1、重組 DNA 技術(shù)的一般流程 目的目的DNADNA的獲得的獲得 目的目的DNADNA與載體的連接與載體的連接 重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞 重組子的篩選和鑒定重組子的篩選和鑒定 實(shí)驗(yàn)一:pEGFP-NGF質(zhì)粒載體的構(gòu)建 nNGF 基因的克隆(T-A克隆) NGF-sense: a GAGCTC aagatgctgtgcctcaagccagt NGF-antisense: at GGGCCC gtctagatcc agagtgtctg 5 56 6 pEGFP 熒光質(zhì)粒表達(dá)載體 質(zhì)粒DNA的酶切反應(yīng)結(jié)果 質(zhì)粒質(zhì)粒 M M 酶切反應(yīng)酶切反應(yīng) M M 酶切反應(yīng)酶切反應(yīng) pEGFP pT-NG

2、F 酶切產(chǎn)物凝膠回收操作步驟 （Gel Extraction Kit） 仔細(xì)切下含DNA的凝膠，置一稱重的1.5ml離心管中。稱重。 按300lS1溶液/100mg凝膠加入的比例加入S1溶液，置50水浴10分鐘， 使凝膠完全溶化，每2分鐘顛倒混勻一次。 將溶化后的凝膠溶液移入吸附柱，置收集管中，9000g30秒，倒掉收集 管中的液體，再將吸附柱放入同一收集管中。 在吸附柱中加入500l W1溶液，9000g15秒，倒掉收集管中的液體，再 將吸附柱放入同一收集管中。重復(fù)一次洗柱。 將吸附柱放入同一收集管中。9000g1分鐘。 將吸附柱放入一新1.5ml離心管中，在吸附膜中央加入30lddH2O，

3、靜置1 分鐘，9000g1分鐘。備用。 重組子的篩選 n耐藥性基因 外源質(zhì)粒賦予宿主抗生素抗性 n藍(lán)白斑篩選（互補(bǔ)現(xiàn)象） lacZ plasmid 和 M15 cell strain 關(guān)于連接酶 定義：定義：ATP存在下，在存在下，在3OH和和5 P之間形成磷酸二酯之間形成磷酸二酯 鍵。鍵。 特性：連接粘端的效率遠(yuǎn)高于平端。特性：連接粘端的效率遠(yuǎn)高于平端。 策略：策略： 1.首選不匹配粘端首選不匹配粘端 2.次選匹配粘端，載體脫磷次選匹配粘端，載體脫磷 3.平端連接，延長(zhǎng)時(shí)間，提高酶量平端連接，延長(zhǎng)時(shí)間，提高酶量 平端連接圖示 匹配粘端連接圖示 不匹配粘端連接圖示 連接反應(yīng)的建立 連接反應(yīng)的溫

4、度：連接反應(yīng)的溫度： v 粘性末端，按A-T，G-C含量計(jì)算，5。 v 如 Pst I（CTGCAG，12 ），EcoRI（GAATTC，8）。 v 平末端，如EcoR（GATATC），可在室溫進(jìn)行，不超過30， 酶的用量要比粘性末端加大10-100倍 。 DNA量：量： v 摩爾數(shù)之比 載體:目的 DNA 1 : ( 13 ) 載體摩爾數(shù) 目標(biāo)基因片段堿基數(shù)載體重量 目標(biāo)DNA摩爾數(shù) 目標(biāo)基因片段重量載體堿基數(shù) 載體和目標(biāo)基因的連接反應(yīng) 如未定量可以按回收效率75計(jì)算DNA濃度，按載體與 目的基因摩爾數(shù)比1:3進(jìn)行連接。 連接反應(yīng)在滅菌的0.5ml離心管中進(jìn)行。15 l體積反 應(yīng)體系中： 加

5、ddH2O使終體積為 15 l Liner vector 50-100 ng Target gene fragment 15- 30 ng 10Ligase Buffer (已含有ATP) 1.5 l T4 DNA Ligase 1.O l 輕輕混勻，稍加離心, 14-16或4,O/N 。 重組子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞 體外重組的體外重組的DNADNA引入受體細(xì)胞引入受體細(xì)胞 感受態(tài)感受態(tài): :受體細(xì)胞處于易于接受外源受體細(xì)胞處于易于接受外源 DNA DNA 的狀態(tài)的狀態(tài) 原理原理: :（1 1）遺傳物質(zhì)的傳遞）遺傳物質(zhì)的傳遞 （2 2）受體菌的選擇與改造）受體菌的選擇與改造 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 重組子的鑒定 n插入片段長(zhǎng)度大小鑒定插入片段長(zhǎng)度大小鑒定 質(zhì)粒抽提、酶切；PCR n插入片段方向性鑒定插入片段方向性鑒定 可以選擇基因內(nèi)部切點(diǎn)進(jìn)行不對(duì)稱酶切 nDNADNA序列測(cè)定序列測(cè)定