1、1 第十一章第十一章 酶技術酶技術 2 第十一章第十一章 酶技術酶技術 定義：以酶為研究對象的各種生化技術的定義：以酶為研究對象的各種生化技術的 統稱。統稱。 包括：酶生物合成的調節技術包括：酶生物合成的調節技術 酶的分離純化技術酶的分離純化技術 酶反應動力學研究技術酶反應動力學研究技術 酶的分子修飾技術酶的分子修飾技術 酶、細胞核原生質體固定化技術酶、細胞核原生質體固定化技術 3 第一節第一節 酶生物合成的調節酶生物合成的調節 遺傳信息傳遞的中心法則遺傳信息傳遞的中心法則 蛋白質蛋白質 翻譯翻譯 轉錄轉錄 逆轉錄逆轉錄 復制復制 復制復制 DNA RNA 4 定義：定義：通過調節酶合成的量來

2、控制微生物通過調節酶合成的量來控制微生物 代謝速度的調節機制，是在基因轉錄水平上代謝速度的調節機制，是在基因轉錄水平上 進行的。進行的。 意義：意義：通過阻止酶的過量合成，節約生物通過阻止酶的過量合成，節約生物 合成的原料和能量。合成的原料和能量。 第一節第一節 酶生物合成的調節酶生物合成的調節 5 操縱子基因表達的協同單位 操縱子 結構基因（編碼蛋白質, structural gene, S） 控制部位 操縱基因（operator gene, O） 啟動子（promotor gene, P） （一）基因調控理論 Jacob and Monod的操縱子學說（operon theory） 6 基

3、因操縱子調節系統示意圖基因操縱子調節系統示意圖 調節基因調節基因 啟動基因啟動基因 操縱基因操縱基因 結構基因結構基因 DNA 轉錄轉錄 （-） RNA聚合酶聚合酶 （+） 轉錄轉錄 翻譯翻譯 mRNA 翻譯翻譯 阻遏蛋白阻遏蛋白 蛋白質蛋白質 誘導劑誘導劑 控制區控制區 信息區信息區 操縱子操縱子 7 調節基因調節基因(regulator gene)(regulator gene)： 可產生一種組成型可產生一種組成型調節蛋白調節蛋白(regulatory (regulatory protein)protein) （一種變構蛋白）（一種變構蛋白），通過與效應，通過與效應 物物(effector

4、) (effector) （包括誘導物和輔阻遏物）（包括誘導物和輔阻遏物） 的特異結合而發生變構作用，從而改變它與的特異結合而發生變構作用，從而改變它與 操縱基因的結合力。操縱基因的結合力。 調節基因常位于調控區的上游。調節基因常位于調控區的上游。 8 RPOSD N A C RP-cA M P 復 合 物 C RP+cA M P cAMP-CRP復合物的作用示意圖 啟動基因（啟動基因（promotor genepromotor gene）（啟動子）：）（啟動子）： 有兩個位點：有兩個位點： （1 1）RNARNA聚合酶的結合位點聚合酶的結合位點 （2 2）cAMP-CAPcAMP-CAP的結

5、合位點。的結合位點。 CAPCAP：分解代謝產物基因活化蛋白（：分解代謝產物基因活化蛋白（catabolite gene catabolite gene activator proteinactivator protein），又稱環腺苷酸受體蛋白），又稱環腺苷酸受體蛋白(cAMP (cAMP receptor proteinreceptor protein，CRPCRP）。）。 只有只有cAMP-CRPcAMP-CRP復合物結合到啟動子的位點上，復合物結合到啟動子的位點上，RNARNA 聚合酶才能結合到其在啟動子的位點上，酶的合成才聚合酶才能結合到其在啟動子的位點上，酶的合成才 能開始。能開始

6、。 9 操縱基因（操縱基因（Operater geneOperater gene）: : 位于啟動基因和結構基因之間的一段堿位于啟動基因和結構基因之間的一段堿 基順序，能特異性地與調節基因產生的變構基順序，能特異性地與調節基因產生的變構 蛋白結合，操縱酶合成的時機與速度。蛋白結合，操縱酶合成的時機與速度。 結構基因（結構基因（Structural geneStructural gene）: : 決定某一多肽的決定某一多肽的DNADNA模板，與酶有各自模板，與酶有各自 的對應關系，其中的遺傳信息可轉錄為的對應關系，其中的遺傳信息可轉錄為mRNAmRNA， 再翻譯為蛋白質。再翻譯為蛋白質。 10

7、( (二二) ) 酶合成調節的類型酶合成調節的類型 1.1.誘導誘導 (induction)(induction) 組成酶：細胞固有的酶類。組成酶：細胞固有的酶類。 誘導酶：是細胞為適應外來底物或其結構類似誘導酶：是細胞為適應外來底物或其結構類似 物而臨時合成的一類酶。物而臨時合成的一類酶。 2.2.阻遏阻遏 (repression) (repression) 分解代謝物阻遏分解代謝物阻遏(catabolite repression)(catabolite repression)：某：某 物質分解代謝的產物阻遏某些酶生物合成的現象。物質分解代謝的產物阻遏某些酶生物合成的現象。 反饋阻遏反饋阻遏

8、(feedback repression)(feedback repression)：即在合成過：即在合成過 程中有生物合成途徑的終點產物對該途徑的一系列酶的程中有生物合成途徑的終點產物對該途徑的一系列酶的 量調節量調節, ,所引起的阻遏作用所引起的阻遏作用 11 （三）酶合成的調節機制 1. 酶合成的誘導 加進某種物質，使酶生物合成開始或加速進行。 酶合成誘導的現象：酶合成誘導的現象： 已知分解利用乳糖的酶有：已知分解利用乳糖的酶有： -半乳糖苷酶；半乳糖苷酶； -半乳糖苷透過酶；硫代半乳糖苷轉乙酰酶半乳糖苷透過酶；硫代半乳糖苷轉乙酰酶。 實驗：實驗：（1）大腸桿菌生長在葡萄糖培養基上時，細

9、胞）大腸桿菌生長在葡萄糖培養基上時，細胞 內無上述三種酶合成；內無上述三種酶合成； （2）大腸桿菌生長在乳糖培養基上時，細胞內有）大腸桿菌生長在乳糖培養基上時，細胞內有 上述三種酶合成；上述三種酶合成； （3）表明菌體生物合成的經濟原則：）表明菌體生物合成的經濟原則：需要時才合成。需要時才合成。 12 調節調節 基因基因 操縱操縱 基因基因 乳糖結構基因乳糖結構基因 P LacZLacYLaca mRNA 阻遏蛋白阻遏蛋白 （有活性）（有活性） 基基 因因 關關 閉閉 啟啟 動動 子子 OR PLacZLacYLaca 調節調節 基因基因 操縱操縱 基因基因 乳糖結構基因乳糖結構基因 啟啟 動

10、動 子子 O R mRNAZmRNAYmRNAa 阻遏蛋白阻遏蛋白 （無活性）（無活性） 基基 因因 表表 達達 mRNA A、乳糖操縱子的結構、乳糖操縱子的結構 B、乳糖酶的誘導、乳糖酶的誘導 乳糖乳糖 阻遏蛋白阻遏蛋白 （有活性）（有活性） 誘導誘導 13 誘導物的選擇誘導物的選擇 分為三類分為三類 （1）酶的作用底物；）酶的作用底物； （2）酶的反應產物；）酶的反應產物； （3）酶的底物類似物：最有效）酶的底物類似物：最有效 14 酶誘導合成的條件酶誘導合成的條件 （1）基因必須完整。）基因必須完整。 a. 結構基因改變結構基因改變 b. 同一操縱子中第一個結構基因破壞同一操縱子中第一個

11、結構基因破壞 c. 操縱基因變異操縱基因變異 d. 調節基因變異調節基因變異 調節基因調節基因 啟動基因啟動基因 操縱基因操縱基因 結構基因結構基因 15 酶誘導合成的條件酶誘導合成的條件 （2）阻抑蛋白本來與操縱基因的親和力強，）阻抑蛋白本來與操縱基因的親和力強， 兩者原來結合在一起，使酶不能合成；兩者原來結合在一起，使酶不能合成； （3）在添加誘導物時，細胞所處環境中，）在添加誘導物時，細胞所處環境中， 不能有高濃度的分解代謝阻遏物或其他強不能有高濃度的分解代謝阻遏物或其他強 阻遏劑存在，否則將無法誘導。阻遏劑存在，否則將無法誘導。 16 酶誘導合成的檢測酶誘導合成的檢測 一般通過測定酶活

12、力的方法進行檢測。一般通過測定酶活力的方法進行檢測。 胞外酶：誘導一定時間后，取培養液測定胞外酶：誘導一定時間后，取培養液測定 酶活力；酶活力； 胞內酶：破碎細胞后測定酶活力。胞內酶：破碎細胞后測定酶活力。 17 2. 2.末端產物阻遏末端產物阻遏 由某代謝途徑末端產物的過量累積引起的阻遏由某代謝途徑末端產物的過量累積引起的阻遏。 酶合成阻遏的現象：酶合成阻遏的現象： 實驗：實驗： （1）大腸桿菌生長在無機鹽和葡萄糖的培養基上時，）大腸桿菌生長在無機鹽和葡萄糖的培養基上時， 檢測到細胞內有色氨酸合成酶的存在；檢測到細胞內有色氨酸合成酶的存在； （2）在上述培養基中加入色氨酸，檢測發現細胞內色）

13、在上述培養基中加入色氨酸，檢測發現細胞內色 氨酸合成酶的活性降低，直至消失。氨酸合成酶的活性降低，直至消失。 （3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成， 體現了菌體生長的經濟原則體現了菌體生長的經濟原則:不需要就不合成。不需要就不合成。 18 色氨酸操縱子色氨酸操縱子酶的阻遏酶的阻遏 調節基因調節基因 操縱基因操縱基因 結構基因結構基因 mRNAmRNA 酶蛋白酶蛋白 阻遏蛋白不能與操縱基阻遏蛋白不能與操縱基 因結合，結構基因表達因結合，結構基因表達 調節基因調節基因 操縱基因操縱基因 結構基因結構基因 輔阻遏物輔阻遏物 代謝產物與阻遏蛋白結代

14、謝產物與阻遏蛋白結 合，使之構象發生變化合，使之構象發生變化 與操縱基因結合，結構與操縱基因結合，結構 基基 因不能表達因不能表達 19 酶酶 的的 誘誘 導導 和和 阻阻 遏遏 操操 縱縱 子子 模模 型型 B.有活性阻遏蛋白加誘導劑有活性阻遏蛋白加誘導劑 A.有活性阻遏蛋白有活性阻遏蛋白 C.無活性阻遏蛋白無活性阻遏蛋白 D.無活性阻遏蛋白加輔阻遏劑無活性阻遏蛋白加輔阻遏劑 操縱基因操縱基因啟動基因啟動基因 調節基因調節基因結構基因結構基因 阻遏蛋白阻遏蛋白 (有活性有活性) 阻遏蛋白阻擋操縱基因阻遏蛋白阻擋操縱基因 結構基因不表達結構基因不表達 誘導物誘導物 誘導物與阻遏蛋白結合誘導物與

15、阻遏蛋白結合,使阻遏蛋白不能起使阻遏蛋白不能起 到阻擋操縱基因的作用到阻擋操縱基因的作用,結構基因可以表達結構基因可以表達 酶蛋白酶蛋白 mRNA 阻遏蛋白不能跟操縱基因結合阻遏蛋白不能跟操縱基因結合, 結構基因可以表達結構基因可以表達 阻遏蛋白阻遏蛋白(無活性無活性) 酶蛋白酶蛋白 mRNA 代謝產物與阻遏蛋白結合代謝產物與阻遏蛋白結合,從而使阻遏蛋從而使阻遏蛋 白能夠阻擋操縱基因白能夠阻擋操縱基因,結構基因不表達結構基因不表達 代謝產物代謝產物 20 調控方式調控方式 阻遏蛋白阻遏蛋白 添加物添加物 與操縱基與操縱基 因結合因結合 阻遏效應阻遏效應舉例舉例 酶的誘導酶的誘導有活性有活性不轉

16、錄，不轉錄， 繼而不翻譯繼而不翻譯 誘導物誘導物轉錄，轉錄， 繼而翻譯繼而翻譯 乳糖操乳糖操 縱子縱子 酶的阻遏酶的阻遏無活性無活性 阻遏物阻遏物不轉錄，不轉錄， 繼而不翻譯繼而不翻譯 色氨酸色氨酸 操縱子操縱子 酶合成的誘導與阻遏操縱子模型調控作用對比酶合成的誘導與阻遏操縱子模型調控作用對比 21 3.3.分解代謝物阻遏分解代謝物阻遏 指細胞內同時有兩種分解底物（碳源或氮指細胞內同時有兩種分解底物（碳源或氮 源）存在時，利用快的那種分解底物會阻源）存在時，利用快的那種分解底物會阻 遏利用慢的底物的有關酶合成的現象。遏利用慢的底物的有關酶合成的現象。 分解代謝物的阻遏作用，并非由于快速利分解代

17、謝物的阻遏作用，并非由于快速利 用的甲碳源本身直接作用的結果，而是通用的甲碳源本身直接作用的結果，而是通 過甲碳源（或氮源等）在其分解過程中所過甲碳源（或氮源等）在其分解過程中所 產生的中間代謝物所引起的阻遏作用。產生的中間代謝物所引起的阻遏作用。 22 分解代謝物阻遏現象：分解代謝物阻遏現象： 實驗：實驗：細菌在含有葡萄糖和乳糖的培養基上生長，優細菌在含有葡萄糖和乳糖的培養基上生長，優 先利用葡萄糖。待葡萄糖耗盡后才開始利用乳糖，產先利用葡萄糖。待葡萄糖耗盡后才開始利用乳糖，產 生了兩個對數生長期中間隔開一個生長延滯期的生了兩個對數生長期中間隔開一個生長延滯期的“二二 次生長現象次生長現象”

18、(diauxie(diauxie或或biphasic growthbiphasic growth）。）。 02468 0 20 40 60 80 細胞 濃 度(OD) 時 間(h) 這一現象又稱葡萄糖效應，這一現象又稱葡萄糖效應， 產生的原因是由于葡萄糖降解產生的原因是由于葡萄糖降解 物阻遏了分解乳糖酶系的合成。物阻遏了分解乳糖酶系的合成。 此調節基因的產物是環腺苷酸此調節基因的產物是環腺苷酸 受體蛋白（受體蛋白（CRPCRP）, ,亦稱降解物亦稱降解物 基因活化蛋白（基因活化蛋白（CAPCAP）。）。 23 分解代謝物阻遏分解代謝物阻遏 RLacZLacYLaca mRNA mRNAZmRN

19、AYmRNAa 基基 因因 表表 達達 CAP 基因基因 結構基因結構基因 T CAP O CAP結結 合部位合部位 RNA 聚合酶聚合酶 T cAMP -CAP P 葡萄糖葡萄糖 分解代分解代 謝產物謝產物 腺苷酸腺苷酸 環化酶環化酶 磷酸二酯磷酸二酯 酶酶 ATP cAMP 5-AMP 抑制抑制 激活激活 葡萄糖降解物與葡萄糖降解物與cAMP的關系的關系 cAMP CAP：降解物基因活化蛋白（：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein） 降低降低cAMP濃度濃度 使使CAP呈失活狀態呈失活狀態 24 第二節第二節 酶反應動力學的研究酶反應動力學

20、的研究 主要包括：主要包括： 酶反應初速度的測定酶反應初速度的測定 底物濃度對酶反應速率的影響底物濃度對酶反應速率的影響 米氏常數和最大反應速度的測定米氏常數和最大反應速度的測定 溫度、溫度、pH、抑制劑等對反應速度的影響、抑制劑等對反應速度的影響 酶反應活化能的測定酶反應活化能的測定 激活劑的作用激活劑的作用 抑制類型的確定抑制類型的確定 25 斜率斜率=P/ t = V（初速度）（初速度） P t 開始一段時間內反應速度幾乎開始一段時間內反應速度幾乎 維持恒定，即產物生成量與時維持恒定，即產物生成量與時 間成直線關系間成直線關系 一、酶反應初速度的測定一、酶反應初速度的測定 為正確測量酶促

21、反應速度并避免干擾就必須測定反應初期為正確測量酶促反應速度并避免干擾就必須測定反應初期 干擾因素還來不及起作用時的速度，稱之為干擾因素還來不及起作用時的速度，稱之為反應初速度反應初速度。 （1）測量單位時間內底物的消耗量）測量單位時間內底物的消耗量 （2）測量單位時間內產物的生成量）測量單位時間內產物的生成量 26 測定的一般步驟測定的一般步驟 （1）選擇適宜的底物；）選擇適宜的底物； （2）確定酶反應的溫度和）確定酶反應的溫度和pH條件；條件； （3）準備就緒后，將酶液加到底物中，開）準備就緒后，將酶液加到底物中，開 始反應，計時；始反應，計時； （4）每隔一定時間測定產物生成量；）每隔一定

22、時間測定產物生成量； （5）作圖：以反應時間為橫坐標，產物生）作圖：以反應時間為橫坐標，產物生 成量為縱坐標作圖。成量為縱坐標作圖。 27 二、底物濃度對反應速度的影響二、底物濃度對反應速度的影響 Km和和vmax的測定的測定 1 1、底物濃度對酶促反應速度的影響、底物濃度對酶促反應速度的影響 28 在低底物濃度時在低底物濃度時, 反應速度與底物濃度成正比，表現反應速度與底物濃度成正比，表現 為一級反應特征。為一級反應特征。 當底物濃度達到一定值，幾乎所有的酶都與底物結合當底物濃度達到一定值，幾乎所有的酶都與底物結合 后，反應速度達到最大值（后，反應速度達到最大值（Vmax），此時再增加底），

23、此時再增加底 物濃度，反應速度不再增加，表現為零級反應。物濃度，反應速度不再增加，表現為零級反應。 S v Vmax 一級反應一級反應 v = k S 零級反應零級反應 v = k E 混合級反應混合級反應 29 單分子酶促反應的米氏方程及單分子酶促反應的米氏方程及Km 推導原則推導原則：從酶被底物飽和的現象出發，按照從酶被底物飽和的現象出發，按照 “穩態平衡穩態平衡”假說的設想進行推導。假說的設想進行推導。 1 k SE 2 k ES 3 k EP SK SV v m max 1 32 k kk K m 米氏方程米氏方程: 米氏常數米氏常數: 2 kk4 30 酶反應速度與底物濃度的關系曲線

24、酶反應速度與底物濃度的關系曲線 * 當當v=Vmax/2時，時，Km=S（ Km的單位為濃度單位）的單位為濃度單位） * 是酶在一定條件下的特征物理常數，通過測定是酶在一定條件下的特征物理常數，通過測定Km的數值，的數值， 可鑒別酶?？设b別酶。 31 Km和和vmax的測定的測定 求求Km和和vmax采用直接作圖法采用直接作圖法 從從vS圖，找出圖，找出1/2 Vmax ，查出，查出SKm 但但S無論怎樣大，也只能趨近無論怎樣大，也只能趨近Vmax，故，故1/2 Vmax不準，且點也不準，且點也 要多。要多。 32 (1). 雙倒數作圖法（最常用）雙倒數作圖法（最常用） 改寫改寫M氏方程為：氏

25、方程為：1/v = Km/Vmax (1/S )+ 1/ Vmax 33 (2). 伊蒂-霍夫斯第方程 34 三、最適溫度、熱穩定性和活化能的測定三、最適溫度、熱穩定性和活化能的測定 1.最適溫度測定最適溫度測定 在達到最適溫度以前，反在達到最適溫度以前，反 應速度隨溫度升高而加快應速度隨溫度升高而加快 酶是蛋白質，其變性速度酶是蛋白質，其變性速度 亦隨溫度上升而加快亦隨溫度上升而加快 酶的最適溫度不是一個固酶的最適溫度不是一個固 定不變的常數定不變的常數 在較低的溫度范圍內，酶反應速率隨溫度升高而增大，在較低的溫度范圍內，酶反應速率隨溫度升高而增大， 但超過一定溫度后，反應速率反而下降，因此

26、只有在某一但超過一定溫度后，反應速率反而下降，因此只有在某一 溫度下，反應速率達到最大值，這個溫度通常就稱為酶反溫度下，反應速率達到最大值，這個溫度通常就稱為酶反 應的應的最適溫度最適溫度。 102030405060708090 0 20 40 60 80 100 Temperature OC Relative Activity (%) 35 2. 熱穩定性測定熱穩定性測定 測定方法：測定方法： （1）溫度不同，作用時間相同時的酶反應）溫度不同，作用時間相同時的酶反應 速度，計算不同溫度下相對酶反應速度；速度，計算不同溫度下相對酶反應速度； （2）測定較高溫度下，不同時間的酶反應）測定較高溫度

27、下，不同時間的酶反應 速度。速度。 36 3.活化能測定活化能測定 反應活化能的一般測定方法是測定不同溫反應活化能的一般測定方法是測定不同溫 度下的反應速率常數，根據阿累尼烏斯公度下的反應速率常數，根據阿累尼烏斯公 式：式： lnk=lnA-Ea/RT 以以lnk對對1/T作圖，圖像為直線，其斜率為作圖，圖像為直線，其斜率為- Ea/R，從而計算出，從而計算出Ea。 37 四、最適四、最適pH值的測定值的測定 pH影響酶活力的原因：影響酶活力的原因： 過酸過堿導致酶蛋白變性過酸過堿導致酶蛋白變性 影響底物分子解離狀態影響底物分子解離狀態 影響酶分子解離狀態影響酶分子解離狀態 影響酶的活性中心構

28、象影響酶的活性中心構象 38 酶的活力受環境酶的活力受環境pH的的 影響，在一定影響，在一定pH下，下， 酶表現最大活力，酶表現最大活力， 高于或低于此高于或低于此pH，酶，酶 活力降低，通常把表活力降低，通常把表 現出酶最大活力的現出酶最大活力的 pH稱為該酶的最適稱為該酶的最適pH （optimum pH）。）。 v 最適最適pH （optimum pH） pH 39 五、酶的激活與抑制五、酶的激活與抑制 凡是能提高酶活性的物質，稱為凡是能提高酶活性的物質，稱為酶的激活劑酶的激活劑 （activator） 激活劑主要類別：激活劑主要類別： 金屬離子：金屬離子：K K+ +、NaNa+ +、

29、 Mg Mg2+ 2+、 、CuCu2+ 2+、Mn Mn2+ 2+、Zn Zn2+ 2+、Se Se3+ 3+ 、 、 CoCo2+ 2+、 、FeFe2+ 2+ 陰離子：陰離子： Cl-、Br- 有機分子有機分子 還原劑：抗壞血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽還原劑：抗壞血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽 金屬螯合劑：金屬螯合劑：EDTA 40 凡是使酶的必需基團或酶的活性部位中的基團的化凡是使酶的必需基團或酶的活性部位中的基團的化 學性質改變而降低酶活力甚至使酶完全喪失活性學性質改變而降低酶活力甚至使酶完全喪失活性 的物質，叫酶的的物質，叫酶的抑制劑抑制劑（inhibitor） 。 類型類型：可逆抑制劑可逆

30、抑制劑 不可逆抑制劑不可逆抑制劑:不能用透析或超濾等方法去除不能用透析或超濾等方法去除 酶與抑制劑非共價地可逆結合，當用透析或超濾等酶與抑制劑非共價地可逆結合，當用透析或超濾等 方法除去抑制劑后酶的活性可以恢復，這種抑制方法除去抑制劑后酶的活性可以恢復，這種抑制 作用叫作用叫可逆抑制作用可逆抑制作用。 抑制劑對酶作用的影響抑制劑對酶作用的影響 41 抑制劑類型和特點 競爭性抑制劑競爭性抑制劑 可逆可逆抑制劑抑制劑 非競爭性抑制劑非競爭性抑制劑 反競爭性抑制劑反競爭性抑制劑 非專一性不可逆抑制劑非專一性不可逆抑制劑 不可逆抑制劑不可逆抑制劑 專一性不可逆抑制劑專一性不可逆抑制劑 抑制劑與酶的必須

31、基團以共價鍵抑制劑與酶的必須基團以共價鍵 結合而引起酶活力喪失，不能用結合而引起酶活力喪失，不能用 透析、超濾等物理方法除去抑制透析、超濾等物理方法除去抑制 劑而使酶復活，稱劑而使酶復活，稱不可逆抑制（不可逆抑制（ irreversible inhibition）。）。 抑制劑與酶的必須基團以共價鍵結抑制劑與酶的必須基團以共價鍵結 合而引起酶活力喪失，能用物理方合而引起酶活力喪失，能用物理方 法除去抑制劑而使酶復活，稱法除去抑制劑而使酶復活，稱可逆可逆 抑制（抑制（reversible inhibition）。）。 42 + I EI ES P+ E E+S 競爭性抑制作用競爭性抑制作用 可通

32、過增加底物濃可通過增加底物濃 度削弱或解除這種度削弱或解除這種 抑制作用。抑制作用。 抑制劑（抑制劑（I）和底物（）和底物（S）競爭酶的結合部位，從而影響）競爭酶的結合部位，從而影響 了底物與酶的正常結合。酶的活性部位不能同時既與了底物與酶的正常結合。酶的活性部位不能同時既與 底物結合又與抑制劑結合，因而在底物和抑制劑之間底物結合又與抑制劑結合，因而在底物和抑制劑之間 產生競爭，形成一定的平衡關系。產生競爭，形成一定的平衡關系。 大多數競爭性抑制劑的結構與底物結構類似如：大多數競爭性抑制劑的結構與底物結構類似如：丙二丙二 酸是琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制劑。酸是琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制劑。 43

33、競爭性抑制中，競爭性抑制中， Vmax不變，不變， Km增大，即達到相同最大速度所需的底物濃度增多。增大，即達到相同最大速度所需的底物濃度增多。 44 非競爭性抑制作用非競爭性抑制作用 + I EI+SESI ES P+ E E+S + I 實例：重金屬離子（實例：重金屬離子（Cu2+、Hg2+、Ag+、Pb2+） 金屬絡合劑（金屬絡合劑（EDTA、F-、CN-、N3-） 作用特點：作用特點：底物和抑制劑同時和酶底物和抑制劑同時和酶 結合兩者沒有競爭作用。酶與抑制結合兩者沒有競爭作用。酶與抑制 劑結合后還可以與底物結合；酶與劑結合后還可以與底物結合；酶與 底物結合后還可以與抑制劑結合。底物結合

34、后還可以與抑制劑結合。 但是中間的三元復合物不能進一步但是中間的三元復合物不能進一步 分解為產物，因此酶活性降低。分解為產物，因此酶活性降低。 這類抑制劑與酶活性部位以外的基團這類抑制劑與酶活性部位以外的基團 相結合，其結構與底物無共同之處，相結合，其結構與底物無共同之處， 這種抑制作用不能用增加底物濃度這種抑制作用不能用增加底物濃度 來解除抑制，故稱來解除抑制，故稱非競爭性抑制。非競爭性抑制。 這種抑制作用不能用增加底物濃度這種抑制作用不能用增加底物濃度 的方法來消除。的方法來消除。 45 非競爭性抑制中，非競爭性抑制中，Vmax變小，變小， Km不變，即在底物濃度不變情況下，降低了反應的最

35、大不變，即在底物濃度不變情況下，降低了反應的最大 速率。速率。 46 反競爭性抑制作用反競爭性抑制作用 ESI ES P+ E E+S + I 作用特點：酶只有與底物結合后，才能與抑制劑結合。作用特點：酶只有與底物結合后，才能與抑制劑結合。 47 反競爭性抑制中，反競爭性抑制中， Vmax變小，變小， Km變小變小11111 48 第三節、酶、細胞和原生質體固定第三節、酶、細胞和原生質體固定 化技術化技術 固定化生物技術固定化生物技術 通過化學或物理的手段將酶或游離細胞通過化學或物理的手段將酶或游離細胞 定位于限定的空間區域內，使其保持活性定位于限定的空間區域內，使其保持活性 并可反復利用。并

36、可反復利用。 49 游離酶的缺點：游離酶的缺點： 1.酶是蛋白質，穩定性差（熱、酸堿、有機酶是蛋白質，穩定性差（熱、酸堿、有機 溶劑對其有影響）。溶劑對其有影響）。 2.不能回收，也使產物中混雜酶蛋白。不能回收，也使產物中混雜酶蛋白。 3.分離純化困難。分離純化困難。 50 51 一、固定化酶和固定化細胞的定義一、固定化酶和固定化細胞的定義 及特點及特點 1.固定化酶固定化酶(immobilized enzyme) 固定在載體上并在一定空間范圍內進行固定在載體上并在一定空間范圍內進行 催化反應的酶。催化反應的酶。 52 水溶性酶水溶性酶水不溶性載體水不溶性載體 水不溶性酶水不溶性酶 （固定化酶

37、）（固定化酶） 固定化技術固定化技術 什么是固定化酶？什么是固定化酶？ 53 優點：優點： (1)可提高穩定性?？商岣叻€定性。 (2)能回收，易與產物分離，可反復使用。能回收，易與產物分離，可反復使用。 缺點：缺點： (1)存在擴散限制。適于催化小分子物質。存在擴散限制。適于催化小分子物質。 (2)酶活性下降。酶活性下降。 54 2. 固定化細胞（固定化細胞（immobilized cell） 固定在載體上并在一定空間范圍內進行生固定在載體上并在一定空間范圍內進行生 命活動（生長、繁殖、新陳代謝）的細胞。命活動（生長、繁殖、新陳代謝）的細胞。 55 優越性：優越性： (1)降低成本，省去酶的分

38、離純化工作降低成本，省去酶的分離純化工作; (2)既可作為單一酶，也可作為復合酶系完既可作為單一酶，也可作為復合酶系完 成部分代謝過程。成部分代謝過程。 局限性：局限性： (1)細胞內多種酶的存在，會形成不需要的細胞內多種酶的存在，會形成不需要的 副產物。副產物。 (2)細胞膜、細胞壁和載體都存在著擴散限細胞膜、細胞壁和載體都存在著擴散限 制作用。制作用。 56 3.固定化原生質體固定化原生質體 意義：意義： (1)固定化原生質體去除了細胞壁的擴散障固定化原生質體去除了細胞壁的擴散障 礙，有利于氧的傳遞，營養成分的吸收和礙，有利于氧的傳遞，營養成分的吸收和 胞內產物的分泌。胞內產物的分泌。 (

39、2)原生質體不穩定，容易破裂，固定化后，原生質體不穩定，容易破裂，固定化后， 由于載體的保護作用，穩定性提高。由于載體的保護作用，穩定性提高。 57 固定化方法固定化方法 （一）酶的固定化方法（一）酶的固定化方法 吸附法吸附法共價偶聯法共價偶聯法交聯法交聯法包埋法包埋法 網格型網格型微囊型微囊型離子交離子交 換吸附換吸附 物理物理 吸附法吸附法 二、固定化方法二、固定化方法 58 1.吸附法（吸附法（adsorption） 依據帶電的酶或細胞和載體之間的依據帶電的酶或細胞和載體之間的靜電作靜電作 用用，使酶吸附于惰性固體的表面或離子交，使酶吸附于惰性固體的表面或離子交 換劑上。換劑上。 59

40、根據吸附劑的特點分根據吸附劑的特點分: 1）物理吸附法（）物理吸附法（physical adsortion） 作用力：作用力：氫鍵、疏水鍵氫鍵、疏水鍵 常用載體：常用載體：氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、 多孔玻璃、多孔玻璃、 硅膠、羥基磷灰石、纖維素等。硅膠、羥基磷灰石、纖維素等。 2）離子結合法（）離子結合法（ion binding） 作用力：作用力：離子鍵離子鍵 常用載體：常用載體：DEAE-纖維素、纖維素、DEAE-葡聚糖葡聚糖 凝膠、凝膠、CM-纖維素纖維素 60 優點：優點：條件溫和，操作簡便，酶活力損條件溫和，操作簡便，酶活力損 失少。失少。 缺點：缺點：結合

41、力弱，易解吸附結合力弱，易解吸附。 61 2.共價偶聯法（共價偶聯法（covalent binding or covalent coupling） 借助共價鍵借助共價鍵 將酶的將酶的活性活性 非必需側鏈非必需側鏈 基團基團和載體和載體 的功能基團的功能基團 進行偶聯。進行偶聯。 62 1）載體：親水載體優于疏水載體）載體：親水載體優于疏水載體 如如:天然高分子衍生物天然高分子衍生物: 纖維素纖維素 葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠 親和性好，機械性能差親和性好，機械性能差 瓊脂糖瓊脂糖 合成聚合物：合成聚合物： 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 聚苯乙烯聚苯乙烯 機械性能好，但有疏水結構機械性能好，但有疏水結構 尼龍

42、尼龍 63 2）偶聯方法：）偶聯方法： 偶聯成功與否取決于：偶聯成功與否取決于： 載體：載體：功能基團：芳香氨基，羧基，羧甲功能基團：芳香氨基，羧基，羧甲 基等?；?。 酶分子酶分子:側鏈非必需基團：羧基，巰基，羥側鏈非必需基團：羧基，巰基，羥 基，酚基，咪唑基?；踊溥蚧?。 64 常用的偶聯反應有：常用的偶聯反應有： 重氮化法重氮化法; 疊氮法疊氮法; 溴化氰法溴化氰法; 烷基化法等。烷基化法等。 65 優點：優點：酶與載體結合牢固，不會輕易酶與載體結合牢固，不會輕易 脫落，可連續使用。脫落，可連續使用。 缺點：缺點：反應條件較激烈，易影響酶的反應條件較激烈，易影響酶的 空間構象而影響

43、酶的催化活性。空間構象而影響酶的催化活性。 66 借助雙功能試劑使酶分子之間發生交聯的借助雙功能試劑使酶分子之間發生交聯的 固定化方法。固定化方法。 雙功能試劑：雙功能試劑： 常用的是戊二醛常用的是戊二醛 3.交聯法（交聯法（crosslinking） O O H C CH2 CH2 CH2 C H 67 戊二醛有兩戊二醛有兩 個醛基，均可與個醛基，均可與 酶或蛋白質的游酶或蛋白質的游 離氨基反應離氨基反應, ,使酶使酶 蛋白交聯。蛋白交聯。 此法與共價偶聯法利用的均是共價鍵，此法與共價偶聯法利用的均是共價鍵， 不同之處：不同之處：交聯法不使用載體交聯法不使用載體。 68 交聯反應既能發生在分

44、子間，也可發生在交聯反應既能發生在分子間，也可發生在 分子內。分子內。 酶濃度酶濃度低低時，交聯發生在時，交聯發生在分子內分子內，酶仍保，酶仍保 持持溶解狀態溶解狀態。 酶濃度酶濃度高高時，交聯發生在時，交聯發生在分子間分子間，酶變為，酶變為 不溶態不溶態。 69 缺點：缺點： (1)反應條件激烈，酶分子的多個基團被交反應條件激烈，酶分子的多個基團被交 聯，酶活力損失大。聯，酶活力損失大。 (2)制備的固定化酶顆粒較小，給使用帶來制備的固定化酶顆粒較小，給使用帶來 不便。不便。 70 4. 包埋法（包埋法（entrapment） 將酶用物理的方法包將酶用物理的方法包 埋在各種載體（高聚埋在各種

45、載體（高聚 物）內。分為：物）內。分為： 網格型：網格型：將酶包埋在將酶包埋在 高分子凝膠細微網格高分子凝膠細微網格 中。中。 微囊型：微囊型：將酶包埋在將酶包埋在 高分子半透膜中。高分子半透膜中。 71 1）網格型包埋法網格型包埋法 （gel (lattic) entrapmentgel (lattic) entrapment） 又稱凝膠包埋法又稱凝膠包埋法 凝膠凝膠包埋條件包埋條件 酶活性酶活性強度強度 天然凝膠天然凝膠 瓊脂、海藻酸鈣、瓊脂、海藻酸鈣、 角叉菜膠、明膠角叉菜膠、明膠 溫和溫和不變不變差差 合成凝膠合成凝膠 聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺、 光交聯樹脂光交聯樹脂 聚合反應聚合反應

46、部分失活部分失活 高高 使用的多孔載體及其特點使用的多孔載體及其特點 72 海藻酸鈣凝膠包埋法：海藻酸鈣凝膠包埋法： 滴至滴至 海藻酸鈉溶液海藻酸鈉溶液E (or cell) CaCl2 溶液中溶液中 IE(or IC) 角叉菜膠包埋法：角叉菜膠包埋法： 滴至滴至 角叉菜膠角叉菜膠E (or cell) KCl 溶液中溶液中 IE (or IC) 聚丙烯酰胺凝膠包埋法：聚丙烯酰胺凝膠包埋法： AP（過硫酸銨）（過硫酸銨） Acr+ Bis+E (or cell) IE (or IC) TEMED (四甲基乙二胺四甲基乙二胺) 73 2）微囊型包埋法）微囊型包埋法 （microencapsula

47、tion） 又稱半透膜包埋法又稱半透膜包埋法 將一定量酶液包在半透性的高分子微孔將一定量酶液包在半透性的高分子微孔 膜內膜內 。半透膜：直徑幾十微米到幾百微米，。半透膜：直徑幾十微米到幾百微米， 厚約厚約25nm。 半透膜孔徑半透膜孔徑80%活性?；钚?。 （一）、固定化酶的性質（一）、固定化酶的性質 87 可能的原因：可能的原因： 固定化增加了酶活性構象的牢固程度，固定化增加了酶活性構象的牢固程度， 可防止酶分子伸展變形；可防止酶分子伸展變形； 抑制酶的自身降解。抑制酶的自身降解。 固定化部分阻擋了外界不利因素對酶固定化部分阻擋了外界不利因素對酶 的侵襲。的侵襲。 88 3. 酶的最適溫度酶的

48、最適溫度 最適溫度與酶穩定性有關。最適溫度與酶穩定性有關。 多數酶固定化后熱穩定性上升，最適溫多數酶固定化后熱穩定性上升，最適溫 度也上升（有例外）。度也上升（有例外）。 4. 酶的最適酶的最適pH 帶負電荷載體帶負電荷載體 ：最適：最適pH 向堿性偏移。向堿性偏移。 帶正電荷載體帶正電荷載體 ：最適：最適pH 向酸性偏移。向酸性偏移。 89 5. 酶的動力學特征酶的動力學特征 固定化酶的表觀米氏常數固定化酶的表觀米氏常數Km隨載體的帶電隨載體的帶電 性能變化。性能變化。 固定化載體與底物電荷固定化載體與底物電荷相反相反，固定化酶，固定化酶 的表觀的表觀Km值值降低降低。 固定化載體與底物電荷

49、固定化載體與底物電荷相同相同，固定化酶，固定化酶 的表觀的表觀Km值顯著值顯著增加增加。 90 6. 酶的作用專一性酶的作用專一性 與自然酶基本相同。但大分子底物難于接近與自然酶基本相同。但大分子底物難于接近 酶分子，導致酶的專一性發生改變。酶分子，導致酶的專一性發生改變。 91 （二）、固定化細胞的性質（二）、固定化細胞的性質 與固定化酶相比，固定化細胞的情況比較與固定化酶相比，固定化細胞的情況比較 復雜復雜。 （1）有活性升高的現象。）有活性升高的現象。 （2）穩定性的增加）穩定性的增加 。 （3）最適溫度和最適）最適溫度和最適pH常保持不變。常保持不變。 92 （三）、固定化酶（細胞）的

50、評價（三）、固定化酶（細胞）的評價 指標指標 1. 酶酶(細胞細胞)的活力的活力 固定化酶通常呈顆粒狀，一般用于測定固定化酶通常呈顆粒狀，一般用于測定 自然酶活力的方法改進后才能用于測定固自然酶活力的方法改進后才能用于測定固 定化酶。定化酶。 2. 蛋白總量蛋白總量 1.雙辛可寧酸法雙辛可寧酸法(BCA法法) 2.考馬斯亮藍法考馬斯亮藍法 93 3. 偶聯率及相對活力偶聯率及相對活力 偶聯率偶聯率=(加入蛋白活力加入蛋白活力-上清液蛋白活力上清液蛋白活力)/加加 入蛋白活力入蛋白活力100% 活力回收活力回收=固定化酶總活力固定化酶總活力/加入酶的總活力加入酶的總活力 100% 相對活力相對活

51、力=固定化酶總活力固定化酶總活力/ (加入酶的總活加入酶的總活 力力-上清液中未偶聯酶活力上清液中未偶聯酶活力)100% 94 4. 半衰期半衰期 在連續測定條件下，固定化酶在連續測定條件下，固定化酶(細胞細胞)的活的活 力下降為最初活力一半所經歷的連續工作力下降為最初活力一半所經歷的連續工作 時間，以時間，以t1/2表示。表示。 是衡量穩定性的一項重要指標。是衡量穩定性的一項重要指標。 95 第四節第四節 酶分子修飾酶分子修飾 酶在生物技術與工程中占有十分重要的地位。酶在生物技術與工程中占有十分重要的地位。 酶所具有的反應專一性、催化高效性及反酶所具有的反應專一性、催化高效性及反 應條件溫和

52、等優點，使其廣泛應用在工業、應條件溫和等優點，使其廣泛應用在工業、 農業、醫藥、環保及能源等領域。農業、醫藥、環保及能源等領域。 由于酶的本質是蛋白質的特點，在催化反應由于酶的本質是蛋白質的特點，在催化反應 中受到中受到穩定性、反應條件穩定性、反應條件等制約，早期能等制約，早期能 大規模應用的酶還不夠多，酶工藝也不完大規模應用的酶還不夠多，酶工藝也不完 善。善。 96 酶在使用中的缺陷有：穩定性差、活力酶在使用中的缺陷有：穩定性差、活力 不夠高、抗原性等，如對酸、堿、重金屬、不夠高、抗原性等，如對酸、堿、重金屬、 有機介質、高溫等物理化學環境敏感，且有機介質、高溫等物理化學環境敏感，且 活性、

53、專一性、作用條件不能滿足生產工活性、專一性、作用條件不能滿足生產工 藝要求。藝要求。 酶分子修飾成為酶工程中具有重要意義酶分子修飾成為酶工程中具有重要意義 和應用前景的領域。和應用前景的領域。 隨著蛋白質工程的興起與發展，酶分子隨著蛋白質工程的興起與發展，酶分子 修飾與基因工程技術結合在一起，使酶分修飾與基因工程技術結合在一起，使酶分 子修飾展現出更廣闊的前景。子修飾展現出更廣闊的前景。 97 1、什么是酶分子修飾 2、酶分子修飾的基本要求和條件 3、酶分子的修飾方法 Go Go Go 4、酶分子修飾的應用 Go 酶分子修飾酶分子修飾 98 一、什么是酶分子修飾？一、什么是酶分子修飾？ 通過各

54、種方法使酶分子的結構發生某些改通過各種方法使酶分子的結構發生某些改 變，從而改變酶的催化特性的技術過程稱變，從而改變酶的催化特性的技術過程稱 為酶分子修飾。為酶分子修飾。即：在體外將酶分子通過即：在體外將酶分子通過 人工的方法與一些化學基團（物質），特人工的方法與一些化學基團（物質），特 別是具有生物相容性的物質，進行共價連別是具有生物相容性的物質，進行共價連 接，從而改變酶的結構和性質。接，從而改變酶的結構和性質。 99 酶分子修飾的意義酶分子修飾的意義 提高酶的提高酶的活力活力 activityactivity 增強酶的增強酶的穩定性穩定性 stabilitystability 降低或消除

55、酶的降低或消除酶的抗原性抗原性 immunological immunological propertyproperty 研究和了解酶分子中主鏈、側鏈、組成單位、研究和了解酶分子中主鏈、側鏈、組成單位、 金屬離子和各種物理因素對酶分子空間構象金屬離子和各種物理因素對酶分子空間構象 的影響的影響 structurestructure 100 二、酶分子修飾的基本要求和條件二、酶分子修飾的基本要求和條件 對酶分子進行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應條件對酶分子進行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應條件 的選擇以及酶學性質等方面都要有足夠的了解。的選擇以及酶學性質等方面都要有足夠的了解。 （1 1）酶

56、的穩定性）酶的穩定性 熱穩定性、酸堿穩定性、作用溫度、熱穩定性、酸堿穩定性、作用溫度、pHpH、抑制劑等。、抑制劑等。 （2 2）酶活性中心的狀況）酶活性中心的狀況 活性中心基團、輔因子等。其他如分子大小、性狀、活性中心基團、輔因子等。其他如分子大小、性狀、 亞基數等。亞基數等。 101 酶分子修飾的條件酶分子修飾的條件 修飾反應盡可能在修飾反應盡可能在酶穩定條件酶穩定條件下進行，并盡量下進行，并盡量不破不破 壞酶活性功能的必需基團壞酶活性功能的必需基團，使，使修飾率高修飾率高，同時酶的，同時酶的 活力回收高活力回收高。 （1 1）pHpH與離子強度與離子強度 pHpH決定了酶蛋白分子中反應基

57、團的解離狀態。由決定了酶蛋白分子中反應基團的解離狀態。由 于它們的解離狀態不同，反應性能也不同。于它們的解離狀態不同，反應性能也不同。 （2 2）修飾反應的溫度與時間）修飾反應的溫度與時間 嚴格控制溫度和時間可以減少以至消除一些非專嚴格控制溫度和時間可以減少以至消除一些非專 一性的修飾反應。一性的修飾反應。 （3 3）反應體系中酶與修飾劑的比例）反應體系中酶與修飾劑的比例 102 三、酶分子的修飾方法三、酶分子的修飾方法 金屬離子置換修飾金屬離子置換修飾 大分子結合修飾大分子結合修飾( (共價共價/ /非共價非共價) ) 側鏈基團修飾側鏈基團修飾 肽鏈有限水解修飾肽鏈有限水解修飾 氨基酸置換修

58、飾氨基酸置換修飾 核苷酸置換修飾核苷酸置換修飾 酶分子的物理修飾酶分子的物理修飾 103 （一）酶的金屬離子置換修飾（一）酶的金屬離子置換修飾 把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子， 使酶的特性和功能發生改變的修飾方法稱為使酶的特性和功能發生改變的修飾方法稱為金金 屬離子置換修飾。屬離子置換修飾。 -淀粉酶中的鈣離子（淀粉酶中的鈣離子（CaCa2+ 2+），谷氨酸脫氫 ），谷氨酸脫氫 酶中的鋅離子酶中的鋅離子(Zn(Zn2+ 2+) )，過氧化氫酶分子中的鐵 ，過氧化氫酶分子中的鐵 離子離子(Fe(Fe2+ 2+) )，?；被崦阜肿又械匿\離子 ，酰

59、基氨基酸酶分子中的鋅離子 （ZnZn2+ 2+） ）, ,超氧化物歧化酶分子中的銅、鋅離超氧化物歧化酶分子中的銅、鋅離 子子(Cu(Cu2+ 2+,Zn ,Zn2+ 2+) ) 104 若從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶往往會喪失 其催化活性。 如果重新加入原有的金屬離子，酶的催化活性可以恢 復或者部分恢復。 若用另一種金屬離子進行置換，則可使酶呈現出不同 的特性。 有的可以使酶的活性降低甚至喪失，有的卻可以使酶 的活力提高或者增加酶的穩定性。 （一）酶的金屬離子置換修飾（一）酶的金屬離子置換修飾 105 1. 1. 金屬離子置換修飾的方法金屬離子置換修飾的方法 1、酶的分離純化 2、除去原

60、有的金屬離子：加入金屬螯合 劑 3、加入置換離子 106 1. 1. 金屬離子置換修飾的方法金屬離子置換修飾的方法 p 金屬離子置換修飾只適用于那些在分子金屬離子置換修飾只適用于那些在分子 結構中結構中本來含有金屬離子的酶本來含有金屬離子的酶。 p 用于金屬離子置換修飾的金屬離子，用于金屬離子置換修飾的金屬離子， 一般都是一般都是二價金屬離子二價金屬離子。 107 2. 2. 金屬離子置換修飾的作用金屬離子置換修飾的作用 闡明金屬離子對酶催化作用的影響闡明金屬離子對酶催化作用的影響 提高酶活力提高酶活力 增強酶的穩定性增強酶的穩定性 改變酶的動力學特性改變酶的動力學特性 108 (二二) 大分