1、兩種定量分析方法的比較及taqman探針、引物設計原則遺傳物質dna首先要把所攜帶的遺傳信息轉錄成為信使rna（mrna）,攜帶遺傳信息的mrna從細胞核進入到細胞質中與核糖體結合，在核糖體中mrna攜帶的遺傳信息被翻譯成為多肽，多肽經過進一步加工后變成蛋白質，至此遺傳物質dna完成了表達過程。期間的轉錄過程是基因表達中非常重要的調節(jié)步驟，所轉錄的mrna的多少直接影響著相關最終蛋白質的多少，所以通過對細胞內某條基因mrna含量多少的分析，就能大致判斷出該條基因的表達是否活躍。定量pcr儀是在普通pcr儀的基礎上加裝了熒光激發(fā)裝置和熒光檢測裝置，pcr擴增和檢測同時進行；在pcr反應體系中加入

2、熒光基團，利用熒光信號的積累實時監(jiān)測整個pcr進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。該技術于1996年由美國applied biosystems公司推出，由于該技術不僅實現了pcr從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)pcr相比，它具有特異性更強、有效解決pcr污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應用。定量pcr常用的三個常用概念擴增曲線、熒光閾值、ct值擴增曲線：反映pcr循環(huán)次數和熒光強度的曲線，定量pcr儀每次輪pcr擴增都會自動記錄熒光強度的變化熒光閾值：樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值，手動 設置的原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進入指數期的

3、最初階段，并且保證回歸系數大于0.99。ct值： pcr擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環(huán)次數。c(t) value 擴增曲線 閾值及ct值熒光定量pcr的數學原理理想的pcr反應：x=x0*2n非理想的pcr反應： x=x0* (1+ex)n（n：擴增反應的循環(huán)次數；x：第n次循環(huán)后的產物量；x0：初始模板量；ex：擴增效率）在擴增產物達到閾值線時: xct=x0 (1+ex)ct =m (1)xct:熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產物的量，在閾值線設定以后,它是一個常數,我們設為m方程式(1)兩邊同時取對數得:log m=log x0 (1+ex)ct (2)整

4、理方程式(2)得: log x0= - log(1+ex) *ct+ log m (3) 由此可見，log x0濃度與循環(huán)數呈線性關系，根據樣品擴增達到域值的循環(huán)數即ct值就可計算出樣品中所含的該基因的初始模板量。sample利用相對定量的方法分析目的基因的表達研究基因表達的情況，我們只需搞清楚該基因在不同生理階段的變化趨勢如何就行了，而無需知道該基因的絕對量有多少。基因表達調控研究中，由于rna純化后得率不同、rna反轉錄為cdna的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同，這就造成了品初始濃度不同而造成的差異。所謂的看家基因即內參基因，是指在各生理階段表達量恒定的基因，也稱奢侈基

5、因，該基因表達一般不隨外界的變化而變化，所以常被用作參照，常用的內參基因有gapdh基因、-actin基因，18srrna基因等。因此，在做基因表達調控分析時至少要做兩個基因，目的基因和一個看家基因。假定在1生理時期，x基因的表達量為x1；其內參基因表達量為y1；x1/y1就將1生理時期的取樣、rna提取、純化、反轉錄等過程的所有偏差均一化了；同樣在2生理時期，x2/y2就將2生理時期的取樣、rna提取、純化、反轉錄等過程的所有偏差均一化了；最后（x1/y1）/（x2/y2），所得的值就能就能較為真實的反應在1、2生理時期，x基因的變化情況。常用的相對定量方法主要有兩種，雙標準曲線法和delt

6、a-delta ct法。一、雙標準曲線法所謂的雙標準曲線法就是對內參基因和所研究的目的基因都做絕對定量，然后將各生理階段的目的基因的量和內參基因的量相除，得出一個比值；最后再將不同生理階段所得的比值相除，最終得出目的基因在不同生理階段的表達變化。公式如下：雙標準曲線法的特點：1、 考慮到了不同基因擴增效率的差異，用標準曲線來校正擴增效率，最大限度的避免了誤差；2、 思路直觀、條理清晰、應用簡便，無需像delta-delta ct法那樣對實驗進行嚴格的優(yōu)化；3、 其不足之處是每次實驗都必需對目的基因和看家基因做標準曲線；4、 該方法適合樣品量大，但是所分析目的基因較少的實驗。二、2 -ct法公式

7、如下：1、2 - ct 方法的推導 pcr 指數擴增的公式是： xn 是第 n 個循環(huán)后目標分子數；x 0 是初始目標分子數；ex 是目標分子擴增效率；n 是循環(huán)數；c t 代表目標擴增產物達到設定閾值所經歷的循環(huán)數 因此： x t 是目標分子達到設定的閾值時的分子數；c t,x 是目標分子擴增達到閾值時的循環(huán)數； kx 是一個常數；對于內參反應而言，也有同樣的公式： 用 x t 除以 r t 得到： 對于使用 taqman 探針的實時擴增而言， x t 和 r t 的值由一系列因素決定：包括探針所帶的熒光報導基團、探針序列對探針熒光特性的影響、探針的水解效率和純度以及熒光閾值的設定。因此常數

8、 k 并不一定等于 1 。 假設目標序列與內參序列擴增效率相同： 或： x n 代表經過均一化處理過的初始目標分子量； c t 表示目標基因和內標基因 c t 值的差異（ c t,x -c t,r ） 整理上式得： 最后用任一樣本 q 的 x n 除以參照因子（ calibrator ， cb ）的 x n 得到： 在這里 對于一個少于 150bp 的擴增片斷而言，如果 mg 2+ 濃度、引物都進行了適當的優(yōu)化，擴增效率接近于 1 。因此目標序列的量通過內均一化處理之后相對于參照因子而言就是： 2、方法的假設和應用 要使 c t 計算方法有效，目標序列和內參序列的擴增效率必須相等或相差小于0.

9、1。2 -ct法的特點：1、由delta-delta ct的公式可以看出，該方法直接利用看家基因來校正樣品初始量，但同時默認兩個基因擴增效率一致，而并非真實擴增情況的反映，因此實驗條件需要嚴格優(yōu)化，并且總會存一定的偏差。2、用comparative delta-delta ct法展開定量實驗前，在預實驗中，必需對目的基因和看家基因做兩組標準曲線。看兩組標準曲線的r值、擴增效率等信息，如果兩組標準曲線的斜率，即m值的差小于0.1，表明兩個基因的擴增效率已非常接近，那么后續(xù)實驗中就可以用comparative delta-delta ct法進行相對定量分析。反之，如果m差值大于0.1，就無法用該方

10、法進行相對定量分析。此時的解決方法有兩種，一是優(yōu)化實驗，使兩組標準曲線的斜率差值小于0.1，二是換用其它的相對定量方法。3、當優(yōu)化的體系已經建立后，在每次實驗中無需再對看家基因和目的基因做標準曲線，而只需對待測樣品分別進行pcr擴增即可。4、這種方法對于樣品量少，但研究的基因數目較多的實驗特別有用，因為一旦條件優(yōu)化好之后就無需再做標準曲線，節(jié)約了試劑和樣品量，實驗操作也相對簡單。taqman探針、引物設計原則與普通pcr反應相比，熒光定量pcr在反應中加入了熒光物質，用以實時顯示反應的進程，taqman探針法在普通pcr反應體系中加入了與擴增片段互補的一段帶熒光標記的核酸序列，sybrgree

11、n法加入了能與雙鏈核酸結合的熒光染料，這些熒光物質都能影響taq酶的活性進而影響pcr反應的效率。在taqman探針法中，taq酶除了5-3聚合酶作用之外，還要5-3外切酶的活性來切斷探針鏈產生熒光，普通pcr的延伸溫度為72，此溫度為taq酶聚合作用的最佳溫度；taqman探針法反應中，在要求taq酶5-3聚合酶活性的同時，還需要taq酶5-3外切酶的活性來切斷探針鏈產生熒光，taq酶5-3外切酶活性的最佳溫度為60，所以taqman pcr反應的一般采用兩步法，即95變性，60復性延伸。與普通pcr反應相比，taqman探針法pcr反應效率有所降低或對pcr產物擴增長度、mg2+濃度等其他

12、條件更加敏感。 理想的實時擴增曲線 不同擴增效率的差異對于taqman探針法來說，引物及探針的設計必須圍繞著保證pcr反應的最大效率這一中心，這樣才能保證各個樣品間反應效率的一致性，才能最大限度的減少誤差。探針設計原則：1、 先選擇好探針，然后設計引物使其盡可能的靠近探針；2、 探針長度應在15-45bp（最好是20-30bp)，以保證結合特異性；3、 檢測探針的dna折疊和二級結構；盡量避開二級結構；3、 tm值在65-70，通常比引物tm值高5-10（至少要5），以確保在退火過程中探針先于引物與目的片段結合，gc含量在40%70%；4、 探針的5端應避免使用g鳥嘌呤因為5g會有淬滅作用，而且即使是被切割下來還會存在淬滅作用；5、 整條探針中，堿基c的含量要明顯高于g的含量g含量高會降低反應效率，這時就應選擇配對的另一條鏈作為探針；6、 為確保引物探針的特異性，最好將設計好的序列在blast中核實一次，如果發(fā)現有非特異性互補區(qū)，建議重新設計引物探針。引物設計原則：1、 序列選取應在基因的保守區(qū)段；2、 避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對，避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結構；3、 典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低