1、ICS11.120.01C 23團 體 標 準T/CACM 00X2019白木香種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程Technical procedures for cryopreservation of Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg seeds 2019-0X-0X發(fā)布2019-0X-0X實施中華中醫(yī)藥學(xué)會 發(fā)布T/CACM 0012019目 次目 次I前 言II1 范圍12 規(guī)范性引用文件13 術(shù)語和定義14 種子的選擇15 種子前處理26 種子保存量27 種子冷凍方式28 恢復(fù)培養(yǎng)2附錄3參考文獻4前 言本標準按照GB/T 1.12009標準化工作導(dǎo)則 第1部分：標準

2、的結(jié)構(gòu)和編寫給出的規(guī)則起草。本標準由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所提出。本標準由中華中醫(yī)藥學(xué)會歸口。本標準起草單位：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所。本標準主要起草人：魏建和，曾琳，楊云，鄭希龍，王秋玲，何明軍，金鉞，顧雅坤，符麗。IIT/CACM 0012019白木香種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程1 范圍本標準規(guī)定了白木香Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg.種子超低溫保存過程中的術(shù)語和定義、種子的選擇、種子前處理、種子保存量、種子冷凍方式、恢復(fù)培養(yǎng)等技術(shù)要求。本標準適用于白木香種子的超低溫長期貯藏。2 規(guī)范性引用文件下列文件對于本文

3、件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 3543.6 農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程 水分測定GB/T 3543.7 農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程 其他項目檢驗3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1白木香 Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg.為瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬（Aquilaria Lam.）常綠喬木，高515 m。葉革質(zhì)，圓形、橢圓形至長圓形或近倒卵形，傘形花序。漸危種，國家級重點保護野生植物。該植物老莖受傷后所積得的樹脂為中國藥典收載的名貴藥

4、沉香，用于治療胸腹脹悶疼痛，胃寒嘔吐呃逆，腎虛氣逆喘急。3.2白木香果實 Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg. fruits果實為蒴果，其蒴果果梗短，卵球形，幼時綠色，長2 cm3 cm，直徑約2 cm，頂端具短尖頭，基部漸狹，密被黃色短柔毛，2瓣裂，2室，每室具有1粒種子。3.3白木香種子 Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg. seeds白木香的播種材料為完整種子，貯藏特性判斷為頑拗性種子。種子褐色、卵球形，長約1 cm，寬約5.5 mm，疏被柔毛，基部具有附屬體，附屬體長約1.5 cm，上端寬扁，寬約4 mm，下端成柄狀。3.4種子超

5、低溫保存 seed of cryopreservation 指將經(jīng)過前處理的白木香種子置于液氮（-196）中保存。4 種子的選擇4.1 果實采收5月底至6月中旬，當果皮顏色由綠轉(zhuǎn)為黃白，果實自然開裂，種子呈棕褐色時即可采收, 去除果皮和附屬體，取出種子。4.2 種子選擇挑選發(fā)育飽滿、均勻、健康的種子，置于4冰箱中保存?zhèn)溆茫ù娣艜r間不超過15 d）。5 種子前處理5.1 生活力檢測參照GB/T 3543.7中的2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)法檢測種子生活力。隨機抽取30粒種子，剝?nèi)ネ鈱臃N皮，沿種脊小心將種子分成2 爿后放培養(yǎng)皿內(nèi)，內(nèi)側(cè)面向下，滴入TTC溶液浸沒種子，室溫(25)避光放置4

6、 h后觀察染色結(jié)果。5.2 生活力計算直接用肉眼對染色結(jié)果進行觀察鑒定。凡胚及胚乳全部染成有光澤的鮮紅色，且組織狀態(tài)正常的，為有活力的種子；否則為無生活力的種子。計算：生活力=有活力的種子數(shù)/總的種子數(shù)100%待保存的白木香種子生活力應(yīng)85%。5.3 含水量范圍用尼龍網(wǎng)袋包裹白木香種子，置于盛有變色硅膠的干燥器內(nèi)，硅膠與種子的體積比為5000:1，室溫條件下干燥處理2432 h，在干燥過程中定期測定種子含水量，將種子含水量由35%45%降至11%13%。參照GB/T 3543.6中的高恒溫烘干法（130烘干1h）測定種子含水量（W0），W0=（鮮重-絕干重）/鮮重100%。6 種子保存量白木香

7、種子保存量不少于240粒，以便后期的活力檢測使用。7 種子冷凍方式白木香種子超低溫保存的冷凍方式為直接冷凍法，即將待保存的白木香種子放入5 mL凍存管中（每管20粒種子），迅速投入液氮中保存。8 恢復(fù)培養(yǎng)8.1 種子解凍處理液氮中凍存24 h后取出凍存管，取出2個凍存管，立即放入40 水浴中快速解凍2 min。8.2 凍后種子生活力檢測取出1管解凍后的種子，參照5.15.2生活力檢測方法，進行超低溫保存后的初始生活力檢測。當種子生活力80%時視為保存成功。8.3 恢復(fù)培養(yǎng)將剩下1管解凍后的白木香種子，播種到帶有無菌濾紙的帶蓋發(fā)芽盒中，溫度25 30 ，濕度70% 85%條件下培養(yǎng)，出芽周期大概

8、20d。附錄TTC的配制和保存方法精密稱取TTC 1.00 g，溶于100 mL磷酸鹽緩沖液中，制成濃度為1%的TTC溶液，調(diào)pH至6.57.5，置棕色瓶內(nèi)4 冰箱備用。磷酸緩沖液配置方法：溶液I：9.08g磷酸二氫鉀溶于1 L無菌水中；溶液II：35.81 g磷酸二氫鈉溶于1 L無菌水中；I：II=2：3的比例混合制成磷酸鹽緩沖液） 參考文獻1 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典M.北京，中國醫(yī)藥科技出版社，2015,185-1862 中國科學(xué)院中國植物志委員會.中國植物志.第52(1)卷M. 科學(xué)出版社, 2004(1999)：2903 Wang Yinzheng.Michael G. Gilbert.Brian Mathew. Christopher D. Brickell.Lorin I. Nevling. Thymelaeaceae M /Flora Of China Beijing: Science Press/St. Louis: Missouri Botanical Garden Press. 2007. 13: 214-215.4 傅家瑞，宋松泉. 頑拗性種子生物學(xué)M. 中國科學(xué)文化出版