1、質粒抽提一、溶液及培養基配制：1、lb液體培養基（1）配方：酵母提取物（yeast extract）5g/l胰蛋白胨（tryptone）1 og/l（2）配制：a、稱量：稱取培養基各成分所需量，置于燒杯中。b、溶化：加入所需水暈2/3的蒸餾水于錐形瓶屮，攪拌使藥品全部溶化。c、定容。d、加塞、包扎。f、高壓滅菌121°c, 30min,滅菌后室溫保存備用。若要分裝需要/十:超凈臺內。2、g、培養菽完全溶解，降至室溫加鉍芐霉素（amp）。先將amp川三蒸水配制為 100mg/ml母液，而后鮮1ml母液加至1000ml培養基。（川'以多配制一些，分裝力lml/管）lb閥體培養基(

2、1)配方：酵母提取物(yeast extract)5g/l氯化鈉(nacl)5g/l胰值 tl 胨(tryptone)1 og/l氨芐青霉素溶液l（）（）mg/ml （終濃度）（即l（x）mg溶于1ml超純水或生理鹽水或pbs，再加入1000ml培養難）瓊脂粉15g/l（2）配制：a、稱量：稱取培養基各成分所需量，置于燒杯中。b、溶化：加入所需水朵2/3的蒸餾水于燒杯屮，攪拌使藥品全部溶化。c、5moi/lnaoh 溶液調 ph 到 7.4。d、定容。e、分裝、加塞、包扎。f、高壓滅菌 121'c, 30min。g、滅苘后，將融化的lbfel體培養基置與55°c的水浴中（或室

3、溫），待培養基溫度降 到55°c時（手可觸摸）加入抗生素，（免溫度過高導致抗生素失效），并充分搖勻。（3）倒板：一般20ml倒1塊板，培養基倒入培養皿后，打開蓋子，水分晾干后蓋上蓋子并用封u膜封 u, 4°c保存備川，使川前提前拿出，防止水蒸氣滴入板屮。首要檢查是否有足夠的固體和液體lb培養基，基本上每個質粒需要一塊固體培養基，小搖 的2ml和大搖的250ml lb培養基。小搖的可以在一個50ml離心管中預備著，每次直接取 用。轉化所需l形玻璃棒需確認已滅菌搖菌器申請，張評滸老師，王雪師姐；注意：考慮到多種東西需要滅菌，可以在轉化之前或者小搖大搖那天一起滅菌。所有需要 提前

4、滅菌的東西有：足量液體lb培養基滅菌后加入amp;藍黃白槍頭至少個一盒，備用； 1.5ml doff管；beckman離心機專用離心管；錫箔紙;250ml錐形瓶，500或者1000ml錐 形瓶；電動移液器所用移液管（可以考慮用5ml移液槍，則先滅菌5ml槍頭）；超純水和te bufferstep 1:轉化：事前準備的：提前將固體培奍基至于超凈臺屮，使之回復室溫；火過菌的l形玻棒，確認微生物室冇火過菌的；滅過菌烘干的進i1.5ml doff管足量；100 ul槍及滅菌黃槍頭（微生物室或許有），10 ul槍及滅菌白槍頭；marker 筆 燒杯，溫度計 小冰盒以及冰注意感受態融化需要時間，可以先將感

5、受態取出融化的時間內做其他準備工作感受態提前半小時從-80冰箱取出插到冰里融化，半融化即可（冰內30min即可）。將冰箱里的固體培養基，火過菌烘干的進li 1.5ml doff管，火過菌的l形玻棒，槍及槍頭取出備用。感受態融化后將其分裝，50w/管（注意在加質粒前在各個管子上標注好耍加入的質粒 名稱以防混淆）。每個管加3p1質粒，輕輕吹打均勻，冰上靜。42°c水浴放置90秒后迅速拿川，插到冰里。鋪板，每個質粒鋪5/板。放置過夜。所旮操作盡量在超凈臺內完成，避免雜菌污染。step2：小搖及大搖事先準備：滅過尚的加過amp的lb液體培養基，每個質粒至少250ml左右；15ml離心管；火過

6、菌的250ml及500ml或1000ml錐形瓶滅過菌的白槍尖及槍；滅過菌的藍槍尖及槍；marker筆，醫用膠帶，封口膜，垃圾袋滅過菌的錫箔紙申請beckman離心機，借beckman離心機專用離心管，力第二天抽提做準備1、觀察歯落生長狀況，若無異常，準備小搖。2、準備lb液體培養基（火菌，amp）,分裝至50mr離心管中（注明使用與否、加氨 卞童、配制時間等），可在4度冰箱內儲備使川；將15ml離心管上按待擴增質粒名稱做好 標記。3、從分裝的50ml離心管屮，句15ml離心管屮加入2ml液體lb （火amp）培養 基（注意盡量不要留在瓶壁上）。多余培養基使川后封u，4度保存。4、以孤立的菌落點

7、為門標，用槍尖（推薦白槍頭）刮取微量菌落，溶于2ml培養®中。 將離心管蓋子擰松后用膠帶固定5、小搖，吋間以具體情況定。一般從上午10點左右開始小搖，到當天卜'午5點可以準 備人搖。6、封好同體培養某，放回4度冰箱，收拾好微生物室臺而，清理廢液缸及垃圾桶（為 了以后能順利中請到）7、小搖成功液體lb （滅菌，amp）培養基，每250ml分裝于500ml或1000ml 錐形瓶屮（瓶越人，培養基震蕩越充分），不耑嚴格定暈。將小搖完成的培養基加入人錐形瓶屮（注意在瓶上做好相關標記），火菌過的錫箔紙包裹瓶ii，人搖，過夜。step3：質粒抽提（大提，若為中提或小提具體看說明書）（使用

8、進口器材） 注意及時屮請beckman離心機，除了 20000g轉速必需，其余6000g轉速可以用 張評滸老師徳爾sigema離心機代替；準備好試劑盒，檢查試劑盒中各個試劑是否足夠，梅個質粒buffer p1 （4度預冷） 10ml, buffer p210ml, bufferp3（4 度預冷）10ml，buffer qbt 10ml, bufferqc 60ml, buffer qf15ml。準備足量50ml離心管，每個質粒至少需耍7個離心管；準備足量的滅菌doff管滅過菌的移液管及電動移液器（若無，可用1000微升槍及滅過尚的藍槍頭代替） 冰及冰盒1000微升槍及火過菌的藍槍頭滅過菌的超純

9、水，無水乙醇，未滅菌的te buffer以及滅過菌的te buffer （細胞 房冰箱有，若無可用濾器制備一些），異丙醇，3m乙酸鈉1、將人搖完成的瓶子屮的培養基分裝到5個50ml離心管屮，此吋培養基渾濁。2、beckman離心機，beckman離心管，6000g、4°c、15min。（提前一天屮站離心機的 使用），需分批離心。離心后盡快，小心地棄上清。3、加入4°c預冷的buffer pl 10ml，重懸人腸桿菌。由于菌分裝在若干離心管中，先將 10ml加入一個離心管中，吹起沉淀的菌，吹勻，加到另一個離心管里，再吹，依次將菌全 部收集到beckman離心管。4、加入buf

10、ferp2 10ml,翻轉混勻4-6次,室溫（15-25°c）孵育5min。5、加入4'c預冷的buffer p3 10ml,翻轉混勻4-6次，冰上孵育20min。6、離心，使裂解的大腸桿菌沉淀，20000g、4'c、30min。7、將上清轉移到50ml離心管中，二次離心，6000g、4°c、30min。8、安裝 qiagen-tip。9、向tip中加入10ml buffer qbt,隨重力流下，以平衡tip。1（）、小心加入第7少得到的上清，注意不能讓沉淀漂起，否則要再離心。隨重力流下。 質粒將衍在樹膠濾器中。11、向tip中加入2x30ml buffer

11、 qc，隨重力流下12、將15ml 65°c預熱的buffer qf加入tip，p tip下安置50ml離心管，接濾出的液體， 含質粒。13、向含質粒的濾出液巾加入10.5ml，即0.7倍qf體積的異丙醇，以使dna沉淀。 加入a=； 6000g、4°c、1h。小心地棄去上清（注意離心之后立即倒凈異內醇，否則沉淀將漂 起）。14、向50ml離心管加入400w未滅菌的te buffer,吹起，溶解，轉移至1.5ml進口 滅菌doff管。窒溫靜置30mino15、向doff管中加60m乙酸鈉和650w無水乙醇,出現沉淀。10000rpm,4-8°c，10min。 （離

12、心機預冷）16、盡可能的吸去上清。加入75%乙醇1ml （已滅菌分裝的超純水25014+無水乙醇 750m1，混合于滅菌的進u doff管，注意應當先在另一個滅菌doff管中配好，絕不可先向 沉淀甩加水，否則即便加了泗精，沉淀也很難析!li）, loooorpm，4-8°c, 5min。盡可能吸上 上淸乙醇，然后重復以上離心，盡可能吸去上淸乙醇。最后放置超凈臺中風干（最人風景約 15-20min）o17、加15（hu滅過菌的細胞房存放的te buffer，溶解后封口膜封口，-4°c保存1-2天， 待w完全溶解p測定吸光度。測定吸光度f-20°c保存。具體要求何種濃度為提取成功，依 據后續細胞轉染實驗要求而定（參考值為1 y g/ml）step4濃度測定1、準備比色皿，pcr用2.5w、100m槍及相應滅過菌的進u槍頭，面巾紙，新鮮的超純 水。（注意防護，戴口罩，最好用泗精擦拭附近桌而，老師建議4以在超凈臺內吸取所需質 粒提取液，取出來測）2、打開儀器,選擇“dna”, “dilution”保持為“100”。若濃度較低，測不出濃度，則換稀 釋比例“set叩” -> “enter”，選擇“dilution” 一>直接