1、1采樣、ha、hi、洗血、配制培養液等步驟2洗血1ml 肝素可以抗凝 5.5ml血液心臟抽取豚鼠血液2ml在離心管里面加pbs至10ml離心 3000rpm/ 5min用塑料吸管棄上清，再加pbs至10ml離心 13離心 2離心 3000rpm/ 5min棄上清，加pbs至10ml離心 4000rpm/ 10min去上清，用塑料吸管將血細胞吸入玻璃瓶加pbs稀釋到0.6%，4%保存備用4采樣 地點：汕頭大學醫學院附屬第一醫院兒科 時間：周一周五 上午9:00 11:00 發燒兒童體溫高達37.7以上，在7天內出現疑似病毒感染的呼吸道癥狀，年齡0-18歲，經就診兒童父母同意采集鼻咽拭子，采完裝入

2、采樣管，放入冰包，同時做好記錄。5采樣液配制 以100ml為例： 100ml mem 10ml ps 1ml 制霉菌素6標本稀釋液100ml mem 5ml ps(青鏈霉素)7病毒稀釋液 100ml mem 200ul tpck胰酶 1ml ps8細胞培養液 100ml mem 10ml fbs 1ml ps9種標本stuc附屬第一醫院采取流感癥狀發熱兒童咽拭子咽拭子在振蕩器上面振蕩，使棉簽中的標本充分溶解于液體中用移液槍取220ul樣本稀釋液加入到1ml離心管中吸取275ul標本液加入該離心管中振蕩、在室溫作用1-2小時后離心：10000rpm/ 3min10用pbs將細胞培養管洗兩遍吸取4

3、20ul離心后的標本液加入細胞培養管35吸附1-2h加維持液后放入培養箱里，培養5d，每天觀察cpe陽性陰性凍存或者繼續接種細胞盲傳，同時凍存11ha test紅細胞凝集實驗12123456789101112abcdefgh100ul virus 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 step1: add 50ul pbs in 2-12step2: add 100ul virus in 1step3: coubling dilutiontiter: 1 2 4 8 16 32 64 128 256

4、512 1024 2048titer=2n-113取96孔板，用記號筆做好標記在212號排列孔里各加入50ml pbs在1號排列里各加入100ml 病毒液用排槍從1號孔吸取50ml，加入2號孔，反復吹吸，吸取50ml加入3號管112號孔里面各加入50ul 火雞血/豚鼠血火雞血用火雞血用u型板型板豚鼠血用豚鼠血用v型板型板靜置30min，判讀14陽性陰性凍存或者繼續接種細胞盲傳，同時凍存吸取500ul 病毒液，離心:10000rpm/3min將細胞培養管用pbs洗兩遍，之后加入病毒液35吸附1-2h加維持液，培養5d，每天觀察cpe15hi test紅細胞凝集抑制試驗16adjust 4ad t

5、hen the ha titer4titer=2n-1titer=450mlxx=50ml2n-3x 為第一個孔里面要加的病毒量，然后加為第一個孔里面要加的病毒量，然后加pbs至至50ml=或者公式二v總vvirusha817123456789101112abcdefghh2o:50xvirus: x18123456789101112abcdefgh50ul serum 25ul pbs25uladd 25ul virus to every wellwait for 45minadd 50ul blood to every well19cell culturecell culture flas

6、k: s 25cm2 5ml m 75cm2 1015ml l 175cm2 30ml dilution ratio/dilutionrate: two days 1 to 810 three days 1 to 2020plan cell culture tube 1ml 96 well plate 9620ul (1980ul) if you need 200 tubes in 2 days, the plan as follow: total need cell culture fluid: 201ml 20ml/10(dilutionrate for 2 days)=2ml(take 2ml from the 810ml of diluted from m flask)21if you need 20 96-well plates in 2 days, the plan as follow: need total v