1、關(guān)于腐殖酸測定方法的關(guān)鍵比較Richard T. Lamar 和 Karen H. Talbot美國猶他州北洛根EarthFax 發(fā)展公司摘要：用比色法，加州食品和農(nóng)業(yè)局（CDFA） 法可以評估八種腐植酸原材料和產(chǎn)品中的腐植酸含量，并通過與經(jīng)典技術(shù)的對比來比較這兩種方法。經(jīng)典方法是用HCL/HF洗滌除去腐植酸提取物中的灰分，并將腐植酸沉淀酸化，然后在稀酸條件下進行腐植酸的提取。與經(jīng)典過程相比較，比色法和CDFA法都高估了八種樣品中的腐植酸含量，分別高估了120%和52%。因此，這些過程并不能得到一個精確可靠的值來表征腐植酸鹽中的腐植酸含量和它們的提取物制品。關(guān)鍵詞：腐植 腐植酸 腐植分析 腐植

2、酸分析 CDFA法 比色法簡介：腐植酸類物質(zhì)是一系列的大分子物質(zhì)，顏色呈淺棕色到黑色，分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜的由二次合成反應(yīng)生成的異構(gòu)有機聚合物。根據(jù)其在堿性和酸性條件下中提取的溶解度，可將這類物質(zhì)分為三部分。這些腐植酸（HAs）包括了溶于堿而不溶于酸的一類；和黃腐酸（FAs），此類同時溶于酸和堿；以及既不能在稀釋條件下提取也不能在酸性條件下提取的腐殖質(zhì)一類 。從化學(xué)的角度上，這三種類別都很相似，但是其分子量、各種元素的含量、以及所包含的官能團不同。確實如此，從同一來源按順序提取的腐植酸表現(xiàn)出顯著的化學(xué)和結(jié)構(gòu)差異。腐植酸和黃腐酸都是從大量的腐殖酸鹽中提取得到的，這些腐殖酸鹽中包含了各種自然形成的高腐植酸

3、含量的有機巖性物質(zhì)。這些物質(zhì)包括風(fēng)化褐煤、亞煙煤，和各種含碳巖石如泥巖、頁巖和粘土巖。腐植酸作為原材料和它們的提取物一道被推向市場，并且銷售給農(nóng)業(yè)和園藝社區(qū)用作改良土壤，諸如做肥料使用等。因為腐植酸類物質(zhì)并沒有一個清晰明確的定義和一個與之對應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，所以也它沒有一個能夠準確定量的分析技術(shù)。但是，當(dāng)前有三種由商業(yè)化工廠提供的方法可以估計腐植酸鹽或腐植酸類物質(zhì)的腐植酸和腐植酸衍生物含量。這三者都利用了腐植酸在弱堿性條件下的溶解度，其中兩者都利用了當(dāng)堿性提取物遇酸時腐植酸的沉淀作用。這些過程包括定量比色法、CDFA法、CDFA創(chuàng)造的半定量法、還有一種定量法，這篇論文中提到定量法是指基于Swif

4、t詳細闡明了的過程的修訂的經(jīng)典方法。比色法比色方法涉及堿性萃取，溶液由0.2M氫氧化鈉，0.002胺五乙酸，和2%的酒精。這種方法用于從腐植酸或腐植酸提取物中再提取腐殖酸。此方法通過對比堿性樣品提取物和標準量的Aldrich腐植酸的提取物顏色強度來評估腐植酸的量。然而，因為黃腐酸和其他水溶性物質(zhì)諸如氨基酸，蛋白質(zhì)，糖，脂肪酸等同樣也被提取出來，所以這種方法并不能單單只是估計腐植酸的含量，而是連同腐植酸，黃腐酸，和其他十分活躍的溶解的成分一同估計在內(nèi)。 比色法是根據(jù)Beer-Lambert法則得來的：log(I0/I)=kcd在上式中，I0是入射光強度，I是透射光強度。K是物質(zhì)的消光系數(shù)，c是該

5、物質(zhì)溶解的濃度，d是細胞的路徑長度。當(dāng)細胞長度為1cm且物質(zhì)濃度為1 mol/L時消光系數(shù)k等于吸光度。在相等濃度下，腐植酸化合物的消光系數(shù)隨分子重量，碳百分含量，凝結(jié)讀，芳香環(huán)和脂肪環(huán)中的碳百分含量的增加而增加。因此，如果所有的腐植酸化合物都具有相同的分子重量和化學(xué)結(jié)構(gòu)，那么比色法將可以對腐植酸含量進行準確的估計。但是，腐植酸類物質(zhì)來源廣泛，源產(chǎn)地差異很大，分子量大小、濃度、碳含量、芳香環(huán)和脂肪環(huán)的量都不等。再有，比色法的參照標準是Aldrich腐植酸，由于Aldrich的原因他們的腐植酸統(tǒng)統(tǒng)來源于德國礦山，由降解的植物，泥炭和軟碳混合物演變而來。而一批又批被人們提及的Aldrich腐植酸質(zhì)

6、量很有可能也不一樣，且不能作為不同沉淀物中腐植酸提取物的代表。也就是說，根本沒有一個標準。為了準確確定物質(zhì)的濃度，Beer-Lambert法則依據(jù)與標準物質(zhì)等量的樣品的消光系數(shù)來對比。這樣，通過從測試原料腐植酸并確定其標準消光系數(shù)，就可以在一定程度上提高比色法的準確性。標準消光系數(shù)一旦確定，腐植酸的濃度就可以被估算。如果黃腐酸和其他光活性較強的物質(zhì)在分析前被預(yù)先除去，提取液中只剩下腐植酸，那么這種技術(shù)的準確都會更高。通過酸化提取液至PH2就可以達到上述要求，再通過離心作用來分離沉淀腐植酸，最后用預(yù)先為比色法準備的提取液再次溶解腐植酸就可以了，非常簡單。CDFA法使用0.5N 的NAOH來從固體

7、樣品中提取腐植酸類物質(zhì)。一旦提取，就要用濃鹽酸將其提取物調(diào)節(jié)至PH=2。再將沉淀下來的腐植酸從酸性提取液中除去，提取液中含有起初樣品中包含的黃腐酸。然后再將腐植酸洗滌、烘干、稱重確定其濃度。因此，CDFA法主要是測定包含雜質(zhì)在內(nèi)的腐植酸含量。其測定值始終低于比色法的測定值，因為黃腐酸和其他在PH值為2時溶解的光敏感成分被除去了。但是，不同來源的腐植酸灰分有很大區(qū)別。來自加拿大亞伯達省的腐植酸；北達科塔、加拿大薩斯喀徹溫東南部的風(fēng)化褐煤；懷俄明和新墨西哥的風(fēng)化亞煙煤和碳質(zhì)頁巖；以及來自愛達荷的碳質(zhì)頁巖此六個不同地理位置產(chǎn)的腐植酸原材料中的灰分都經(jīng)過了鑒定評估。灰分從亞伯達省腐植酸的11.1%到愛

8、達荷碳質(zhì)頁巖的84.7%不等。這樣，由于CDFA法沒有除去灰分，所以其估算的腐植酸含量和腐植酸衍生物都偏高。提取和凈化腐植酸的經(jīng)典方法中需要將固體腐植酸樣品溶解在0.1N的NaOH中，或者是用濃NaOH調(diào)整液體樣品的PH值至11，并且在氮氣中過夜沉淀。再通過離心處理將混合物中的未溶解的無機成分除去。再將上清液用濃HCL調(diào)節(jié)至PH值為2，并靜置過夜。將含有腐植酸和無機雜質(zhì)的混合物再次離心處理，并沉淀，即可收集到無雜質(zhì)的腐植酸。提純過程需要將腐植酸在HCL/HF條件下多次洗滌。由于雜質(zhì)被除去，所以這種方法可以得出腐植酸在腐植酸鹽或腐植酸鹽提取物中的實際含量。最近，一個基于此方法的快速批量程序做到了

9、在1.5至4個小時內(nèi)完成多組樣品的分析。本篇論文中所描述的這些工作的目標就是確定比色法和CDFA法是否能夠準確地估計腐植酸鹽或腐殖酸鹽提取物中的腐植酸含量，其基礎(chǔ)是通過經(jīng)典方法來確定腐植酸的量，并且進行比較。另外，我們一直在研究不同的方案來修正比色法，以確定比色法的準確度是否有所提升。材料與方法腐植酸鹽和腐植酸提取物八種固體腐植酸礦山或經(jīng)處理后的腐植酸提取物，稱作腐植酸測試因子，它們產(chǎn)于不同的地方并且被用于測試HS/HA（腐植酸類物質(zhì)或腐植酸）濃度，三種方法的詳情如下表。腐植酸測試方法的重要對比表一：腐植酸測試因子用來比較比色法、CDFA法，和經(jīng)典測試法對腐植酸/腐植酸類物質(zhì)的含量測定。腐植酸

10、類物質(zhì)（HS）巖性地理位置礦/提取物1、北達科他（美國）礦風(fēng)化褐煤北達科他礦石2、新墨西哥（美國）礦亞煙煤新墨西哥礦山3、腐植酸鹽提取物亞煙煤新墨西哥提取物4、森諾世混合物腐植頁巖猶他州，埃默里縣礦石5、腐植酸鹽礦亞煙煤猶他州，埃默里縣礦石6、愛達荷（美國）礦未知愛達荷州礦石7、腐植酸提取物風(fēng)化褐煤提取物北達科他，威利斯頓提取物8、腐植酸提取物腐植酸鹽提取物加拿大，松木河提取物比色法測定腐殖物質(zhì) 為分析腐植酸含量，每一種測試的腐植酸類物質(zhì)都要分成三份。需事先準備好由0.2M的NaOH，0.002DPTA，和2%的乙醇組成的提取液。此程序中使用的標準是Aldrich腐植酸（Aldrich HA）

11、的鈉鹽。標準曲線繪制如下：分別稱取0,25,50,100,200,250,400,500mg的Aldrich HA并置于50mL聚丙烯旋蓋瓶中，向每支管中注入20mL提取溶液物，旋轉(zhuǎn)管10s。一小時后，再加入20mL提取物溶液，再次旋轉(zhuǎn)管。混合物在管中靜置過夜后，將5mL上清液加入盛有30mL去離子水的干凈的50mL聚丙烯管中，旋轉(zhuǎn)混合物。旋轉(zhuǎn)之后透光度為650nm，用LKB Ultraspec 2分光光度計測量。根據(jù)標準曲線透光度為650nm處即可找出Aldrich HA 的最初重量。 樣品分析時，取3、4、6試管HS各1g，5、7、8試管HS各0.5g，1、2試管HS個0.25g分為三份置

12、于50mL螺旋蓋聚丙烯管中。向每支管中加入20mL提取物溶液，蓋好蓋子，充分旋轉(zhuǎn)15s。一小時后，再加入20mL提取物溶液，再旋轉(zhuǎn)。靜置過夜后，取15mL上清液至干凈的聚丙烯管中，并同時加入30mL去離子水，充分旋轉(zhuǎn)混合。每份樣品其透光度應(yīng)為650nm，HA的重量有標準曲線得出。CDFA法測定腐植酸將經(jīng)測定后的HS 分為三份，用CDFA法分析過程如下：取1g HS和50mL 0.1N的NaOH置于50mL聚丙烯螺旋蓋離心管中。蓋好蓋子在離心混合器中充分震動1.5h，用5mL 1%的NaOH沖洗蓋子，并將沖洗液倒入管中，蓋好蓋子。1000g 離心20min。 取出上清液置于第二支50mL聚丙烯離

13、心機中。在上述第一個離心管中加入5mL 1% NaOH；旋轉(zhuǎn)至殘余物又出現(xiàn)上清液，在像前面說的一樣離心。將上清液加入第二支離心機。用6N HCL 將第二支離心機中的混合提取物PH值調(diào)至=1，隨后震蕩20min。1000g 離心20min，輕輕導(dǎo)出上清液，丟掉。余下沉淀用25mL預(yù)先用濃鹽酸調(diào)節(jié)至PH=1的蒸餾水洗滌，1000g 離心20min再出現(xiàn)懸浮液。再次洗滌。洗凈之后，將HA置于預(yù)先稱過重的試管中干燥。由于試管預(yù)先稱過重，所以可以與樣品一同干燥。提取和凈化腐植酸和黃腐酸的經(jīng)典方法 經(jīng)典方法源自于對Schnitzer法的修改。取1g待測HS于1L 刻度量筒中，加入1L 0.1N 的NaOH

14、。NaOH與部分溶解的待測HS混合后，將此堿性混合物完全轉(zhuǎn)移至1L錐形瓶中，用磁力攪拌棒攪拌后樣品完全溶解。充分混合1-2小時后，堿性提取物通過離心除去未溶解的礦物質(zhì)和有機成分。這些過程需要將量筒和錐形瓶的瓶口處填充氮氣來排除空氣，并且用封口膜密封。用濃HCL將堿性提取物PH值酸化至2.0。錐形瓶瓶口用封口膜密封，并填充氮氣，靜置24小時。在50mL聚丙烯離心機中含有腐植酸的沉淀與含有黃腐酸的上清液分開。用稀HCL/HF溶液（5mL濃HCL和5mL 25%HF溶解在990mL去離子水中）反復(fù)洗滌除去HA中的雜質(zhì)。向HA中加入20mL HCL/HF， 旋轉(zhuǎn)混合，離心。去掉上清液后，重復(fù)兩次用稀H

15、CL/HF 洗滌，一次用去離子水洗滌。得到的HA置于離心管中在100攝氏度條件下干燥24小時。將試管實現(xiàn)稱好重，再將已凈化的HA盛入試管中，在干燥器中冷卻至室溫。此過程使HA不但干燥，并且保持清潔。用0.22 mm過濾器過濾被分離出來的含有黃腐酸的上清液，在氮氣壓力條件下完成。將500mL濾液緩慢通過DAX-8樹脂，柱采用蠕動泵。黃腐酸在柱上部被吸收。再用4-6L去離子水從頂部用蠕動泵洗去DAX-8的鹽分。DAX-8再返回來用0.1N NaOH洗提以吸收黃腐酸。含有黃腐酸的洗提液利用重力通過Amberlite IR-120氫離子交換柱兩次，再用500mL去離子水洗滌。收集濾液并在60攝氏度條件

16、下濃縮。將濃縮后的提取物凍干，干燥，就得到了干凈的黃腐酸。測定腐植酸類物質(zhì)中的灰分每份含灰分的待測腐植酸類物質(zhì)都稱取1g樣品放入已稱重的去陶瓷坩堝中。坩堝都是在80攝氏度下干燥2小時，再在干燥器中冷卻至室溫。將裝有待測腐植酸類物質(zhì)的坩堝放入馬弗爐中加熱至650攝氏度，加熱24小時。再將坩堝放入干燥器中冷卻至室溫，通過之前的重量來確定灰分的重量。待測物中的濕分就可以通過重量分析得出。對改變方法以提高比色法準確度的評價我們評估了使用新墨西哥產(chǎn)的標準腐植酸和從酸性溶液產(chǎn)品中分離腐植酸的比色法準確性。首先從各種新墨西哥的礦石樣品中用經(jīng)典過程提取和凈化腐植酸。凈化后的HA與標準Aldrich HA 通過

17、比色法作對比，以估計各種新墨西哥礦山中采集到的各種礦石樣品中的HA含量。另外，用濃HCL酸化提取物，再通過離心便可將HA變成沉淀，與酸性上清液隔離開。用40mL提取物再次溶解HA，并旋轉(zhuǎn)。離心后靜置10min，在測試提取物。三份新墨西哥樣品都按照比色法處理，并做成相同的副本。完成酸性成分的提取、上清液的分離后，將副本用40mL PH 值為1的去離子水再溶解在40mL 提取溶液中。在離心10min之前和之后都要使用比色法。標準曲線依據(jù)新墨西哥HA或者Aldrich HA的最初重量確定：橫坐標取0,25,50,100,200,250,400,500mg。稀釋后的提取物透光度對數(shù)為650nm。礦石樣

18、品的HA濃度取決于標準曲線。數(shù)據(jù)分析HA的含量數(shù)據(jù)都由比色法、CDFA法和經(jīng)典過程的應(yīng)用得到，它們用于分析各種腐植酸原料的主要作用。 這些影響作用的差異取決于Sheffe原理(a = 0.05).腐植酸測試的主要方法類比表二 HA分析法對八種腐植酸和腐植酸提取物的HA含量的影響過程HA含量(mg/g)a比色法539 aCDFA法310 b經(jīng)典方法248 c結(jié)果HA含量HA含量因方法不同而有很大差異。CDFA法測出的腐植酸含量比經(jīng)典方法大很多，比色法測出的HA含量又比其他兩種方法都打很多。比色法得出了所有樣品的最大值。其得到的HS中的HA含量至有5/8都比CDFA法得到的更大一些。森諾世和愛達荷

19、產(chǎn)的腐植酸原材料數(shù)據(jù)上都并沒有巨大的差異，它們都是低HA含量。而比色法測出的森諾世和愛達荷腐植酸原材料的HA含量還是比經(jīng)典方法要高一些。表三 比色法、CDFA法、經(jīng)典方法測出的腐植酸和腐植酸提取物中的HA濃度平均值腐植酸/干燥提取物比色法 mg/gCDFA法mg/g經(jīng)典法mg/g北達科他1065a514b496b新墨西哥1080a600b423c猶他州175a128b113b森諾世礦山7a1a6a地球腐植酸原材料797a555b537b愛達荷礦30a19a17a威利斯頓580a491b191c松木河，加拿大579a519a201b我們可以預(yù)期比色法測出的值要比其他兩種方法都大，因為它包含了65

20、0nm吸收的黃腐酸和其他提取物。一般來說，將CDFA法測得HA含量的值乘以二就是比色法測得HA含量的值。不過這只有對北愛荷華風(fēng)化褐煤才能使用，也就是八分之一的幾率。通過這些數(shù)據(jù)可以明顯觀察到，這種做法并不可靠。 通過CDFA得出的值平均比經(jīng)典法要大55.6%。八種待測腐植酸類物質(zhì)中的四種都被CDFA法測出了更高的值。這也可以預(yù)料得到，因為CDFA法沒有除去HA中的灰分，但是經(jīng)典方法除去了。CDFA法最后的測值比比色法更加接近經(jīng)典法測值。但是，由于原材料中不同的灰分和提取物雜質(zhì)，所以CDFA法的測值偏高了很多。對改變方法以提高比色法準確度的評估表五給出的是三份新墨西哥礦樣品的腐植酸濃度，是由校正

21、過和沒有校正過的比色法得出的值。同樣我們還給出了經(jīng)典法測定的HA濃度。通過數(shù)據(jù)可以看出，比色法始終比經(jīng)典法高估HA的含量。即使酸化除去650nm處吸收的黃腐酸和其他酸溶性化合物，也還是這樣的。實際上，沒有通過離心的酸化會使HA含量值比原材料高。表四 待測腐植酸物質(zhì)中的腐植酸，棕黃酸，和灰分含量待測腐植酸類物質(zhì)HA mg/gHA %FA mg/gFA%Ash %1、北達科他49649.6333.3242、新墨西哥42342.3383.8293、猶他州11311.3252.5584、森諾世60.6686.8905、地球腐植酸原材料53753.7898.9396、愛達荷礦171.7717.1907、

22、威利斯頓19119.1666.6228、松木河，加拿大20120.1474.762表五 標準參照物和提取物酸化對于三份新墨西哥（NM）礦石樣品的腐植酸濃度的影響（所有單位為 mg/g）樣品經(jīng)典方法mg/g酸化前酸化后酸化后/cent.AldrichNMAldrichNMAldrichNM1-154762038510037388585551-34616374028555805814782-35638095451061799803597樣品原始重量為0.5g通過新墨西哥標準物測得的腐植酸濃度低于用Aldrich 腐植酸標注物。通常，我們用經(jīng)典過程獲得濃度值。用新墨西哥標準物結(jié)合樣品提取物的酸化和離

23、心，可以得到最為準確的值。比只用經(jīng)典法要準確一些。用新墨西哥標準物結(jié)合樣品提取物的酸化和離心得到的腐植酸濃度在表六中給出。討論最近，腐植酸工業(yè)主要應(yīng)用比色法和CDFA法來測定產(chǎn)品和腐植酸原材料中的腐植酸含量。這篇論文得出的結(jié)論說明了這兩種方法一般來說都會比經(jīng)典法更加高估腐植酸的含量，以至于無法準確測定腐植酸原材料和提取物中的腐植酸含量。表六 通過校正比色法得出的新墨西哥礦石樣品的HA濃度樣品經(jīng)典法mg/g改良比色法mg/g1-1547588(47.2)1-3461420(40)2-3563580(28)由于標準物不夠具有代表性，同時在分析波長被吸收的其他物質(zhì)使得比色法測量不太準確。我們也說明了這種方法的精確度是可以提高的，首先得選用和其他腐植酸或腐植酸提取物相同原材料生產(chǎn)的標準HA，其次要將在給定波長下具有光活性的酸溶性化合物去除掉。要使用改良比色法則要求每種原料生產(chǎn)的標準HA產(chǎn)品都要經(jīng)過測定