1、色譜分離第四節(jié)第四節(jié) 離子交換色譜離子交換色譜色譜分離1 1離子交換層析的原理離子交換層析的原理 離子交換層析(Ion exchange chromatography，IEC)是利用離子交換劑為固定相，根據(jù)荷電溶質(zhì)與離子交換劑之間靜電相互作用力的不同而發(fā)生差速遷移，從而實現(xiàn)溶質(zhì)分離的洗脫層析法。 色譜分離色譜分離原理原理: :根據(jù)待分離物質(zhì)帶電性質(zhì)不同的分離根據(jù)待分離物質(zhì)帶電性質(zhì)不同的分離純化方法。純化方法。色譜分離離子交換劑分離蛋白質(zhì)的過程離子交換劑分離蛋白質(zhì)的過程平衡平衡吸附吸附去吸附去吸附分離結(jié)束分離結(jié)束再生再生+低鹽低鹽高鹽高鹽利用不同鹽濃度將不同蛋白質(zhì)洗脫下利用不同鹽濃度將不同蛋白質(zhì)

2、洗脫下來來Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-色譜分離Ion-exchange chromatography色譜分離2 2離子交換層析的操作離子交換層析的操作 離子交換層析的裝置主要包括蠕動泵、離子交換層析離子交換層析的裝置主要包括蠕動泵、離子交換層析柱、紫外檢測器及部分收集器等。柱、紫外檢測器及部分收集器等。 進行離子交換層析時，先將樹脂用展開劑處理，使樹進行離子交換層析時，先將樹脂用展開劑處理，使樹脂層析劑轉(zhuǎn)變成展開劑離子的型式；然后將溶解在少量溶脂層析劑轉(zhuǎn)變成展開劑離子的型式；然后將溶解在少量溶劑（通常為

3、展開劑）中的試樣加到層析柱的上部，再通入劑（通常為展開劑）中的試樣加到層析柱的上部，再通入展開劑展開，流出液分步收集，測定其含量。展開劑展開，流出液分步收集，測定其含量。 在分離制備中，根據(jù)檢測結(jié)果，分段合并各步收集液，在分離制備中，根據(jù)檢測結(jié)果，分段合并各步收集液，并進行濃縮提取。并進行濃縮提取。色譜分離色譜分離 在線性梯度洗脫和逐次洗脫過程中，IEC柱內(nèi)溶質(zhì)區(qū)帶后部的離子強度高于前部，因此區(qū)帶后部的移動速度高于前部，溶質(zhì)在洗脫過程中得到濃縮。 GFC之外的層析操作多采用線性梯度洗脫法或逐次洗脫法，只是流動相組成的變化情況各不相同。 色譜分離色譜分離 綜合上述兩種洗脫法的特點，在實際層析操作

4、中，如果料液組成未知，一般應(yīng)首先采用線性梯度洗脫法，確定各種組分的分配特性以及層析操作的條件。 選擇合適的離子交換劑是操作關(guān)鍵，另外離子交換層析緩沖液的選擇也很重要。溶解樣品的初始緩沖液離子強度要低，層析展開用的洗脫劑離子強度可升高。使用梯度洗脫時，離子強度逐漸增加。陽離子交換劑的洗脫pH由低到高，陰離子交換劑的洗脫pH由高到低。 新的離子交換劑在初次使用前，常需預(yù)處理，離子交換劑使用過后，要再生處理。色譜分離膠體再生 蛋白質(zhì)全部溶出后，交換介質(zhì)要經(jīng)過再生 (regeneration) 后，才能再次使用。 (2) 以12 M NaCl即可洗去雜蛋白，徹底清洗可用0.1 M NaOH洗；陰離子子

5、交換介質(zhì)可用1 M醋酸納 (pH 3.0) 洗1.5倍體積；再以緩沖溶液平衡完全，才能再使用。 (3) 可測出液的pH，是否與加入的緩沖液一樣。也可把膠體取出，在燒杯或斗中澈底清洗。 大多數(shù)失敗是因于再生！ 色譜分離3 離子交換層析的應(yīng)用及特點離子交換層析的應(yīng)用及特點 如果說GFC主要用于初步純化和中后期的脫鹽，則IEC是蛋白質(zhì)、肽和核酸等生物產(chǎn)物的主要純化手段。這主要是由于IEC基于離于交換的原理分離純化生物產(chǎn)物，不僅具有通用性而且選擇性遠高于GFC。 激素多肽的IEC分離 E coli RNA的IEC分離色譜分離 歸納而言，IEC具有如下的特點： 料液處理量大，具有濃縮作用，可在較高流速下

6、操作； 應(yīng)用范圍廣泛，優(yōu)化操作條件可大幅度提高分離的選擇性，所需柱長較短； 產(chǎn)品回收率高； 商品化的離子交換劑種類多，選擇余地大，價格也遠低于親和吸附劑。 色譜分離色譜分離離子交換是可逆的等當(dāng)量交換反應(yīng)。傳統(tǒng)的離子交換應(yīng)用時采用固定床實現(xiàn)的，在交換過程中樹脂床將分為三段，即飽即飽和區(qū)、活性區(qū)（傳質(zhì)區(qū)）和新鮮樹脂區(qū)和區(qū)、活性區(qū)（傳質(zhì)區(qū)）和新鮮樹脂區(qū)。隨著交換進行，傳質(zhì)區(qū)不斷下移直至底部交換完全。整個過程只有傳質(zhì)區(qū)處于工作狀態(tài)，飽和區(qū)和新鮮樹脂區(qū)閑置，因此樹脂利用率低。為了提高樹脂利用率，把傳質(zhì)區(qū)進行抽象分割成幾個小單元，一旦上面的小單元飽和后就移出來進行洗水及再生操作，處理用的新鮮樹脂單元又回到

7、傳質(zhì)區(qū)底部循環(huán)使用，這樣大大提高樹脂的利用率。 連續(xù)離交色譜分離 為了能夠?qū)崿F(xiàn)樹脂單元自動高效的運作，把樹脂柱小單元放到一個轉(zhuǎn)盤上，通過轉(zhuǎn)盤的轉(zhuǎn)動來實現(xiàn)切換，而物料通過一個自動旋轉(zhuǎn)分配法控制，把樹脂柱分成交換、水洗、再生、漂洗等功能區(qū)域，當(dāng)樹脂單元到達指定區(qū)域就執(zhí)行相應(yīng)的工藝過程，這樣可以實現(xiàn)每個過程獨立進行，而整體工藝成連續(xù)運行 色譜分離一、疏水性相互作用層析概念一、疏水性相互作用層析概念 疏水性相互作用層析(Hydrophobic interaction chromatography，HIC)是利用表面偶聯(lián)弱疏水性基團(疏水性配基)的疏水性吸附劑為固定相，根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸附劑之間的弱疏

8、水性相互作用的差別進行蛋白質(zhì)類生物大分子分離純化的洗脫層析法。 色譜分離色譜分離色譜分離色譜分離鹽濃過高，鹽濃過高，沉淀不可沉淀不可色譜分離色譜分離Mechanism of HIC色譜分離色譜分離色譜分離色譜分離 圖中a的末端氨基以及a和b的鍵合亞氨基顯弱堿性，在中性pH范圍內(nèi)帶正電荷，因此，這類疏水件吸附劑除疏水性吸附外，還可能存在靜電吸附(離子交換)作用。 圖中c的吸附劑利用醚鍵結(jié)合不引入荷電基團，對蛋白質(zhì)僅產(chǎn)生疏水性吸附作用。疏水性吸附劑色譜分離色譜分離色譜分離色譜分離色譜分離 每次實驗結(jié)束后，吸附劑需要再生。 因為吸附劑中尚留有結(jié)合緊密的生物大分子、表面活性劑等。未經(jīng)再生的疏水吸附劑，

9、其吸附容量將明顯降低。 一般來說可用蒸餾水、乙醇、正丁醇、乙醇、蒸餾水依次洗滌，裝柱，用初始緩沖液平衡吸附劑。吸附劑經(jīng)再生后可反復(fù)使用。 再生色譜分離色譜分離 操作操作1） 加樣：加樣：樣品溶液中補加適量的鹽。樣品溶液中補加適量的鹽。2） 洗脫：洗脫：用降低鹽濃度的平衡緩沖液洗脫。用降低鹽濃度的平衡緩沖液洗脫。3） 再生：再生：除去固定相吸附的雜質(zhì)除去固定相吸附的雜質(zhì) ，用水或，用水或 8mol/L 8mol/L 脲素溶液脲素溶液 。 應(yīng)用應(yīng)用 主要用于分離純化大分子物質(zhì)。主要用于分離純化大分子物質(zhì)。色譜分離3 疏水性相互作用層析的應(yīng)用及特點疏水性相互作用層析的應(yīng)用及特點 HIC主要用于蛋白質(zhì)

10、類生物大分子的分離純化。這種方法與IEC的離子交換作用完全不同。 它不僅是一種有效的分離純化手段，而且還可與IEC互補短長，分離純化利用IEC難以分離的蛋白質(zhì)。 但是，由于疏水性相互作用機理比較復(fù)狀。吸附劑的選擇和洗脫分離條件不易掌握。色譜分離色譜分離 屬于離子交換的原理，根據(jù)兩性電解質(zhì)分子間等電點等電點的差別進行分離純化的洗脫色譜法，可用于蛋白質(zhì)、多肽和核酸等生物大分子的分離純化。 色譜聚焦需實驗特殊的固定相和流動相，難于應(yīng)用在大規(guī)模分離純化過程，主要用于生化實驗規(guī)模的樣品制備或成分分析。一 、色譜聚焦（chromatofocusing) 色譜分離 反相層析(Reversedphase ch

11、romatography，RPC) 是利用非極性的反相介質(zhì)為固定相， 極性有機溶劑的水溶液為流動相，根據(jù)溶質(zhì)極性(疏水性)的差別進行溶質(zhì)分離純化的洗脫層析法。 與前述HIC同樣，RPC中溶質(zhì)也通過疏水性相互作用分配于固定相表面，但是RPC固定相表面完全被非極性基團所覆蓋，表現(xiàn)強烈的疏水性。 因此，必須采用極性有機溶劑（如甲醇、乙氰等）或其水溶液進行溶質(zhì)的洗脫分離。 色譜分離色譜分離 溶質(zhì)在反相介質(zhì)上的分配系數(shù)取決于溶質(zhì)的疏水性，一般疏水性越大，分配系數(shù)越大。 例如，烴類化合物的分配系數(shù)與其分子所含碳原子數(shù)成正比。與其它層析法一樣，當(dāng)固定相一定時，可通過調(diào)節(jié)流動相的組成調(diào)整溶質(zhì)的分配系數(shù)。流動相

12、的極性越大，溶質(zhì)的分配系數(shù)越大。因此RPC多采用降低流動相極性(水含量)的線性梯度洗脫法。 反相介質(zhì)的商品種類繁多，其中最具代表性的是以硅膠為載體，通過硅烷化反應(yīng)在硅膠表面縫合非極性分子層制備。硅烷化反應(yīng)式為：色譜分離 除硅膠外，高分子聚合物也可作為反相介質(zhì)的載體，如TSK gel Octodecyl4PW和TSK gel OctadecylNPR(聚丙烯酸酯C18)等。 反相介質(zhì)性能穩(wěn)定，分離效率高，可分離蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、核酸、脂類、脂肪酸、糖類、植物堿等含有非極性基團的各種物質(zhì)。 RPC作為定量分析手段，廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究、臨床診斷、工業(yè)檢測和環(huán)境保護等各個行業(yè)。 作為產(chǎn)品純化制備手段，由于反相介質(zhì)與其分離的對象相比價格較高，多限于實驗室規(guī)模的應(yīng)用，在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用較少。 色譜分離 羥基磷灰石是一種磷酸鈣晶體，一般認為其吸附主要是基于鈣離子和磷酸根離子的靜電引力，前者起陰離子交換作用，后者起陽離子交換作用。 通常以磷酸鹽緩沖液為流動相，采用提高鹽濃度的線性梯度洗脫法。 可用于識別DNA和RNA的單鏈和雙鏈，分離離子交換層析和疏水性相互作用層析