1、實驗四聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應( (polymerase chain reaction) )簡稱簡稱pcrpcr，是一種選擇性體外擴增dna或rna的方法。pcr又稱為無細胞克隆系統或特異性無細胞克隆系統或特異性dna序列體外引物定向酶促序列體外引物定向酶促擴增法擴增法，可將極微量的靶dna特異地擴增上百萬倍。n 模板模板dna或或rnan 特異性引物特異性引物: sense和和 antisensen taq酶：耐熱酶：耐熱dna聚合酶聚合酶n dntpsn mg2+ n pcr緩沖液：緩沖液： 10mmol/ltris-hcl ph8.4 50mmol/l kcl mg2+ 0.1mg/ml

2、乙酰乙酰bsapcrpcr體系基本組成成分體系基本組成成分模板模板dnamg2+dntptaq酶酶引物引物引物設計注意事項引物設計注意事項引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-27 bp，但不應大于38bp，因為過長會導致其延伸溫度大于74，不適于taqdna聚合酶進行反應。 引物3端的末位堿基對taq酶的dna合成效率有較大的影響。末位堿基為a的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應當避免在引物的避免在引物的33端使用堿基端使用堿基a a。另外，兩條引物3端若互補，或者單條引物自身形成發夾結構也可能導致pcr反應失敗。55端序列對端序列對pcrpcr影響不太大，因此常用來引進修飾位點或

3、標記物。影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。可在引物設計時加上限制酶位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標記生物素、熒光素、地高辛等。通常應在5端限制酶位點外再加1-2個保護堿基。兩引物間最好不存在4個連續堿基的同源性或互補性。引物設計注意事項引物設計注意事項引物序列的引物序列的gcgc含量一般為含量一般為40-60%40-60%，過高或過低都不利于引發反應，因為gc含量決定了dna雙鏈的解鏈溫度（tm）。另外，上下游引物的gc含量不能相差太大。 g值是指dna雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性。應當選用3端g值較低（絕對值不超過9），而5端和中間g值相

4、對較高的引物。引物的3端的g值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發dna聚合反應。 引物二聚體及發夾結構的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導致產生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使pcr反應不能正常進行。 引物的設計的總原則：擴增的效率和特異性引物的設計的總原則：擴增的效率和特異性w 長度：1530bpw 堿基盡可能隨機分布（g+c含量 40-60%）w 引物內部不能形成二級結構w 兩引物間沒有互補鏈存在w 3端一定要與模板嚴格配對w 5端可引入突變，加酶切位點等輔助軟件：primer5，oligo，dnasis等pcr反應體系反應體系引物引物primer5.0操作界面操作界面x

5、 mol/l od260/ a(16000)+c(70000)+g(12000)+t(9600) x: 引物摩爾濃度,a、c、g、t: 引物中4種不同堿基個數。 pcr反應體系反應體系引物濃度計算引物濃度計算 一般一般pcrpcr反應中的引物終濃度為反應中的引物終濃度為0.2-1.0mol/l0.2-1.0mol/l。引物過多會產生錯誤引導或產生引物二聚體，過低則降低產量。利用紫外分光光度計, 可精確計算引物濃度，在1cm光程比色杯中，260nm下，引物濃度可按下式計算： dntp應用naoh 將ph調至7.0，并用分光光度計測定其準確濃度。dntp原液可配成5-10mm/l并分裝，-20貯存

6、。一般反應中每種一般反應中每種dntpdntp的終濃度為的終濃度為2.5mm/l2.5mm/l。當dntp終濃度大于50mm/l時可抑制taqdna聚合酶的活性。4 4種種dntpdntp的濃的濃度應該相等，以減少合成中由于某種度應該相等，以減少合成中由于某種dntpdntp的不足出現的錯的不足出現的錯誤摻入誤摻入。 pcr反應體系反應體系 4種三磷酸脫氧核苷酸種三磷酸脫氧核苷酸(dntp) mg2+濃度對taqdna聚合酶影響很大，它可影響酶的活性可影響酶的活性和真實性，影響引物退火和解鏈溫度，影響產物的特異性以和真實性，影響引物退火和解鏈溫度，影響產物的特異性以及引物二聚體的形成等及引物二

7、聚體的形成等。通常mg2+濃度范圍為0.5-2mmol/l。對于一種新的pcr反應，可以用0.1-5mmol/l的遞增濃度的mg2+進行預備實驗，選出最適的mg2+濃度。在pcr反應混合物中，應盡量減少有高濃度的帶負電荷的基團，例如磷酸基團或edta等可能影響mg2+離子濃度的物質，以保證最適mg2+濃度。pcr反應體系反應體系 mg2+titrate your mg2+ concentration! 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 mmnormally, 1.5mm mgcl2 is optimal best supplied as separate tubealways vorte

8、x thawed mgcl2mg2+ concentration will be affected by the amount of dna, primers and nucleotides 就模板就模板dnadna而言，影響而言，影響pcrpcr的主要因素是模板的數量和的主要因素是模板的數量和純度。純度。一般反應中的模板數量為102 -105個拷貝，對于單拷貝基因，這需要0.1g的人基因組dna，10ng的酵母dna，1ng的大腸桿菌dna。擴增多拷貝序列時，用量更少。模板模板量過多則可能增加非特異性產物。量過多則可能增加非特異性產物。dna中的雜質也會影響pcr的效率。pcr反應體系反應體

9、系模板模板 模板核酸的量與純化程度，是pcr成敗與否的關鍵環節之一，傳統的dna純化方法通常采用sds和蛋白酶k來消化處理標本。sds的主要功能是：的主要功能是：溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，sds 還能與蛋白質結合而沉淀； 蛋白酶蛋白酶k能水解消化蛋白質能水解消化蛋白質，特別是與dna結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙乙醇或異丙醇沉淀核酸醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于pcr反應。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶

10、基因游離，直接用于pcr擴增。rna模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶k法，要防止rnase降解rna。 pcr反應體系反應體系模板的提取方法模板的提取方法 taqdna聚合酶活性半衰期為92.5 130min，95 40min， 97 5min。現在人們又發現許多新的耐熱的dna聚合酶，這些酶的活性在高溫下活性可維持更長時間。taqdna聚合酶的酶活性單位定義為74下，30min，摻入10nmol/l dntp到核酸中所需的酶量。taqdnataqdna聚合酶的一個致命弱點是它的出錯率，一般聚合酶的一個致命弱點是它的出錯率，一般pcrpcr中出錯率為中出錯率為2 21010-4-4 核苷酸核

11、苷酸/ /每輪循環每輪循環，在利用pcr克隆和進行序列分析時尤應注意。在100l pcr反應中，1.5-2單位的taqdna聚合酶就足以進行30輪循環。所用的酶量可根據dna、引物及其它因素的變化進行適當的增減。酶量過多會使產物非特酶量過多會使產物非特異性增加，過少則使產量降低。異性增加，過少則使產量降低。反應結束后，如果需要利用這些產物進行下一步實驗，需要預先滅活taqdna聚合酶, 滅活滅活taqdnataqdna聚合酶的方法有：聚合酶的方法有：pcr反應體系反應體系taqdna聚合酶聚合酶(1) pcr產物經酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。 (2) 加入10mmol/l的edta螯合mg2+ 。

12、(3) 99-100加熱10min。目前已有直接純化pcr產物的裝備可用。pcr反應體系反應體系 taqdna聚合酶滅活方法聚合酶滅活方法 緩沖液一般含10-50mmol/l triscl (20下ph8.3-8.8), 50mmol/l kcl和適當濃度的mg2+ 。triscl在20時ph為8.3-8.8，但在實際pcr反應中，ph為6.8-7.8。50mmol/l的kclkcl有利于引物的退火有利于引物的退火。另外，反應液可加入5mmol/l的二硫蘇糖醇二硫蘇糖醇(ddt)(ddt)或100g/ml的牛血清白蛋白牛血清白蛋白(bsa)(bsa)，它們可穩定酶活性，它們可穩定酶活性，另外加

13、入t4噬菌體的基因32蛋白則對擴增較長的dna片段有利。各種taqdna聚合酶商品都有自己特定的一些緩沖液。pcr反應體系反應體系 pcr反應緩沖液反應緩沖液pcrpcr的基本反應步驟的基本反應步驟變性變性94延伸延伸72 退火退火tm-5包括三個基本步驟: (1)變性(使改變本性):目的雙鏈dna片段在94下解鏈; (2)退火(退火):兩種寡核苷酸引物在適當溫度(50左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對;(3)延伸(延長): dna模板引物結合物在taqdna聚合酶的作用下，以dntp為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板dna鏈互補的半保留復制鏈。重復循

14、環變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需24分鐘， 23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。pcrpcr的基本反應步驟的基本反應步驟在第一輪循環前，在94下變性5-10min非常重要，它可使模板dna完全解鏈，然后加入taqdna聚合酶(熱啟動熱啟動)，這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對的引物與模板復合物所造成的錯誤。變性不完全，往往使pcr失敗。因為未變性完全的dna雙鏈會很快復性，減少dna產量。對于富含gc的序列，可適當提高變性溫度。但變性溫度過高或時間過長都會導致酶活性的損失。 引物退火的溫度和

15、所需時間的長短取決于引物的堿基組成，引物的長度、引物與模板的配對程度以及引物的濃度。實際使用的退火溫度比擴增引物的tm值約低5。一般當引物中一般當引物中gcgc含含量高，長度長并與模板完全配對時，應提高退火溫度。退火溫量高，長度長并與模板完全配對時，應提高退火溫度。退火溫度越高，所得產物的特異性越高度越高，所得產物的特異性越高。有些反應甚至可將退火與延伸兩步合并，只用兩種溫度(例如用60和94)完成整個擴增循環，既省時間又提高了特異性。 延伸反應通常為延伸反應通常為7272，接近于，接近于taqdnataqdna聚合酶的最適反應聚合酶的最適反應溫度溫度7575。實際上，引物延伸在退火時即已開始

16、，因為taqdna聚合酶的作用溫度范圍可從20-85。延伸反應時延伸反應時間的長短取決于目的序列的長度和濃度。在一般反應體系中，間的長短取決于目的序列的長度和濃度。在一般反應體系中，taqdnataqdna聚合酶每分鐘約可合成聚合酶每分鐘約可合成2kb2kb長的長的dnadna。延伸時間過長會導致產物非特異性增加。但對很低濃度的目的序列，則可適當增加延伸反應的時間。一般在擴增反應完成后，都需要一一般在擴增反應完成后，都需要一步較長時間步較長時間(10-30min)(10-30min)的延伸反應的延伸反應，以獲得盡可能完整的產物，這對以后進行克隆或測序反應尤為重要。 當其它參數確定之后，循環次數

17、主要取決于dna濃度。一般而言25-30輪循環已經足夠。循環次數過多，會使循環次數過多，會使pcrpcr產物中非特異性產物大量增加。產物中非特異性產物大量增加。通常經25-30輪循環擴增后，反應中taqdna聚合酶已經不足，如果此時產物量仍不夠，需要進一步擴增，可將擴增的dna樣品稀釋103-105倍作為模板，重新加入各種反應底物進行擴增，這樣經60輪循環后，擴增水平可達109-1010。 擴增產物的量可用下列公式表示:cc0 (1+p)n 。其中：c為擴增產物量，c0 為起始dna量，p為擴增效率，n為循環次數。 在擴增后期，由于產物積累，使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線，產物不再隨循環

18、數而明顯上升，這稱為平臺效平臺效應應。平臺期會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼平臺期會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增，達到較高水平。續大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節循環次數，在平臺期前結束反應，減少非特異性產物。擴增效率擴增效率55333355聚聚 合合 酶酶 鏈鏈 式式 反反 應應 示示 意意 圖圖目的片段目的片段模板模板引物對引物對高溫變性高溫變性低溫退火低溫退火中溫延伸中溫延伸不斷循環不斷循環5 primer 15 primer 2cycle 2cycle 15 5 5 5 5 5 template dna5 5 5 5 5 5 5 5 pcr

19、pcr 基本工作原理基本工作原理cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循環后，模板次循環后，模板dna的含量的含量可以擴大可以擴大100萬倍以上。萬倍以上。pcrpcr反應特點反應特點特異性強特異性強引物與模板dna特異正確的結合堿基配對原則taqdna聚合酶合成反應的忠實性靶基因的特異性與保守性pcrpcr反應特點反應特點靈敏度高靈敏度高pcr產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=10-6)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，pcr的靈敏度可達3個pfu(空斑形

20、成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。 不需要分離病毒或細菌及培養細胞，dna粗制品及總rna均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等粗制的dna擴增檢測。 pcrpcr反應特點反應特點對標本的純度要求低對標本的純度要求低pcr反應用耐高溫的taqdna聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在dna擴增儀上進行變性-退火-延伸反應，一般在24小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣 pcrpcr反應特點反應特點簡單、快速簡單、快速pcrpcr退火溫度的確定退火溫度的確定基因片段基因片段gene segment 上下游

21、引物序列上下游引物序列（53）primer sequence（53) 起始位置起始位置position 退火溫度退火溫度tm值值擴增產物大小擴增產物大小（堿基）（堿基）size（base pairs) f片段forward, caa cga ctg aac ccc atg ca 1 to 2252107bpreverse, acc aac act acg tct cct tg 85to 107 55 10pcr buffer上游引物(20m)下游引物(20m)cdnamgcl2(25mm)dntps(各2.5mm)ex taq(5u/l)ddh20total v5114340.531.550l

22、llllllllpcrpcr反應體系及反應條件反應體系及反應條件以上各成分混勻，瞬時離心。反應條件：94熱變性5min；94變性1min；退火溫度：每對引物的最低溶解溫度降低05，40s；72延伸，延伸時間根據所擴增片段的長短，分別設置30s2min。72最后延伸10min。3035循環10pcr buffer上游引物(20m)下游引物(20m)rnarnasinmgcl2(15mm)dntps(各2.5mm)ex taq(5u/l)amv rtasedepc處理h20total v2.50.50.520.322.510.213.525lllllllllll一步法一步法rt-pcrrt-pcr

23、反應體系及反應條件反應體系及反應條件以上各成分混勻，瞬時離心。反應條件：42 反轉錄45min;94熱變性3min；94變性1min；退火溫度：每對引物的最低溶解溫度降低05，40s；72延伸，延伸時間根據所擴增片段的長短，分別設置30s2min。72最后延伸10min。3035循環擴增條件的優化擴增條件的優化w 優化反應參數：退火溫度和時間、變性溫度和時間優化反應參數：退火溫度和時間、變性溫度和時間w 優化優化mgmg2+2+濃度濃度w 優化模板的純度優化模板的純度w 優化優化dntpdntp的濃度的濃度w 優化引物濃度優化引物濃度w pcrpcr儀：熱蓋、升降溫速度、精度儀：熱蓋、升降溫速度、精度w pcrpcr管的質量等管的質量等pcrpcr擴增產物的分析擴增產物的分析n 瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳：通常應用12%的瓊脂糖凝膠，