1、細(xì)胞 CDK2/CYCLIN A 激酶活性熒光共振能量轉(zhuǎn)移法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書(中文版)主要用途細(xì)胞 CDK2/CYCLIN A 激酶活性熒光共振能量轉(zhuǎn)移法( FRET )定量檢測試劑是一種旨在通過熒光探針 EDANS 供體和 DABCYL 受體雙重標(biāo)記的多肽底物，在 CDK2/CYCLIN E 抑制劑的存在下，受到 CDK2/CYCLIN A 的磷酸化后，不能被位點特異性氨基肽酶切離，而發(fā)生熒光峰值的降低，即采用熒光共 振能量轉(zhuǎn)移法來測定樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其 適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品 (動物、 人體)、部分或完全純化酶樣品中 C

2、DK2/CYCLIN A 激酶的特異活 性定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，安全可靠。技術(shù)背景細(xì)胞周期素依賴性激酶 2(cyclin dependent kinase 2 ；CDK2 ；EC 2.7.11.22)，又稱為細(xì)胞分裂周期蛋白 1(cell division cycle1 ； CDC1 )或 p33，屬于絲氨酸 /蘇氨酸激酶( serine/threonine protein kinase)家屬成員之一。 其與酵母細(xì)胞的 cdc28和cdc2高度進(jìn)化保留。細(xì)胞周期素依賴性激酶2的催化亞體，與細(xì)胞周期素 E然后 A結(jié)合，允許細(xì)胞由 G1期進(jìn)

3、入 DNA 合成期， 達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、 DNA 復(fù)制、 細(xì)胞分裂等。 p21Cip1 (CDKN1A ) and p27Kip1 ( CDKN1B )是CDK2激酶的抑制劑。 CDK2/CYCLIN A 激酶的磷酸化目標(biāo)序列為 HHASPRK 。 基于磷酸化多肽具有抗氨基肽酶切離的功能，通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(Fluorescence resonance energytransfer；FRET )，即傳遞激發(fā)狀態(tài)的能量由處于較短波長的供體 (donor)到覆蓋供體波長的受體 (acceptor)， 使得距離依賴性反應(yīng)的供體的散發(fā)光子淬滅(quench)，使用2個熒光探針 EDANS供體和DA

4、BCYL 受體作為FRET對，來標(biāo)記的 CDK2 多肽底物的兩端，在氨基肽酶( aminopeptidase)的作用下，釋放出強烈熒光的 EDANS ；一旦在 CDK2/CYCLIN E 抑制劑二氨基吡唑 -1氫4-基偶氮酚【 4-(3,5-diamino-1 H-pyrazol-4-ylazo ) -phenol】的存在下，底物受到 CDK2/CYCLIN A 的磷酸化(由 ATP的-磷酸根到多肽上單一絲氨酸殘基分子 上)，底物將不能被位點特異性氨基肽酶切離，而無法釋放出EDANS ，由此根據(jù)產(chǎn)物熒光強度(激發(fā)波長340nm，散發(fā)波長 490nm)的降低，來定量測定細(xì)胞周期素依賴性激酶2/細(xì)

5、胞周期素 A 的特異活性。CDK2/CYCLIN A 反應(yīng)系統(tǒng)為：CDK2/CYCLIN ADABCYL - HHASPRK - EDANS+ ATP DABCYL -HHApSPRK - EDANSaminopeptidaseaminopeptidase DABCYL - HHA + SPRK - EDANS60 毫升10 毫升1.5 毫升50 微升DABCYL -HHApSPRK - EDANS DABCYL -HHApSPRK - EDANSDABCYL - HHASPRK - EDANS產(chǎn)品內(nèi)容清理液( Reagent A) 裂解液( Reagent B) 緩沖液( Reagent C

6、) 底物液( Reagent D)500微升500微升500微升10 微升50 微升(另購)1份反應(yīng)液( Reagent E) 酶解液( Reagent F) 終止液( Reagent G) 標(biāo)準(zhǔn)液( Reagent H)磷酸化底物液( Reagent I) 產(chǎn)品說明書保存方式 保存 清理液( Reagent A)和 裂解液( Reagent B)在 4冰箱里，其余的保存在 20冰箱里； 底物液 ( Reagent D)和 標(biāo)準(zhǔn)液( Reagent H)避免光照，有效保證 6 月用戶自備CDK2/CYCLIN A 激酶：用于抑制劑篩選磷酸化底物液( Reagent I)：用于測定樣品磷酸化程度

7、的反應(yīng)試劑1.5 毫升離心管：用于標(biāo)準(zhǔn)樣品操作和樣品保存的容器15 毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器 細(xì)胞刮脫棒：用于貼壁細(xì)胞脫離 (微型)臺式離心機：用于細(xì)胞預(yù)處理 黑色酶標(biāo)板：用于反應(yīng)和比色的容器 熒光酶標(biāo)儀：用于熒光分析實驗步驟實驗開始前，將 20冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。一、樣品準(zhǔn)備1 準(zhǔn)備好 25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或 60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細(xì)胞( 1至 5 X 106細(xì)胞)2 小心加入 3 毫升 清理液( Reagent A)，覆蓋生長表面3 小心抽去清理液4 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞(注意： 避免使用胰酶消化 )5 加入 3 毫升 清理液( Reagen

8、t A)，混勻細(xì)胞6 移入到預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管(注意： 懸浮細(xì)胞從這一步驟開始 )7 放進(jìn) 4臺式離心機離心 5 分鐘，速度為 300g8 小心抽去上清液9 加入 500 微升 裂解液( Reagent B)，充分混勻10轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的 1.5 毫升離心管11強力渦旋震蕩 15 秒12置于冰槽里孵育 30 分鐘13放進(jìn) 4微型臺式離心機離心 5 分鐘，速度為 16000g(或 13000RPM ，例如 eppendorf 5415) 14小心移取 500 微升上清液到新的預(yù)冷的 1.5 毫升離心管15移取 10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測(注意： 建議使用 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試

9、劑盒 HL30030.1 )16即刻放進(jìn) 70保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作測定準(zhǔn)備1 準(zhǔn)備好待測樣品(例如細(xì)胞萃取液或純化酶樣品等) ，置于冰槽里2 設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀(溫度為 25)：激發(fā)波長 360nm，散發(fā)波長 490nm ，并置零3 準(zhǔn)備好 5 個1.5 毫升離心管，標(biāo)記為 1至 5號管4 加入 98微升 緩沖液( Reagent C)到 1號管5 分別加入 50 微升 緩沖液( Reagent C)到 2 至 5 號管6 移取 2 微升 標(biāo)準(zhǔn)液( Reagent H) 到 1 號管，混勻7 小心移取 50 微升 1 號管稀釋的 標(biāo)準(zhǔn)液( Reagent H)到 2 號管，混勻8 小心移

10、取 50 微升 2 號管稀釋的 標(biāo)準(zhǔn)液( Reagent H)到 3 號管，混勻9 小心移取 50 微升 3 號管稀釋的 標(biāo)準(zhǔn)液( Reagent H)到 4 號管，混勻10將 1 至 5 號管放進(jìn)冰槽里備用；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表管號緩沖液( Reagent C )標(biāo)準(zhǔn)液( Reagent H)標(biāo)準(zhǔn) EDANS 濃度198 微升2 微升5 微摩爾 / 升250 微升50微升 1 號管2.5微摩爾 /升350 微升50 微升 2 號管1.25 微摩爾 / 升450 微升50 微升 3 號管0.625 微摩爾 /升550 微升00三、熒光測定(一)活性測定1 在 96 孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：標(biāo)準(zhǔn)樣品

11、和待測樣品2 分別移取 20 微升 緩沖液( Reagent C) 到相應(yīng)孔中3 分別加入 2 微升 底物液( Reagent D)4 分別加入 20 微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液或待測樣品( 20 微克純化酶或 100 微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白) (注 意： 樣品須清澈)5 分別加入 20 微升 反應(yīng)液( Reagent E)6 輕輕搖動 96 孔酶標(biāo)板 30 秒7 在室溫下孵育 60 分鐘8 分別加入 20 微升 酶解液( Reagent F)9 輕輕搖動 96 孔酶標(biāo)板 30 秒10在室溫下孵育 30 分鐘11分別加入 20 微升 終止液( Reagent G)12即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測：獲得相對

12、熒光讀數(shù)RFU ( Relative Fluorescence Unit)13活性計算：1) 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)( Y 軸)為相對熒光單位 RFU ；橫座標(biāo)( X 軸)為標(biāo)準(zhǔn) EDAN 濃度(微 摩爾 /升)2) 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中所釋放的 EDAN 濃度3) 實際活性計算：樣品 EDAN 濃度（微摩爾 /升）X 樣品稀釋倍數(shù) 1（小時；反應(yīng)時間） 納摩爾 EDAN/毫升/小時（樣 品蛋白濃度）毫克 /毫升納摩爾 EDAN/ 毫克 /小時（二）活性抑制測定（抑制劑篩選）1 在 96 孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景、零抑制、完全抑制和待測抑制劑樣品2 按下表加入試劑內(nèi)容物樣本背景零抑制對照（

13、0抑制）完全抑制對照（100抑制）待測抑制活性緩沖液（ ReagentC）17 微升20 微升40 微升15 微升底物液（ ReagentD）2微升2 微升2 微升待測抑制劑5 微升5 微升用戶自備的純化酶20 微升20 微升20 微升20 微升反應(yīng)液（ Reagent E）20 微升20 微升20 微升96 孔板每孔總量背景孔（62 微升）零抑制孔（62 微升）完全抑制孔 （62 微升）待測抑制劑樣品（62 微升）3 輕輕搖動 96 孔酶標(biāo)板 30 秒4 在室溫下孵育 60 分鐘5 分別加入 20 微升 酶解液（ Reagent F）6 輕輕搖動 96 孔酶標(biāo)板 30 秒7 在室溫下孵育 3

14、0 分鐘8 分別加入 20 微升 終止液（ Reagent G）9 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測：獲得相對熒光讀數(shù)RFU （ Relative Fluorescence Unit）10抑制活性計算：1）（完全抑制讀數(shù)零抑制讀數(shù)）（抑制劑樣品讀數(shù)樣本背景讀數(shù)） （完全抑制讀數(shù)零抑制讀數(shù)）實際抑制百分率2）IC50： 50抑制率所需的抑制劑濃度 X（所需抑制劑濃度）（已知抑制劑樣品濃度實際抑制百分率） X 503）直接構(gòu)建抑制曲線：縱座標(biāo)（ Y 軸）為相對熒光單位 RFU ；橫座標(biāo)（ X 軸）為已知抑制劑濃度（三）磷酸化百分率測定1 在 96 孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景、零磷酸化、完全磷酸化和待測樣品

15、2 按下表加入試劑內(nèi)容物樣本背景完全磷酸化對照（100磷酸化）零磷酸化對照（0磷酸化）待測樣品磷酸化緩沖液（ ReagentC）22 微升40 微升40 微升20 微升底物液（ ReagentD）2 微升2 微升樣品液20 微升20 微升磷酸化多肽2微升反應(yīng)液（ Reagent E）20 微升20 微升20 微升20 微升96 孔板每孔總量背景孔（62 微升）完全磷酸化孔（62 微升）零磷酸化孔 （62 微升）待測樣品（62 微升）3 輕輕搖動 96 孔酶標(biāo)板 30 秒4 在室溫下孵育 60 分鐘5 分別加入 20 微升 酶解液（ Reagent F）6 輕輕搖動 96 孔酶標(biāo)板 30 秒7

16、在室溫下孵育 30 分鐘8 分別加入 20 微升 終止液（ Reagent G）9 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測：獲得相對熒光讀數(shù)RFU （ Relative Fluorescence Unit）10磷酸化百分率計算：（完全磷酸化讀數(shù)零磷酸化讀數(shù)）（樣品讀數(shù)樣本背景讀數(shù)） （完全磷酸化讀數(shù)零磷酸化讀數(shù)）樣品磷酸化百分率注意事項1 本產(chǎn)品為 25 次操作，包括標(biāo)準(zhǔn)液2 操作時，須戴手套3 系統(tǒng)操作過程中，標(biāo)準(zhǔn)液測定只需 1 次4 樣品須澄清，至關(guān)重要5 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測定6 熒光濾波器可以使用激發(fā)波長在 34030nm，散發(fā)波長 49030nm7 待測樣本為粗提酶樣品， 其蛋白濃度為 20微克/20 微升；待測樣本為細(xì)胞裂解懸液， 其蛋白濃度為 100 微克/20 微升（本公司