1、2021年設計性實驗2021級臨床五大班實驗室二 星期三 上午組別：一組資料搜集：楊汝平(202101235)陳浩楠(202101236)邱翼(202101238)PPT制造：羅文元(202101234)王興(202101239)張曉東(202101240)匯報：向德航(202101237) 患兒，男性，3歲，因面色慘白伴血尿1天入院。1天前食用新穎蠶豆后，今日出現惡心、嘔吐、排尿呈醬油樣色，面色慘白。據家長反映，患者的姐姐也曾發生過類似情況。 體格檢查：體溫38，脈搏150次/分，呼吸40次/分，血壓80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色慘白，皮膚及鞏膜黃染，體型較同齡人瘦小。心、肺

2、未及異常，肝、脾未觸及，雙腎區無叩擊痛，神經系統檢查未及異常。實驗室檢查：紅細胞 1.981012/L，血紅蛋白53g/L，血清總膽紅素85.5mol/L，結合膽紅素13.7mol/L，未結合膽紅素71.8mol/L，尿蛋白+，潛血(+)，尿膽紅素()，尿膽素原(+)，尿液鏡下未見紅細胞。 尿三膽尿膽素尿三膽尿膽素+、尿膽紅素、尿膽紅素()、尿膽素原、尿膽素原(+)肝腸肝腸循環循環增多增多膽紅素膽紅素單核單核吞噬吞噬系統系統降解降解血紅素血紅素紅細胞破裂紅細胞破裂血紅蛋白滲出血紅蛋白滲出尿蛋白尿蛋白(+)(1.0g/l)運氧功能妨礙運氧功能妨礙溶血性貧血溶血性貧血循環血量減少循環血量減少血壓下

3、降血壓下降脈搏加快脈搏加快(心率加快心率加快)呼吸加快呼吸加快過多過多34.2umol/L時，時，黃疸黃疸血清總膽紅素血清總膽紅素 結合膽紅素變化不大水溶結合膽紅素變化不大水溶性大，隨尿排出性大，隨尿排出未結合膽紅素未結合膽紅素水溶性水溶性小，不能隨尿排出，有毒小，不能隨尿排出，有毒醬油尿醬油尿實際根據 溶血性黃疸:由于紅細胞的大量破壞，使膽紅素產生過多，超越了肝細胞攝取結合的才干，使得尿中尿膽原和尿膽素含量增多。葡糖-6-磷酸脫氫酶缺乏，輸血不當均會引起病癥 蠶豆病：葡糖-6-磷酸脫氫酶缺乏。患者大多在食用蠶豆后發生急性溶血性貧血。典型病人常出現由于大量紅細胞破壞釋放出膽紅素二導致的溶血性黃

4、疸 ，惡心嘔吐，尿液呈醬油樣等病癥 誘因：一天前食用蠶豆 既往史：姐姐也曾出現過此病癥蠶豆病發病機制 食用蠶豆 產生大量過氧化氫，不被去除 紅細胞膜脂質被氧化破壞 急性血管內溶血，產生過多膽紅素 導致溶血性黃疸，惡心，嘔吐，尿液呈醬油樣 6-磷酸葡萄糖脫氫酶缺乏使磷酸戊糖途徑受阻。NADPH+H+缺乏致血復原型谷胱甘肽生成缺乏。 紅細胞被破壞，那么可被肝等單核吞噬細胞識別并吞噬，釋放血紅蛋白，進一步分解為珠蛋白和血紅素，而血紅素被吞噬細胞降解為膽紅素。 膽紅素是人體內原型抗氧化劑，可以清楚超氧化劑和過氧化物自在基，因患兒體內有大量過氧化氫，氧化應激可誘導HO-1的表達，從而添加膽紅素的量升高來

5、抵御氧化應激形狀。患兒正常兒童紅細胞1.981.981012/L 1012/L 4.04.0* *101210125.35.3* *1012/L1012/L血紅蛋白53g/L 53g/L 120120140g/L 140g/L 血清總膽紅素85.585.5mol/L mol/L 1.711.7117.1mol/L 17.1mol/L 結合膽紅素13.713.7mol/L mol/L 0 03.42mol/L 3.42mol/L 未結合膽紅素71.871.8mol/L mol/L 0 013.68mol/L 13.68mol/L 尿蛋白(+)(+)潛血(+)(+)尿膽紅素(-) (-) 尿膽素原

6、(+)(+)從生化代謝解釋患兒的臨床表現和實驗室檢查結果 主要臨床表現：1. 1. 血尿、排醬油色尿、面色慘白 2. 2. 皮膚及鞏膜黃染 3. 3. 體溫升高 4. 4. 呼吸急促1. 血尿、排醬油色尿、面色慘白G6PDGSH的主要作用：的主要作用： 維護紅細胞內的含硫氫基維護紅細胞內的含硫氫基 -SH血紅蛋白、酶蛋白和膜血紅蛋白、酶蛋白和膜 蛋白的完好性，免遭氧化蛋白的完好性，免遭氧化 與谷胱甘肽過氧化酶共同使與谷胱甘肽過氧化酶共同使 H2O2復原成復原成H2ONADPH+H+紅細胞的抗氧化才干紅細胞的抗氧化才干GSH紅細胞紅細胞 膜破裂膜破裂溶血性貧血溶血性貧血面色慘白面色慘白游離游離H

7、b腎腎 吸收閾值吸收閾值血紅蛋白尿血紅蛋白尿/含鐵血黃素尿含鐵血黃素尿2. 皮膚及鞏膜黃染3. 體溫升高機理： 紅細胞破裂 血紅蛋白暴露 免疫系統攻擊單核-吞噬細胞系統 體溫升高4. 呼吸急促溶血性貧血 具有載O2才干的Hb含量下降機體缺O2呼吸急促實驗設計實驗設計高鐵血紅蛋白復原法高鐵血紅蛋白復原法實驗思緒 患者姐姐出現過此類情況推測屬于家族性遺傳，且患者在食用蠶豆后出現病癥，故即有能夠為蠶豆病。6-磷酸葡萄糖脫氫酶缺乏影響高鐵血紅蛋白的復原，故可以根據如下反響機制設計實驗。亞鐵血紅蛋白亞鐵血紅蛋白 高鐵血紅蛋白高鐵血紅蛋白高鐵血紅蛋白復原酶高鐵血紅蛋白復原酶 NADPH(輔酶輔酶) 亞甲藍

8、亞甲藍(遞氫體遞氫體)亞硝酸鈉亞硝酸鈉實驗反響方向 一、實驗目的 1 1、檢測患者體內6-6-磷酸葡萄糖脫氫酶活性以及發病緣由 2 2、掌握高鐵血紅蛋白復原法測6-6-磷酸葡萄糖脫氫酶的實驗原理及方法 3 3、了解蠶豆病的發病機制及緣由 二、實驗原理 在全血中參與亞硝酸鈉，使紅細胞中的亞鐵血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白MHbMHb, ,高鐵血紅蛋白在高鐵血紅蛋白復原酶的作用下又被復原為亞鐵血紅蛋白。在這過程中，高鐵血紅蛋白復原酶不僅需求亞甲藍作為遞氫體，還需求由G6PDG6PD參與磷酸戊糖途徑構成NADPHNADPH作為輔酶才完成上述反響。所以，G6PDG6PD缺陷癥的患者其MHbMHb復原率下降

9、分光光度技術。 三、實驗器材及試劑 器材：離心機、分光光度計、微量移液器 水浴箱、1.5mlEP1.5mlEP管、抗凝管，試管 試劑： 0.18mol/L 0.18mol/L亞硝酸鈉- -葡萄糖溶液； 0.4mmol/L 0.4mmol/L亞甲藍溶液 ； 0. 28 mol/L 0. 28 mol/L 葡萄糖溶液、混合液 等量+ + +生理鹽水、抗凝劑、 患者靜脈血、蒸餾水四、實驗步驟1 1、取靜脈血1.8mL1.8mL于抗凝管( (含0.2mL109mmol/L0.2mL109mmol/L抗凝劑+ +葡萄糖20mg20mg，混勻2 2、離心沉淀1000r/min15min1000r/min1

10、5min3 3、調整血細胞血漿=11=11，混勻，調整后全血4.1ml0.18 mol/L4.1ml0.18 mol/L亞硝酸鈉、1ml0.28mol/L1ml0.28mol/L葡萄糖溶液、0.14 0.14 mmol/Lmmol/L亞甲基藍液，混勻，得到混合試劑1ml 1ml 5、取試管3 支,標上A、B、S ,按下表參與試劑高鐵血紅蛋白復原實驗操作步驟混合試劑/ mL 0. 01 / /生理鹽水/ mL / 0. 01 /0. 18 mol/ L 亞硝酸鈉- / / 0. 010. 28 mol/ L葡萄糖溶液/ mL 經調整的全血/ mL 0. 1 0. 1 0. 1來回搖動1520 次

11、,置37 水浴箱靜置3 h蒸餾水 10. 00ml 10. 00ml 10. 00ml 試劑 A B SB管為空白管,在波長635nm處，測定“A管及“S管吸光度 五、實驗結果 實驗結果計算：計算高鐵血紅蛋白復原率公式：MHb % = (1 - A/ S) 100 % 計算出其復原率與正常值比較 六、實驗分析 該患者能夠患有先天性鐮刀貧血癥或蠶 豆病。 正常的高鐵血紅蛋白復原率75%75%，假設計算所得復原率低于75%75%，且患者姐姐也有類似病癥，患者吃過蠶豆后發病，故可推斷患者患有蠶豆病 七、本卷須知1、血細胞比容比值過低，高鐵血紅蛋白復原率降低。應將血細胞比容調整到0.35-0.402、細菌污染可產生亞硝酸鹽而呵斥假陽性，試管等應無菌3、不穩定Hb、高脂血癥等均可出現假陽性結果，故應2h內送檢4、標本不應有凝血或溶血，故需運用抗凝管5、在標本內應適當參與葡萄糖，以防止較全血缺乏要想討論該病發生的分子根底，可以用哪些技術檢測什么目的基因？我組討論以為：要想討論該病發生的分子根底 ，需求對目的基因進展基因構造分析，即DNADNA序列檢測DNA序列測定方法直接法直接法間接法：對于未知片段，或片段過長，用幾種方法間接法：對于未知片段，或片段過長，用幾種方法RFLP；PCR-RFLP；SSCP來粗略的估計待分析來粗略的估計待分析基因的一級構造能否與對