1、2021-9-23第第5章章 其它色譜方法其它色譜方法2021-9-23紙層析和柱層析法紙層析和柱層析法薄層色譜薄層色譜高效毛細管電泳高效毛細管電泳超臨界流體色譜2021-9-23紙層析紙層析2021-9-23一、紙層析分離過程一、紙層析分離過程 紙層析也屬于色譜分析法。但與其它色譜方法不同的是在分離過程中一般不使用動力源。 紙層析流動相的移動是依靠毛細作用。 將試樣點在色譜濾紙或層析板的一端，并將該端浸在作為流動相的溶劑（常稱之為展開劑）中，隨著溶劑向上的移動，經過試樣點時，帶動試樣向上運動。Rf 值相差越大，分離效果越好 2021-9-23二、操作技術1.層析紙和層析板特制的色層濾紙。按需

2、要剪裁成長條形（或筒型）。層析板是用專門的涂布器把漿狀的吸附劑（硅膠或氧化鋁，200250目）均勻地涂在長條形玻璃板上（厚度0.150.5mm）。干燥后即可使用。2021-9-232.展開劑 由一種或多種溶劑按一定比例組成。如用紙層析分離氨基酸時，常用的展開劑組成和配比為：正丁醇：乙酸：水=4：1：1。2021-9-233. 點樣 用微量注射器或玻璃毛細管吸取一定量試樣點在原點上。試樣點的直徑一般應小于5mm。可并排點多個試樣同時展開。2021-9-234.顯色、檢測 有些組份在紫外光照射下產生熒光，可在紫外燈下用鉛筆將組份斑點描繪出來。常用的顯色方法有噴灑顯色劑、碘蒸氣熏或氨水熏等。2021

3、-9-23三、特點及應用三、特點及應用 平板色譜簡單、方便、及操作費用低，平板色譜簡單、方便、及操作費用低， 可以在一塊層析板上同時展開多個試樣及可以在一塊層析板上同時展開多個試樣及將多條濾紙同時展開。將多條濾紙同時展開。 采用方形薄層板還可以方便的進行二維展采用方形薄層板還可以方便的進行二維展開，即按一般方法展開后，改變方向和展開開，即按一般方法展開后，改變方向和展開劑再次展開，進一步改善分離效果。劑再次展開，進一步改善分離效果。 試樣一般不需要經過預處理即可分離。試樣一般不需要經過預處理即可分離。 2021-9-23 缺點： 分離效率較低，不適用揮發性試樣分離。定性定量不便。 應用：應用：

4、平板色譜法在染料、農藥、醫藥、有機酸堿類化合物、糖類化合物、氨基酸、蛋白質及中草藥中有效成分的分離分析中經常被使用。也可以用于無機離子的分離。還經常作為高效液相色譜的一種預試方法。2021-9-23柱層析2021-9-23柱層析：是吸附色譜的一種，它利用吸附劑對不同物質吸附能力的差異，用溶劑將混合物的組分逐一洗脫分離的一種分離方法。 微型柱層析實驗2021-9-23實例實例:n凝膠過濾層析純化細胞色素C2021-9-23一、目的要求一、目的要求1.學習和掌握凝膠過濾層析分離蛋白質的原理與方法。2.通過凝膠過濾柱層析對細胞色素C進行純化2021-9-23二、原理二、原理n凝膠過濾層析也稱分子篩層

5、析、排阻層析。是利用具有網狀結構的凝膠的分子篩作用，根據被分離物質的分子大小不同來進行分離。2021-9-232021-9-23n優點：a. 條件溫和 b.操作簡便 c. 損失少回收率高 d. 層析柱可反復使用n凝膠的類型：Sephadex: 交聯葡聚糖 Sepharose：瓊脂糖凝膠 Bio-Gel ABio-Gel P：聚丙烯酰胺凝膠分子篩Sephacryl：用N，N-亞甲雙丙烯酰胺交聯的葡聚糖凝膠G-10G-15G-25G-50G-75G-100G-150G-200吸水量（g/g干凝膠）1.01.52.55.07.510.015.020.0工作范圍（肽與蛋白）D70015003時, 形成

6、雙電層，在高電場的作用下引起柱中的溶液整體向負極移動，速度電滲流。2021-9-234. 分離過程分離過程 電場作用下，柱中出現：電泳現象和電滲流現象。 帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流兩種速度的矢量和。 正離子：兩種效應的運動方向一致，在負極最先流出； 中性粒子無電泳現象，受電滲流影響，在陽離子后流出； 陰離子：兩種效應的運動方向相反，電滲流 電泳時,陰離子在負極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,除中性粒子外,同種類離子由于受到的電場力大小不一樣也同時被相互分離。2021-9-235.5.分離類型分離類型八種分離類型八種分離類型(1)(1) 毛細管區帶電泳毛細管區帶電泳（CZECZE

7、） 最普遍、最基本的一種分離模式。(2) (2) 毛細管凝膠電泳（毛細管凝膠電泳（CGECGE） 將聚丙烯酰胺在毛細管柱內交聯生成凝膠。其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分擴散，所得峰型尖銳，分離效率高。可分離測定蛋白質、DNA等。2021-9-23(3) (3) 毛細管膠束電動色譜（毛細管膠束電動色譜（MECC） 在緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，形成一疏水內核、外部帶負電的膠束。在電場力的作用下，膠束在柱中移動。由于電泳流和電滲流的方向相反，且電滲流 電泳 ，則帶負電的膠束以較慢的速度向負極方向移動，中性試樣分子在膠束相和溶液（水相）兩相間分配，疏水性強的組

8、分與膠束結合的較牢，流出時間長。可用來分離中性物質，擴展了高效毛細管電泳的應用范圍。2021-9-23二、儀器裝置二、儀器裝置 電壓：030KV。 分離柱不涂敷任何固定液， 紫外或激光誘導熒光檢測器（可檢測到：10-1910-21 mol/L）2021-9-23三、影響柱效的因素及改進方法三、影響柱效的因素及改進方法熱效應熱效應：焦耳熱仍是影響柱效的主要因素。采用外部冷卻的方法散熱，擇合適的電壓和電解質也是提高柱效的有效途徑。選擇合適的電解質降低電阻，電流低于200微安，一般幾十微安。電滲流控制電滲流控制：電滲流的大小和方向依賴于毛細管壁與溶液間電勢的極性和大小。使用添加劑可以改變電滲流的大小

9、和方向，如添加NaCl和甲醇可降低電滲流；加入乙腈則可以增大電滲流。加入反轉劑。則可以改變電滲流的方向。2021-9-23四、主要特點和應用四、主要特點和應用高分辨率：理論塔板數高達數百萬塊，甚至數千萬塊。高靈敏度：可檢測出低至10-21 mol/L濃度的物質。高分析速度：可在3分鐘內分離30種陰離子；1.7分鐘分離19種陽離子;4分鐘可分離10種蛋白質.試樣用量少：僅需幾nL（10-9 L）的試樣儀器簡單，操作成本低：分析一個試樣僅需幾毫升流動液。不足之處：不足之處：進樣不夠方便。應用范圍相對較窄。分析陰離子時，由陰極進樣，在陽極檢測。但電滲流方向與陰離子受電場力作用移動方向相反，出峰時間較

10、長。2021-9-23超臨界流體色譜一、一、超臨界流體色譜的特點與原理超臨界流體色譜的特點與原理feature and principle of SFC二二、超臨界流體色譜儀的結構流程、超臨界流體色譜儀的結構流程structure and general process of SFC 三、超臨界流體色譜的應用三、超臨界流體色譜的應用application of SFCsupercritical fluid chromatograph, SFC2021-9-23Berger(產地：美國產地：美國)超臨界流體色譜儀超臨界流體色譜儀(SFC) 技術參數技術參數 1.流量0-70ml/min2.改性劑

11、0-100%3.多階程序升溫4.壓力程序主要特點主要特點1.分析速度比HPLC提高3-10倍2.溶劑成本是HPLC的1/3-1/403.可以連接氣相的FID檢測器,也可連接液相的UV,DAD等檢測器，更有MS檢測器4.杰出的手性化合物分離能力5.精密的超臨界流體控制技術2021-9-23JASCO(產地：產地： 日本日本)超臨界色譜儀超臨界色譜儀(SFC) 技術參數技術參數 1.流量范圍:0.001-10ml/min 2.最高壓力:30MPa 主要特點主要特點1.與泵一體的泵頭制冷裝置設計便于操作 2.獨有的SSQD系統,確保了被輸送介質的流速穩定 3.泵頭電子冷卻裝置保持泵頭溫度低于 4 4

12、.系統控制單元包括各種操作模式,如加入有機改性試劑 2021-9-23一、一、超臨界流體色譜的特點與原理principle and character of supercritical fluid chromatography1.1.概述概述 超臨界流體超臨界流體：在高于臨界壓力與臨界溫度時，物質的一種狀態。性質介于液體和氣體之間。 超臨界流體色譜(SFC)，80年代快速發展，具有液相、氣相色譜不具有的優點:（1 1）可處理高沸點、不揮發試）可處理高沸點、不揮發試樣；樣；（2 2）比）比LCLC有更高的柱效和分離有更高的柱效和分離效率。效率。2021-9-232. 超臨界流體性質（1 1）性質

13、介于液體和氣體之間）性質介于液體和氣體之間; ; 具有氣體的低黏度、液體的高密度，擴散系數位于兩具有氣體的低黏度、液體的高密度，擴散系數位于兩者之間。者之間。（2 2）可通過改變超臨界流體的密度（程序改變）調節組分）可通過改變超臨界流體的密度（程序改變）調節組分分離（類似于氣相色譜的程序升溫，液相色譜中的梯度淋分離（類似于氣相色譜的程序升溫，液相色譜中的梯度淋洗）。洗）。 超臨界流體的密度與壓力有關。超臨界流體的密度與壓力有關。2021-9-233.原理 SFC的流動相的流動相：超臨界流體；CO2、N2O、NH3 SFC的固定相的固定相：固體吸附劑（硅膠）或鍵合到載體（或毛細管壁）上的高聚物；

14、可使用液相色譜的柱填料。填充柱SFC和毛細管柱SFC； 分離機理：分離機理：吸附與脫附。組分在兩相間的分配系數不同而被分離； 通過調節流動相的壓力（調節流動相的密度），調整組分保留值；2021-9-23壓力效應： SFC的柱壓降大（比毛細管色譜大30倍），對分離有影響（柱前端與柱尾端分配系數相差很大，產生壓力效應）； 超臨界流體的密度受壓力在臨界壓力處最大，超過該點，影響小，超過臨界壓力20%，柱壓降對分離的影響小； 壓力效應：在SFC中，壓力變化對容量因子產生顯著影響，超流體的密度隨壓力增加而增加，密度增加提高溶劑效率，淋洗時間縮短。 CO2流動相，當壓力改變：7.09.0106 Pa，則：

15、 C16H34的保留時間 25min 5min。2021-9-23程序升壓2021-9-23二、二、超臨界流體色譜的結構與流程instrument structure and the general process of SFC1.1.結構流程結構流程 2021-9-232.主要部件（1）SFC的高壓泵的高壓泵 無脈沖的注射泵；通過電子壓力傳感器和流量檢測器，計算機控制流動相的密度和流量； （2）SFC的色譜柱和固定相的色譜柱和固定相 可以采用液相色譜柱和交聯毛細管柱； SFC的固定相：固體吸附劑（硅膠）或鍵合到載體（或毛細管壁）上的高聚物；專用的毛細管柱SFC；2021-9-23主要部件（3 3）流動相流動相 SFC的流動相：超臨界流體；CO2、N2O、NH3 CO2應用最廣泛；無色、無味、無毒、易得、對各類有機物溶解性好，在紫外光區無吸收；缺點：極性太弱；加少量甲醇等改性；（4 4）檢測器）檢測器 可采用液相色譜檢