1、丁酸梭狀芽孢桿菌檢測方法A1 范圍生產分析和質量控制部門適用A2 原理丁酸梭狀芽孢桿菌為生芽孢嚴格厭氧菌，其芽孢能抗高熱（在 100下 30min 仍能存 活），其芽孢為橢圓或長桶形， 0.6 0.9 1.0 1.5 m。與芽孢囊中央或近中央部形成， 一般于腰間發芽。 營養細胞紡錘形 （梭狀）0.3 0.7 23m，孤立或成短鏈， 桿端半圓形。 革蘭氏陽性。A3 試驗方法A3.1 儀器設備和材料A3.1.1 冰箱 0-4 A3.1.2 配有鏡臺測微尺和目鏡測微尺的生物顯微鏡鏡（10 100）A3.1.3 恒溫培養箱A3.1.4 恒溫干燥箱A3.1.5 恒溫搖床A3.1.6 滅菌鍋A3.1.7

2、無菌室或超凈工作臺A3.1.8 厭氧罐（ 5L 或 10L）A3.1.9 架盤藥物天平： 0 500g，精精度至 0.5gA3.1.10 試管： 15mm 150mm 18mm180mmA3.1.11 滅菌培養皿：直徑 9cmA3.1.12 三角瓶： 500mlA3.1.13 無菌吸管： 1ml（ 具有 0.01ml 刻度 ） 5ml ， 10ml（具有 0.1ml 刻度）A3.1.14 玻璃刮刀或 L 型玻璃棒（涂布棒）A3.1.15 滅菌牛皮紙袋或廣口瓶，金屬勺和剪刀A3.1.16 酒精燈A3.1.17 載玻片A3.1.18 鑷子A3.1.19 接種環、接種針A3.1.20 均質器或微型振

3、蕩箱A3.2 培養基和試劑A3.2.1 除特別注明外，試驗中所以試劑為分析純試劑，水為蒸餾水或相應程度的水， 溶液為水溶液。A3.2.2 營養肉汁（瓊脂）培 養基 （配置方法見附錄B1）A3.2.3 7%NaCl 耐鹽試驗培養基（配置方法見附錄 B2）A3.2.4 厭氧培養基（配置方法見附錄 B3）A3.2.5 丙二酸鹽培養基（配置方法見附錄B4）A3.2.6 革蘭氏染色液（配置方法見附錄 B5）A3.2.7 0.85% 滅菌生理鹽水（配置方法見附錄 B6）A3.2.8 V-P 試劑（配置方法見附錄 B7）A3.2.9 3%-10%H 2O2 溶液A4 丁酸梭狀芽孢桿菌菌落數檢測A4.1 檢驗

4、程序用無菌生理鹽水做成幾個適當倍數稀釋液選擇 2-3 個適當稀釋度各 0.1ml ，涂布于富集培養基平皿置于厭氧罐中 ,36 1 培 養 24-72 小 時菌種鑒別檢驗菌落計數報告A4.2 操作步驟 A4.2.1 采樣A4.2.1.1 采樣時必須特別注意樣品的代表性和避免采樣時的污染。 首先準備好滅菌容器和采 樣工具，如滅菌牛皮紙袋或廣口瓶， 金屬勺和刀， 采取有代表性的樣品，樣品采集后應盡快 檢驗，否則應將樣品放在低溫干燥處。取樣按本標準規定的取樣方法。A4.2.2 梯度稀釋A4.2.2.1 以無菌操作經過充分搖勻的待檢樣 25 克移入含有 225 毫升滅菌生理鹽水（按本標 準附錄 B6 規

5、定執行）和帶玻璃珠的滅菌三角瓶內，并于振蕩器中8000-10000 轉/分鐘處理2-3 分鐘，做成 1:10 的均勻稀釋液，混合均勻。A4.2.2.2 取 1:10 稀釋液 1.0ml 加到含有 9.0ml 無菌生理鹽水和帶玻璃珠的滅菌三角瓶中， 并 于微型振蕩器中 8000-10000 轉/分鐘處理 2-3 分鐘，充分搖勻制成 1:100 的稀釋液。A4.2.2.3 取 1:100 稀釋液 1.0ml 加到含有 9.0ml 無菌生理鹽水試管中，并于微型震蕩器上 8000-10000 轉 /分鐘處理 2-3 分鐘后進行 10 倍梯度稀釋。每個稀釋度換用一支 1.0ml 滅菌移 液管，按上述操作

6、程序進行 10 倍稀釋直至 108A4.2.3 涂布接種估計樣品的含菌量，選擇三個合適連續稀釋梯度，分別再作 10 倍稀釋的同時，各取 0.1ml 分別加入到計數培養基（營養肉汁瓊脂培養基，按照附錄 B1 規定執行）平皿，均勻涂布， 各個稀釋梯度做三個平皿，同時做滅菌生理鹽水空白對照。以上操作需在 20min 內完成。 將平板倒置于厭氧罐中，并于 351的恒溫培養箱中培養。A4.2.4 菌落觀察計數與鏡檢A4.2.4.1 培養 8 小時后開始記錄出現菌落的時間， 24 小時后記錄觀察到的菌落特征 , 選取 菌落數在 30-300 之間的平板進行菌落計數。每一稀釋梯度采用三個平板的菌落平均數，以

7、 無片狀菌落生長的平板作為該稀釋梯度的菌落數， 有較大片狀菌落生長時， 則不宜采用， 如 片狀菌落不到平板的一半， 而另一半菌落又分布很均勻， 即可計算半個平板后乘以 2 代表全 平板菌落數。A4.2.4.2 稀釋梯度的選擇A）應選擇平均菌落數在 30-300 之間的稀釋梯度，乘以稀釋倍數報告之。B）如有兩個稀釋梯度，其生長的菌落數均在30-300 之間，視兩者之比如何來決定，如其比值小于 2，報告其平均數；如大于 2，則報告其中較小的數字。C）如所有稀釋度的平均菌落數大于300，則應按稀釋梯度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。D）如所有稀釋度的平均菌落數均小于30，則應按稀釋度最低的平均菌

8、落數乘以稀釋倍數報告之。E）如所有稀釋梯度均無菌落生長，則以小于（）1 乘以最低稀釋倍數報告之。F）如所有稀釋度的平均菌落數均不在30-300 之間，其中一部分大于 300 或小于 30 時，則以最接近 30或 300 的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。G）菌落數在 100 以內時，按其實有數報告； 大于 100 時，采用兩位有效數字， 在兩位有效數 字后面的數值，以四舍五入方法計算。為了縮短數字后面的零數，也可以用 10 的指數來表 示。A4.2.4.3 鏡檢計算后，隨機從每個平板長有相同菌落特征的可疑有效菌落中至少選取5 個菌苔，進行革蘭氏染色（按附錄 B5 執規定行）并顯微鏡觀察，記錄菌體

9、營養細胞的大小（長寬），有無芽孢，芽孢生長的位置，孢囊膨大情況。根據菌落特征和鏡檢結果， 對照表 3 初步確定可 疑有效菌落是否屬于所對應的有效菌的種類。A4.2.5 有效菌落計數根據證實為有效菌菌落， 計算出所選取的菌落在 30-300 之間的平板中有效軍的菌落數， 并將其余菌落視為雜菌。例：將檢樣 10-6稀釋液 0.1ml 涂布于計數平板上，生成的可疑菌落數為 50個，取 5個 進行鑒定，證實有效菌為 4 個，則 1g 樣品中枯草芽孢桿菌數為（ 50 4/5） 10610=4.0 108。附錄 B(規范性附錄)專用培養基和試劑B1 營養肉汁培養基蛋白胨 10 克牛肉膏 3 克氯化鈉 5

10、克 蒸餾水 1000mlPH 7.0 將上述成分溶解后，按需要分裝三角瓶或試管，若制成營養肉汁瓊脂培養基，則加入 2%的瓊脂融化后，分裝，于 121高壓滅菌 15min-20min ，冷卻至 45，備用。B2 耐鹽培養基蛋白胨 10g牛肉膏 3g氯化鈉 70g蒸餾水 1000ml將上述成分溶解后， 調節 pH7.0，分裝試管 ，高壓滅菌 12115 20min，冷至 45，備用。B3 厭氧培養基酪蘇水解物( trypticase ) 20gNaCl5g巰基乙酸鈉2g甲醛次硫酸鈉1g瓊脂15g蒸餾水1000ml培養基配置好后分裝試管，每管45ml， 121 蒸汽滅菌 1520min，冷至 45，

11、備用。B4 丙二酸鹽培養基酵母膏 1.0 克(NH4) 2SO42.0克K2HPO40.6克KH2PO40.4 克NaCl2.0克丙二酸鈉3.0克溴百里酚藍0.025克蒸餾水1000mlPH7.0-7.4分裝試管，每管4-5ml,121 蒸汽滅菌 15min-20min, 冷至 45，備用。B5 革蘭氏染色法B5.1 結晶紫染色液結晶紫 1g95%乙醇20ml1%草酸銨水溶液80ml將結晶紫溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。B5.2 革蘭氏碘液 碘 1.0g 碘化鉀 2.0g 蒸餾水 300ml 將碘與碘化鉀先行混合，加入蒸餾水少許，充分振蕩，待完全溶解后，再加蒸餾水至300ml 。B5.3

12、 沙黃復染液 沙黃0.25g95%乙醇 10.0ml 蒸餾水90.0ml將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。B5.4 染色 將涂片在火焰上固定，滴加結晶紫染色液，染 1min ，水洗。 滴加革蘭氏碘液，作用 1min, 水洗。滴加 95%乙醇脫色約 15 30s，或將乙醇滴滿整個涂片，立即倒去，再用乙醇滴滿整 個涂片，脫色 10min 。水洗，滴加復染液，復染 1min, 水洗、待干、鏡檢。B5.5 結果 深紫色為革蘭氏陽性菌， 紅色為革蘭氏陰性菌。 染色結果可疑時， 以金黃色葡萄球菌為 陽性菌對照，大腸桿菌為陰性菌對照。B6 0.85% 滅菌生理鹽水 氯化鈉（ NaCl ） 8.5g 加蒸

13、餾水至 1000ml ， 121 15min 滅菌，備用。B7 V-P 試劑 5%-萘酚 5.0g 溶解于 100ml 無水乙醇中； 40%氫氧化鉀溶液：將氫氧化鉀 40g 于蒸餾水中溶解并稀釋至 100ml; 肌氨酸結晶釀酒酵母菌檢測方法A1 范圍生產分析和質量控制部門適用。A2 原理細胞呈橢圓形， 5.4（ 3.86 7.58 ）m，兩端出芽，在麥芽汁液體培養基中培養7天后，不形成醭，菌液混濁，產氣明顯，有沉淀；在麥芽汁瓊脂培養基上的菌落為乳白色， 圓形，有光澤， 邊緣整齊， 粘稠，易挑起； 在產生孢子 Kleny 培養基上 28培養 14周后， 有子囊孢子形成；兩者均能形成 1、2、4

14、個子囊孢子，孢子壁光滑；在有蓋玻片的玉米粉瓊 脂培養基上 25培養 10 天左右，鏡檢不能形成假菌絲。糖類發酵陽性， 硝酸鹽還原呈陰性， 脲酶試驗呈陰性，重氮基藍 B試驗呈陰性， L- 賴氨 酸生長試驗呈陰性。A3 試驗方法A3.1 儀器設備和材料A3.1.1 生物顯微鏡（ 10 100）A3.1.2 菌落計數器A3.1.3 恒溫培養箱（ 281）A3.1.4 恒溫干燥箱A3.1.5 恒溫搖床A3.1.6 滅菌鍋A3.1.7 無菌室或超凈工作臺A3.1.8 酸度計A3.1.9 架盤藥物天平： 0-500g ，精度至 0.5gA3.1.10 試管： 15mm 150mm 18mm180mmA3.

15、1.11 滅菌培養皿：直徑 9cmA3.1.12 三角瓶： 500mlA3.1.13 無菌吸管： 1ml（ 具有 0.01ml 刻度 ） 5ml ， 10ml（具有 0.1ml 刻度）A3.1.14 玻璃刮刀或 L 型玻璃棒（涂布棒）A3.1.15 滅菌牛皮紙袋或廣口瓶，金屬勺和剪刀A3.1.16 酒精燈A3.1.17 載玻片A3.1.18 鑷子A3.1.19 接種環、接種針A3.2 培養基和試劑A3.2.1 麥芽汁液體培養基（配置方法見附錄 B1）A3.2.2 麥芽汁瓊脂培養基（配置方法見附錄 B2）A3.2.3 豆芽汁葡萄糖培養基（配置方法見附錄B3）A3.2.4 玉米粉瓊脂培養基（配置方

16、法見附錄 B4）A3.2.5 生孢子 Kleyn 培養基（配置方法見附錄 B5）A3.2.6 糖類發酵培 養基 （配置方法見附錄 B6）A3.2.7 硝酸鹽培養基（配置方法見附錄 B7）A3.2.8 常用脲酶試驗用培養基（配置方法見附錄B8）A3.2.9 重氮氨基藍 B 試劑（配置方法見附錄 B9）A3.2.10 賴氨酸脫羧酶試驗培養基（配置方法見附錄B10）A3.2.11 子囊孢子染色法（配置方法見附錄B11）A3.2.12 格里斯氏試劑（配置方法見附錄 B12）A3.2.13 二苯胺試劑（配置方法見附錄 B13）A3.2.14 0.85% 無菌生理鹽水（配置方法見附錄 B12）A4釀酒酵母

17、菌落檢測A4.1 檢測程序待檢樣 用無菌生理鹽水做成幾個適當倍數稀釋液選擇 2 3 個適當稀釋度，各 0.1ml 加入滅菌平皿培養基內涂布35 1培養 72 小時菌落計數菌種生物、生化檢驗鑒定報告A4.2 操作步驟A4.2.1 采樣A4.2.1.1 必須特別注意樣品的代表性和避免采樣時的污染。首先準備好滅菌容器和采樣工 具，如移液管等，采取有代表性的樣品。取樣按本標準規定的取樣方法。A4.2.1.2 以無菌操作經過充分搖勻的待檢樣 25 克移入含有 225 毫升滅菌生理鹽水（按本標 準附錄 B6 規定執行）和帶玻璃珠的滅菌三角瓶內，并于振蕩器中 8000-10000 轉/分鐘處理 2-3 分鐘

18、，做成 1:10 的均勻稀釋液，混合均勻。A4.2.1.3 取 1:10 稀釋液 1.0ml 加到含有 9.0ml 無菌生理鹽水和帶玻璃珠的滅菌三角瓶中， 并 于微型振蕩器中 8000-10000 轉/分鐘處理 2-3 分鐘，充分搖勻制成 1:100 的稀釋液。A4.2.1.4 取 1:100 稀釋液 1.0ml 加到含有 9.0ml 無菌生理鹽水試管中，并于微型震蕩器上 8000-10000 轉 /分鐘處理 2-3 分鐘后進行 10 倍梯度稀釋。每個稀釋度換用一支1.0ml 滅菌移液管，按上述操作程序進行 10 倍稀釋直至 108A4.2.2 平板計數法A4.2.2.1 估計樣品的含菌量，選

19、擇三個合適連續稀釋度，分別在做 10 倍稀釋的同時，各取 0.1ml 分別加到計數培養基平皿，均勻涂布，各個稀釋度作兩個平皿，最好同時作2 3 種培養基（麥芽汁瓊脂培養基、豆芽汁葡萄糖瓊脂培養基，分別按本標準附錄B.2、B.3 規定執行），同時作滅菌生理鹽水空白對照。以上操作全過程需在 20min 內完成。A4.2.2.2 將平板倒置于 28的恒溫箱中培養， 培養 23 天后觀察菌落形態。 釀酒酵母在豆 芽汁瓊脂培養基上生長緩慢，在麥芽汁瓊脂培養基上生長良好，適宜溫度25 30，菌落為乳白色，圓形，有光澤、邊緣整齊、粘稠、易挑起。顯微鏡下觀察，菌體細胞呈橢圓形， 5.4 （ 3.867.85）

20、m，兩端出芽。A4.2.2.3 在麥芽汁液體培養基中（按本標準附錄 B.1 規定執行）培養 7 天后，不形成醭， 菌液混濁，產氣明顯，有沉淀；在生孢子 Kleyn 培養基（按本標準附錄 B.5 規定執行）上 28培養 14 周后，有子囊孢子形成；兩者均能形成1、2、4 個子囊孢子，孢子壁光滑；在有蓋玻片的玉米粉瓊脂培養基（按本標準附錄 B.4 執行）上 25培養 10 天左右，鏡檢不 能形成假菌絲。因此初步判斷為釀酒酵母。A4.2.2.4 菌落計數： 選取具有 30300 個典型或可疑釀酒酵母菌苔在平板上進行菌落計數， 并計算同一稀釋度下的兩個平板的平均菌落數。按比例計算出該平皿內的釀酒酵母菌

21、落數， 然后乘其稀釋倍數再乘以 10，即為每克樣品所含釀酒酵母數并作出報告。例：將檢樣 10-6稀釋液 0.1ml 涂布于計數平板上，生成的可疑菌落為50個，取 5個鑒定，證實為釀酒酵母的是四個，則 1ml 檢樣中釀酒酵母數為 10504/5 106=3.8 108。 A4.2.2.5 計數后，分別接種于麥芽汁 -酵母-葡萄糖 -蛋白胨瓊脂培養基斜面，于 28培養 72 小時，進行釀酒酵母的鑒定證實試驗。A5釀酒酵母菌的生理生化鑒定試驗A5.1 發酵糖類試驗取 A4.2.2.5 小節中選定菌落的菌苔，經活化后分別接入到發酵糖類培養基中（按附錄B.6 規定），糖類發酵培養基是將葡萄糖、麥芽糖、半

22、乳糖、乳糖和蔗糖分別加入到含有杜 氏發酵管的豆芽汁培養基中，使之含量達到 50mmol/lL ，經過濾除菌。 25培養 2-4 周后觀 察，可使培養基由紫色變為黃色。或者糖發酵管中倒置的杜氏小管中有氣泡則證明呈陽性； 培養基顏色不變，且杜氏發酵管中沒有氣泡則證明呈陰性，試驗重復 3 次。A5.2 硝酸鹽還原試驗取 A4.2.2.5 小節中選定菌落的菌苔，接種硝酸鹽培養基（按附錄B.7 ）。并將未接種的空白作對照，于 36培養三天，在干凈的比色瓷盤小窩中倒入少許已接種培養的培養液， 再滴一滴格里斯氏試劑的 A 液及 B 液（按附錄 B.12 規定執行）。在對照中同樣加入格里斯 氏試劑的 A 液及

23、 B 液各一滴。觀察并記錄溶液是否變紅色，若變紅色則為陽性；若無紅色 出現，再加入一滴二苯胺試劑（按附錄 B.13 規定），溶液變藍色則為陰性，不變藍色，則仍 為陽性。釀酒酵母硝酸鹽還原呈陽性。A5.3 脲酶試驗取 A4.2.2.5 小節中選定菌落的菌苔， 接種在經深度冷藏的脲酶試驗用培養基上 （按附錄 B.8 規定），在 37培養， 2 小時開始觀察，每半小時檢查一次試管顏色的變化，一直檢查 到 4 小時，如果試管顏色變紅色表示脲酶活性為陽性，若 4 小時后試管顏色不變則為陰性。 釀酒酵母脲酶試驗呈陰性。A5.4 重氮基藍 B（ DBB）試驗取 A4.2.2.5 小節中選定菌落培養 10 天

24、后的菌苔， 放置 55 數小時后浸淹在冰冷的 DBB 試劑（按附錄 B.9 規定）中，如果給培養物在溫室下 2 分鐘內變暗紅，那么結果為陽性，不 變為暗紅為陰性。釀酒酵母重氮基藍 B 試驗呈陰性。A5.5 L- 賴氨酸生長試驗取 A4.2.2.5 小節中選定菌落的菌苔，接種到L- 賴氨酸脫羧酶試驗培養基（按附錄B.10規定）上，于 25培養一周。試驗重復 3 次，以不加 L- 賴氨酸的培養基為對照。指示劑呈 紫色或帶紅色調的紫色者為陽性，呈黃色者為陰性。釀酒酵母L- 賴氨酸生長試驗呈陰性。附錄 B（ 資料性附錄 ） 專用培養基及試劑 B1 麥芽汁培養基大麥芽500g蒸餾水1000ml將大麥芽若

25、干粉碎后， 加入 4 倍麥芽重量的水， 攪拌均勻， 在 55 60恒溫箱中糖化 4 小時，取出過濾，得麥芽汁，測量麥芽汁的體積和濃度（波美度）后，分裝于已滅菌的三角 瓶中， 121滅菌 40min 后備用。B2 麥芽汁瓊脂培養基麥芽汁1000ml瓊脂15g將 B1 所得到的麥芽汁稀釋到 12 波林，后將瓊脂加入到稀釋后的麥芽汁上，加熱溶解， 然后將此培養基分裝試管中，高壓滅菌：110， 3min 。B3 豆芽汁葡萄糖培養基豆芽汁100ml葡萄糖5g瓊脂1.5 2.0g豆芽汁的制作： 將大豆芽 500g（剛出芽即可） ，加水 2500ml，煮沸濃縮至約 1000ml 時， 過濾待用。將葡萄糖和瓊

26、脂加入豆芽之中，加熱溶解后，分裝試管，高壓滅菌，121 1520min 。B4 玉米粉瓊脂培養基玉米粉50.0g瓊脂15.0g蒸餾水1000mlB4.1 玉米粉與 500ml 蒸餾水混合，文火煮 1 小時，或 121,10min 高壓滅菌； B4.2 雙紗布過濾，濾液補足至 1000ml ，加入瓊脂；B4.3 煮沸使瓊脂溶解，高壓 121 15min，分裝備用。B5 生孢子 Klenyn 培養基KH 2PO40.012%K2HPO40.02%醋酸鈉0.5%葡萄糖0.062%NaCl0.062%蛋白胨0.25%生物素2g%瓊脂2%混合鹽類1ml/100ml混合鹽類溶液：MgSO 47H2O0.4

27、%NaCl0.4%FeSO44H2O0.2%各成分充分混合成均勻懸液，調pH 為 6.5，攪拌加熱，煮沸 1min ，分裝試管或其它適MnSO 44H 2O0.2%宜容器， 121， 15min 高壓滅菌，倒成斜面。CuSO45H 2O0.002%B6 糖類發酵培養基B6.1 基礎液：蛋白胨 10g 溴甲酚紫 10ml 氯化鈉5g水1000mlB6.2 糖B6.3 取胨和氯化鈉加入水中，微溫溶解，調節 pH 使滅菌后為 7.4，加入指示液，混勻。分 裝每瓶 100ml, 滅菌。B6.4 配置葡萄糖發酵培養基時， 100ml 基礎液加入 0.5g 葡萄糖， 分裝于含杜氏管 （Durham ）10

28、%溶液，與基礎液同的小試管中，滅菌。配置其它糖發酵培養基時，將各種糖分別配成時滅菌。以無菌操作將 5ml 糖溶液加入 100ml 基礎液內，分裝于滅菌小試管中。高壓121滅菌 1520min 。B7 硝酸鹽培養基牛肉蛋白胨培養基1000mlKNO 31g培養基配置好后調節pH7.07.6,分裝試管，B8 常用脲酶試驗用培養基每管 4 5ml ，121蒸汽滅菌 1520min 。葡萄糖1.0g蛋白胨1.0g氯化鈉5.0gKH2PO42.0g酚紅0.012g （6ml1:50 的酚紅水溶液 ）洋菜20g蒸餾水1000ml滅菌后的 20% 尿素水溶液若干B8.1 各成分充分溶解后調 pH 至 6.8

29、 6.9，使培養基呈黃色或微帶粉紅色為宜，分裝試管， 分裝量以適于擺斜面為度。高壓121滅菌 30min 。B8.2 20%的尿素水溶液過濾滅菌后，待基礎培養基冷卻到50 55時，將滅菌的尿素溶液加到基礎培養基中，終極濃度為2%，然后擺成較大的斜面。B9 重氮氨基藍 B（ DDB）試劑冷的 0.1M 三羥甲基氨基甲烷 =鹽酸緩沖液， pH7.0，每毫升含 1mg。B10 賴氨酸脫羧酶試驗培養基蛋白胨 5g1ml3g0.5（1g） /100ml1g1000ml16%溴甲酚紫乙醇溶液酵母浸出粉L-賴氨酸 （DL- 賴氨酸 ） 葡萄糖 水除賴氨酸外取上述成分混合加熱溶解后分裝每瓶100ml ，加入

30、L-賴氨酸 0.5g、DL- 賴氨酸 1g，調節 pH 值使滅菌后為 6.8 ，同時以不加賴氨酸培養基作為對照，分裝于滅菌的小試 管內每管 1ml,并滴加一層液體石蠟， 121滅菌 10min 。B11 子囊孢子染色法B11.1 呂氏堿性美藍染液A 液： 美藍（ methylene blue ） 0.6g 95%酒精30mlB 液： KOH0.01g蒸餾水100ml分別配制 A 液和 B 液，配好后混合即可。B11.2 齊氏石碳酸復紅染色液A 液：堿性復紅（ basic fuchsin ）0.3g95%酒精10mlB 液：石碳酸5.0g蒸餾水95ml將堿性復紅在研缽中研磨后，逐漸加入95%酒精

31、，繼續研磨使其溶解，配成 A 液。將石碳酸溶解于水中，配成 B 液。混合 A 液及 B 液即成。通常可將此混合液稀釋5 10 倍使用，稀釋液易變質失效，一次不宜多配。B11.3 染色把石碳酸復紅染液加于固定圖片處，在火焰上加熱510min（ 不能沸騰 ）用酸性酒精沖洗 3060 秒鐘，再用水洗去酒精 加呂氏堿性美藍染液數滴，數秒后用水洗去，水干后置顯微鏡觀察。B11.4 結果結果孢子為赤色，菌體為青色。B12 格里斯氏試劑A 液：將對氨基苯磺酸 0.8g，溶解于 2.5mol/L 乙酸溶液 100ml ；B 液：將甲萘胺 0.5g 溶解于 2.5mol/L 乙酸溶液 100ml 中。B13 二

32、苯胺試劑將二苯胺 0.5g溶于 100ml 濃硫酸中，用 20ml 蒸餾水稀釋。B14 0.85% 滅菌生理鹽水氯化鈉（ NaCl）8.5g 加蒸餾水至 1000ml， 121 15min 滅菌，備用。枯草芽孢桿菌檢測方法A1 范圍 生產分析和質量控制部門適用A2 原理枯草芽孢桿菌為生芽孢需氧菌，其芽孢能抗高熱（在100下 30min 仍能存活），并能在枯草浸出液中生長，其芽孢為橢圓或長桶形，0.6 0.9 1.0 1.5 m。與芽孢囊中央或近中央部形成，一般于腰間發芽。營養細胞桿狀0.3 0.7 23m，孤立或成短鏈，桿端半圓形。革蘭氏陽性。能液化明膠，水解，糖化淀粉菌落為蔓延性，細皺或折迭

33、，灰白，淡 黃甚至黃色。在銨鹽中發酵各種糖成酸，但不產氣。 V-P 反應陽性，利用檸檬酸，還原硝酸 鹽陽性。將樣品經熱處理后進行稀釋， 涂布于以枯草浸出液為唯一營養源的瓊脂培養基中， 鏡檢 營養細胞性狀、 大小排列； 芽孢形狀、 大小、 部位，芽孢囊形狀； 檢測蛋白酶、 淀粉酶特性， V-P 反應，硝酸鹽還原，檸檬酸鹽利用等情況來確定是否為枯草芽孢桿菌。A3 試驗方法A3.1 儀器設備和材料A3.1.1 冰箱 0-4 A3.1.2 配有鏡臺測微尺和目鏡測微尺的生物顯微鏡鏡（10 100）A3.1.3 恒溫培養箱A3.1.4 恒溫干燥箱A3.1.5 恒溫搖床A3.1.6 滅菌鍋A3.1.7 無菌

34、室或超凈工作臺A3.1.8 厭氧罐（ 5L 或 10L）A3.1.9 架盤藥物天平： 0 500g，精精度至 0.5gA3.1.10 試管： 15mm 150mm 18mm180mmA3.1.11 滅菌培養皿：直徑 9cmA3.1.12 三角瓶： 500mlA3.1.13 無菌吸管： 1ml（ 具有 0.01ml 刻度 ） 5ml ， 10ml（具有 0.1ml 刻度）A3.1.14 玻璃刮刀或 L 型玻璃棒（涂布棒）A3.1.15 滅菌牛皮紙袋或廣口瓶，金屬勺和剪刀A3.1.16 酒精燈A3.1.17 載玻片A3.1.18 鑷子A3.1.19 接種環、接種針A3.1.20 均質器或微型振蕩箱

35、A3.2 培養基和試劑A3.2.1 除特別注明外， 試驗中所以試劑為分析純試劑， 水為蒸餾水或相應程度的水， 溶液為水溶液。A3.2.2 營養肉汁（瓊脂）培 養基 （配置方法見附錄B1）A3.2.3 7%NaCl 耐鹽試驗培養基（配置方法見附錄 B2）A3.2.4 厭氧培養基（配置方法見附錄 B3）A3.2.5 丙二酸鹽培養基（配置方法見附錄B4）A3.2.6 革蘭氏染色液（配置方法見附錄 B5）A3.2.7 0.85% 滅菌生理鹽水（配置方法見附錄 B6）A3.2.8 V-P 試劑（配置方法見附錄 B7）A3.2.9 3%-10%H 2O2 溶液A4 枯草芽孢桿菌菌落數檢測A4.1 檢驗程序

36、檢樣用無菌生理鹽水做成幾個適當倍數稀釋液選擇 2-3 個適當稀釋度各 0.1ml ，涂布于富集培養基平皿36 1 培 養 24-72 小 時菌種鑒別檢驗菌落計數報告A4.2 操作步驟A4.2.1 采樣A4.2.1.1 采樣時必須特別注意樣品的代表性和避免采樣時的污染。 首先準備好滅菌容器和采 樣工具，如滅菌牛皮紙袋或廣口瓶， 金屬勺和刀， 采取有代表性的樣品，樣品采集后應盡快 檢驗，否則應將樣品放在低溫干燥處。取樣按本標準規定的取樣方法。A4.2.2 梯度稀釋A4.2.2.1 以無菌操作經過充分搖勻的待檢樣 25 克移入含有 225 毫升滅菌生理鹽水（按本標 準附錄 B6 規定執行）和帶玻璃珠

37、的滅菌三角瓶內，并于振蕩器中8000-10000 轉/分鐘處理2-3 分鐘，做成 1:10 的均勻稀釋液，混合均勻。A4.2.2.2 取 1:10 稀釋液 1.0ml 加到含有 9.0ml 無菌生理鹽水和帶玻璃珠的滅菌三角瓶中， 并 于微型振蕩器中 8000-10000轉/分鐘處理 2-3分鐘，充分搖勻制成 1:100 的稀釋液。A4.2.2.3 取 1:100 稀釋液 1.0ml 加到含有 9.0ml 無菌生理鹽水試管中，并于微型震蕩器上 8000-10000 轉 /分鐘處理 2-3 分鐘后進行 10 倍梯度稀釋。每個稀釋度換用一支 1.0ml 滅菌移 液管，按上述操作程序進行 10 倍稀釋

38、直至 108A4.2.3 涂布接種估計樣品的含菌量，選擇三個合適連續稀釋梯度，分別再作 10 倍稀釋的同時，各取 0.1ml 分別加入到計數培養基（營養肉汁瓊脂培養基，按照附錄 B1 規定執行）平皿，均勻涂布， 各個稀釋梯度做三個平皿，同時做滅菌生理鹽水空白對照。以上操作需在 20min 內完成。 將平板倒置于 351的恒溫培養箱中培養。A4.2.4 菌落觀察計數與鏡檢A4.2.4.1 培養 8 小時后開始記錄出現菌落的時間， 24 小時后記錄觀察到的菌落特征 , 選取 菌落數在 30-300 之間的平板進行菌落計數。每一稀釋梯度采用三個平板的菌落平均數，以 無片狀菌落生長的平板作為該稀釋梯度

39、的菌落數， 有較大片狀菌落生長時， 則不宜采用， 如 片狀菌落不到平板的一半， 而另一半菌落又分布很均勻， 即可計算半個平板后乘以 2 代表全 平板菌落數。A4.2.4.2 稀釋梯度的選擇H）應選擇平均菌落數在 30-300 之間的稀釋梯度，乘以稀釋倍數報告之。I）如有兩個稀釋梯度，其生長的菌落數均在 30-300 之間，視兩者之比如何來決定，如其比 值小于 2，報告其平均數；如大于 2，則報告其中較小的數字。J）如所有稀釋度的平均菌落數大于300，則應按稀釋梯度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。K）如所有稀釋度的平均菌落數均小于30，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。L）如所

40、有稀釋梯度均無菌落生長，則以小于（）1 乘以最低稀釋倍數報告之。M）如所有稀釋度的平均菌落數均不在30-300 之間，其中一部分大于 300 或小于 30 時，則以最接近 30 或 300 的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。N）菌落數在 100 以內時，按其實有數報告； 大于 100 時，采用兩位有效數字， 在兩位有效數 字后面的數值，以四舍五入方法計算。為了縮短數字后面的零數，也可以用 10 的指數來表 示。A4.2.4.3 鏡檢計算后， 隨機從每個平板長有相同菌落特征的可疑有效菌落中至少選取 5 個菌苔， 進行 革蘭氏染色（按附錄 B5 執規定行）并顯微鏡觀察，記錄菌體營養細胞的大小（長寬）

41、，有無芽孢，芽孢生長的位置，孢囊膨大情況。根據菌落特征和鏡檢結果， 對照表 3 初步確定可 疑有效菌落是否屬于所對應的有效菌的種類。A4.2.5 有效菌落計數根據證實為有效菌菌落， 計算出所選取的菌落在 30-300 之間的平板中有效軍的菌落數， 并將其余菌落視為雜菌。例：將檢樣 10-6 稀釋液 0.1ml 涂布于計數平板上，生成的可疑菌落數為50 個，取 5 個進行鑒定，證實有效菌為 4 個，則 1g 樣品中枯草芽孢桿菌數為（ 50 4/5） 10610=4.0 108。A5 枯草芽孢桿菌的鑒定A5.1 耐鹽實驗挑取 A4.2.4 小節中選定菌落的菌苔，接種耐鹽培養基（按附錄 B2 規定執

42、行），并將未 接種的空白作對照，于 36培養 3 天和 7 天，與未接種的對照管對比，觀察培養液的混濁 情況和菌體的生長情況，記錄試驗結果。A5.2 耐熱性試驗挑取 A4.2.4 小節中選定菌落的菌苔，接種于有營養肉汁培養基（按附錄B1 規定執行）的試管中，于 55水浴中培養，觀察培養液的渾濁情況，記錄結果，并移種3 代均生長者為陽性，能在 55 下生長，反之為陰性。A5.3 芽孢菌厭氧性測定用一小環（外徑 1.5mm的接種環）挑取 A4.2.4 小節中選定菌落菌苔的營養肉湯培養物 穿刺接種厭氧培養基 （按附錄 B3 規定執行），必須穿刺到試管底， 并將未接種的空白作對照， 于 35 培養 3

43、 天和 7 天，觀察記錄菌的生長結果，僅在表面生長者為好氧菌，如沿穿刺線 生長或下部生長者為兼性厭氧菌或厭氧菌。A5.4 丙二酸鹽利用實驗挑取 A4.2.4 小節中選定菌落的菌苔幼齡菌種接種于丙二酸鹽培養基 （按附錄 A4 規定執 行），適溫培養 1-2 天，培養基由綠變藍者為陽性，即能利用丙二酸鹽，培養基不變色者為 陰性，即不能利用。A5.5 接觸酶（過氧化氫酶）試驗溶取一干凈的載玻片，在上面滴一滴 3%-10%H2O2 液，挑取一環 A4.2.4 小節中選定菌落的 菌苔，在 H2O2 溶液中涂抹，若產生氣泡（氧氣）為過氧化氫酶陽性反應，若不產氣泡為陰性 反應。A5.6 V-P 試驗挑取 A

44、4.2.4 小節中選定菌落的菌苔， 接種營養肉汁液體培養基 （按附錄 B1 規定執行）， 于 35培養 3 天，取培養液和 40% 氫氧化鈉溶液等量混合。加入少許肌酸，猛烈振蕩，于 2 10min 內觀察培養液的顏色變化情況，若變紅色，即為V-P 反應陽性。枯草芽孢桿菌為V-P 反應陽性。A6 結果解釋及報告 根據檢測到樣品中有效芽孢菌株的形態特征和培養及生理特征和計數結果，符合表 3 中相對應的菌株可報告為相應的芽孢桿菌。對偶爾遇到的一些少數可疑菌株，可以根據需要進行其他鑒定試驗。附錄 B(規范性附錄)專用培養基和試劑B1 營養肉汁培養基蛋白胨 10 克牛肉膏 3 克氯化鈉 5 克 蒸餾水

45、1000mlPH 7.0 將上述成分溶解后，按需要分裝三角瓶或試管，若制成營養肉汁瓊脂培養基，則加入 2%的瓊脂融化后，分裝，于 121高壓滅菌 15min-20min ，冷卻至 45，備用。B2 耐鹽培養基蛋白胨 10g牛肉膏 3g氯化鈉 70g蒸餾水 1000ml將上述成分溶解后， 調節 pH7.0，分裝試管 ，高壓滅菌 12115 20min，冷至 45，備用。B3 厭氧培養基酪蘇水解物( trypticase ) 20gNaCl5g巰基乙酸鈉2g甲醛次硫酸鈉1g瓊脂15g蒸餾水1000ml培養基配置好后分裝試管，每管45ml， 121 蒸汽滅菌 1520min，冷至 45，備用。B4

46、丙二酸鹽培養基酵母膏 1.0 克(NH4) 2SO42.0克K2HPO40.6克KH2PO40.4 克NaCl2.0克丙二酸鈉3.0克溴百里酚藍0.025克蒸餾水1000mlPH7.0-7.4分裝試管，每管4-5ml,121 蒸汽滅菌 15min-20min, 冷至 45，備用。B5 革蘭氏染色法B5.1 結晶紫染色液結晶紫 1g95%乙醇20ml1%草酸銨水溶液80ml將結晶紫溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。B5.2 革蘭氏碘液 碘 1.0g 碘化鉀 2.0g 蒸餾水 300ml 將碘與碘化鉀先行混合，加入蒸餾水少許，充分振蕩，待完全溶解后，再加蒸餾水至300ml 。B5.3 沙黃復染液

47、 沙黃0.25g95%乙醇 10.0ml 蒸餾水90.0ml將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。B5.4 染色 將涂片在火焰上固定，滴加結晶紫染色液，染 1min ，水洗。 滴加革蘭氏碘液，作用 1min, 水洗。滴加 95%乙醇脫色約 15 30s，或將乙醇滴滿整個涂片，立即倒去，再用乙醇滴滿整 個涂片，脫色 10min 。水洗，滴加復染液，復染 1min, 水洗、待干、鏡檢。B5.5 結果 深紫色為革蘭氏陽性菌， 紅色為革蘭氏陰性菌。 染色結果可疑時， 以金黃色葡萄球菌為 陽性菌對照，大腸桿菌為陰性菌對照。B6 0.85% 滅菌生理鹽水 氯化鈉（ NaCl ） 8.5g 加蒸餾水至 10

48、00ml ， 121 15min 滅菌，備用。B7 V-P 試劑 5%-萘酚 5.0g 溶解于 100ml 無水乙醇中； 40%氫氧化鉀溶液：將氫氧化鉀 40g 于蒸餾水中溶解并稀釋至 100ml; 肌氨酸結晶（規范性附錄）糞腸球菌檢測方法A1 范圍生產分析和質量控制部門適用。A2 原理細菌呈球狀、球桿狀， 0.5-0.8 m,常成對或短腸狀排列，無芽孢，革蘭氏染色陽性。 在血平板上菌落呈針尖大小、灰白色、圓形、表面光滑凸起、溶血。在葡萄糖肉湯中呈均勻 混濁生長。革蘭氏陽性，過氧化氫酶呈陰性，能在6.5%氯化鈉肉湯、 pH9.6 葡萄糖肉湯及 45生長，能分解葡萄糖產酸不產氣，發酵山梨醇，不發

49、酵阿拉伯糖，硝酸鹽還原陰性，精氨酸雙 水解陽性，最適生長溫度 36，最適 pH4.7-7.6 。A3 試驗方法A3.1 儀器設備和材料A3.1.1 生物顯微鏡（ 10 100）A3.1.2 菌落計數器A3.1.3 恒溫培養箱（ 36 1）A3.1.4 恒溫干燥箱A3.1.5 恒溫搖床A3.1.6 滅菌鍋A3.1.7 無菌室或超凈工作臺A3.1.8 酸度計A3.1.9 架盤藥物天平： 0-500g ，精度至 0.5gA3.1.10 試管： 15mm 150mm 18mm180mmA3.1.11 滅菌培養皿：直徑 9cmA3.1.12 三角瓶： 500mlA3.1.13 無菌吸管： 1ml（ 具有

50、 0.01ml 刻度 ） 5ml ， 10ml（具有 0.1ml 刻度）A3.1.14 玻璃刮刀或 L 型玻璃棒（涂布棒）A3.1.15 滅菌牛皮紙袋或廣口瓶，金屬勺和剪刀A3.1.16 酒精燈A3.1.17 載玻片A3.1.18 鑷子A3.1.19 接種環、接種針A3.1.20 均質器或微型振蕩箱A3.2 培養基和試劑A3.2.1 除特別注明外，試驗中所有試劑為分析純試劑，水為蒸餾水或相應程度的水，溶液 為水溶液。A3.2.2 麥康凱瓊脂培 養基 （配置方法見附錄B1）A3.2.3 血瓊脂培養基（配置方法見附錄 B2）A3.2.4 pH9.6 的肉湯培養基（配置方法見附錄 B3）A3.2.5

51、 耐鹽試驗培養基（配置方法見附錄B4）A3.2.6 40% 膽汁肉湯培 養基 （配置方法見附錄 B5）A3.2.7 糖類發酵培養基（配置方法見附錄B6）A3.2.8 硝酸鹽培 養基 （配置方法見附錄 B7）A3.2.9 索恩利氏培養基（配置方法見附錄B8）A3.2.10 革蘭氏染色液（配置方法見附錄 B9）A3.2.11 芽孢染色液（配置方法見附錄 B10）A3.2.12 乳酸紙層析法（配置方法見附錄 B11）A3.2.13 格里斯氏試劑（配置方法見附錄 B12）A3.2.14 二苯胺試劑（配置方法見附錄 B13）A3.2.15 0.85% 滅菌生理鹽水（配置方法見附錄 B14）A4 糞腸球菌

52、菌落數檢測A4.1 檢驗程序如下檢樣 用無菌生理鹽水做成幾個適當倍數稀釋液選擇 2-3 個適當稀釋度各 0.1ml ，加入富集培養基平皿36 1 培 養 24 小 時菌種鑒別檢驗菌落計數報告A4.2 操作步驟A4.2.1 采樣A4.2.1.1 采樣時必須特別注意樣品的代表性和避免采樣時的污染。首先準備好滅菌容器和 采樣工具， 如滅菌牛皮紙袋或廣口瓶，金屬勺和刀，采取有代表性的樣品， 樣品采集后應盡 快檢驗，否則應將樣品放在低溫干燥處。A4.2.1.2 以無菌操作稱取經過充分搖勻的待檢樣 25 克移入含有 225 毫升滅菌生理鹽水（按 本標準附錄 B14 規定執行）和帶玻璃珠的滅菌三角瓶內， 并

53、于振蕩器中 8000-10000 轉 /分鐘 處理 2-3 分鐘，做成 1:10 的均勻稀釋液，混合均勻。A4.2.1.3 取 1:10 稀釋液 1.0ml 加到含有 9.0ml 無菌生理鹽水和帶玻璃珠的滅菌三角瓶中， 并 于微型振蕩器中 8000-10000 轉/分鐘處理 2-3 分鐘，充分搖勻制成 1:100 的稀釋液。A4.2.1.4 用無菌吸管吸取 4.2.1.3 的稀釋液 1.0ml 加到含有 9.0ml 無菌生理鹽水的試管中， 進行 10倍梯度稀釋，并于微型振蕩器上混合 3min。每個稀釋度換用一支 1.0ml 滅菌吸管， 按上述操作程序進行 10 倍遞增稀釋直至 10-8。A4.

54、2.2 平板計數法A4.2.2.1 估計樣品的含菌量， 選擇三個連續稀釋度， 分別在作 10 倍稀釋的同時， 各取 0.1ml 分別加到計數培養基平皿，均勻涂布，各個稀釋度作3 個平皿，最好同時作 2 種培養基，同時作滅菌生理鹽水空白對照。以上操作全過程需在 20min 內完成。A4.2.2.2 將平板倒置于 36 恒溫中培養，培養 24 小時后觀察菌落特征。A4.2.2.3 選取具有 30-300 個典型或可疑糞腸球菌菌落的平板，進行計數。并計算同一稀 釋度三個平板的平均菌落數。A4.2.2.4 根據證實試驗確定為糞腸球菌的菌落數，按比例計算出該皿內的糞腸球菌的菌落 數，然后乘其稀釋倍數再乘以 10，即得每克（或 ml）樣品所含菌糞腸球菌數并作出報告。例：將檢樣 10-6 稀釋液 0.1ml 涂布于選擇富集培養基平板上，生成的可疑菌落數為 35個，取 5 個進行鑒定，證實為菌糞腸球菌菌的是4 個，則 1g 樣品中菌糞腸球菌菌數為（ 354/5 ） 10610=1.2108。A4.2.