BR誘導(dǎo)基因的激活。考慮到BZR1和BZR2/BES1具有幾乎一樣的氨基酸序列，尤其是DNA

56、結(jié)合結(jié)構(gòu)域，有可能BZR1和BZR2/BES1具有相似的DNA結(jié)合和起始轉(zhuǎn)錄活性，只是它們在不同的組織表達，這樣，對BR來源組織的BR合成和BR靶組織的細胞伸長就具有不同的效應(yīng)。對BZR家族成員組織特異性表達的詳細研究將揭開它們功能特化的謎團。此外，鑒定出BZR1和BZR2/BES1的所有靶基因?qū)τ诶斫釨R信號途徑的功能也是相當(dāng)重要的。BIN2介導(dǎo)的磷酸化調(diào)控BZR1和BES1/BZR2作為BR信號途徑的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，BZR1和BES1/BZR2受上游元件嚴(yán)密控制。BR處理可誘導(dǎo)BZR1和BZR2的快速磷酸化，這個過程可以用免疫印跡方法檢測到。結(jié)果顯示，BZR1和BZR2應(yīng)該是被一個負(fù)調(diào)控BR

57、信號反應(yīng)的激酶磷酸化，這個激酶即是BIN2。bin2（又名dwf12或ucu1）是除bri1以外的另一個引起B(yǎng)R不敏感、矮小的植株表型的位點。跟bri1不同，bin2突變體是一個半顯性功能獲得性突變體。BIN2蛋白與GSK3有70%的相似性。GSK3s在真核生物中，從酵母到人類，是保守的，并且在眾多的信號通路中發(fā)揮重要的作用。與一般的負(fù)調(diào)節(jié)因子相同，BIN2的過表達能引起與bin2-1相似的矮小表型，而BIN2或其同源蛋白的功能缺失型突變體促進細胞的伸長，并且部分挽救bri1-5表型，都印證了BIN2在BR信號通路中的抑制功能。若干證據(jù)都證明，BIN2通過磷酸化BZR1和BZR2來負(fù)調(diào)控BR信

58、號途徑。首先，bzr1-1D和bes1-D突變體都充分抑制bin2-1突變體表型，這就支持了在BR通路中BZR1和BZR2是BIN2的下游因子的說法。其次，在酵母和在體外，BIN2都與BZR1,BZR2直接互作。第三，在體外BIN2能對BZR1和BZR2進行高效的磷酸化，BZR1和BZR2的這個轉(zhuǎn)變這與BR處理后的轉(zhuǎn)變相反。第四，在bin2-1突變體中，BZR1和BZR2的磷酸化以及累積水平受到抑制。另外，用化學(xué)抑制劑，如LiCl和bikinin對BIN2進行抑制，會引起B(yǎng)ZR1和BZR2的積累。BZR1、BZR2和水稻的同源蛋白OsBZR1中有25個公認(rèn)保守位點能被GSK3磷酸化，并且這些磷酸化位點似乎對轉(zhuǎn)錄因子有著不同的調(diào)控機制。BIN2磷酸化對于BZR1和BZR2的功能有多重抑制作用。首先，被磷酸化的BZR1進入26S蛋白酶體介導(dǎo)的降解過程，因為用蛋白酶體抑制劑MG132處理后，磷酸化的BZR1水平升高，而未磷酸化水平不變。但是現(xiàn)有數(shù)據(jù)對于BR處理能否引起B(yǎng)ZR2水平的升高存在自我矛盾，在bri1和bin2-1突變體中BZR2水平均顯著收抑制。其次，BZR1和BZR2的磷酸化抑制他們與DNA的結(jié)合活性。在體外BIN2-磷酸化BZR1復(fù)合體和BIN2-磷酸化